Retroductal submandibular בלוטת החדרה ונקודות מופרדות הקרנה במודל עכברים של הרוק hypofunction

Introduction

הרס בטחונות של רקמות בריאות חשבונות במשך מספר תופעות לוואי מזיקות של טיפולים בסרטן. חלק או שלם של בלוטות הרוק הגדולות שעומדות עם שדות הקרינה נהרס באופן בלתי נמנע. לכן, רוב החולים שעברו הקרנות לחולי סרטן הראש והצוואר, לימפומה צוואר הרחם, או קרינה גוף מלא לפני השתלת מח עצם סובלים אחת מתופעות הלוואי הנפוצות ביותר ומתמשך של קרינה, בלוטת הרוק hypofunction ^2-6.

תאי acinar מייצר הנוזל של בלוטות הרוק הם רגישים לקרינה. פגיעה בבלוטות הרוק גורמת פוחתת דרסטי של זרימת רוק, מצב המכונה hypofunction רוק כמו. ההפחתה הכרונית בזרימת רוק פוגעת בפעילות אוראלית מפתח כגון לעיסה, בליעה, דיבור, וטעם, אך מהתוצאות החולניות של כאבים עזים, דמעות ריריות, בליעה, זיהומים אופורטוניסטיים, ועששת שיניים מחמירההחולה של רווחה ^2,3 לתפקד.

מאז אובדן תא הרוק הקשורים הקרנות הוא בלתי הפיך, אין טיפול מתקנת של יובש בפה. טיפול שוטף המתמקד להרגיע סימפטומים עם תחליפי רוק מלאכותיים וסמי prosecretory אינו יעיל להקלה ארוך טווח ^6. למרות ששיטות משלוח קרינת שיפור לסייע בהפחתת חומרת המצב, רעילות רקמות בריאות וסיבוכיה להישאר גורם מגביל בטיפול בסרטן ^6,7. צעדים מנעו כדי למנוע סיבוכים הקשורים הקרנות הם, אם כן, הופכים לנורמה. רדיו-מגן סוכני scavenge מיני חמצן רדיקלים חופשיים, ואכלוס תא אומנת, או להגביר תיקון DNA הם נבדקים כדי למנוע hypofunction רוק ^8-11.

הפרשות של בלוטות הרוק אקסוקרינית לנקז לתוך הפה דרך צינורות ההפרשה העיקרית. cannulation פנים הפה של הצינוריות דואר הפרשה להזרקה של חומר ניגוד נעשתה דרך שגרה כמו הליך אשפוז. ניצול בגישה דומה, בלוטות רוק יכולות להיות ממוקדות ישירות לטיפול מקומי ^12. מלבד הפחתת הסיכון של תופעות לוואי מערכתיות, החדרת בלוטת retroductal הוסיפה הטבות. ההסדר בשכבה של תאי רוק סביב עץ ductal מאפשר מיקוד של כל תאי אפיתל הרוק, ואת אנקפסולציה סיב המעשים בלוטת כמחסום להפחית התפשטות טיפולית רצויה. בעיקרו של דבר, בלוטות רוק מתאימות באופן אופטימלי לטיפול ממוקד של תחלואים בלוטה כגון hypofunction רוק-induced קרינה.

קרינה קונבנציונלית לטיפול בסרטן מועברת במנות קטנות (1.8 - 2.5 Gy / שבריר / יום, חמישה ימים בשבוע) לתקופה של שבועות. לכן, טיפולי רדיו-מגן שמראים יעיל נגד תכנית קרינה ממושכת במודלים ניסיוניים יש השלכה קלינית יותר. Comproפונקצית רוק mised לאחר קרינה מופרדת נרשמה חיות קטנות, אבל מקור קרינה, במינון קטן, ופרוטוקולים בם נעשו שימוש הם ^9,10,13 מגוונות.

דו"ח זה מקובע שיטות למסירת retroductal כדי וקרינה מקומית של בלוטות submandibular עכברוש באמצעות מקור קרינה חולה-רלוונטי שבריר מנה.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי בריאות LSU, Shreveport, טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש היו בהתאם להנחיות NIH לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.

1. Cannulation של בלוטות הרוק עכברוש submandibular

1. הכנת מזרק-Tubing האסיפה
   1. חותכים באורך 10 ס"מ של צינורות פוליאתילן PE10 עם אזמל. החזק את שני הקצוות של הצינור בין האצבע המורה לאגודל. מחממים את החלק האמצעי של הצינור מעל להבה עדינה, בעדינות למתוח את צינורות מרוככת להכפיל אורכו על ידי משיכת שני הצדדים.
   2. חותך את הצינורות באמצע עם אזמל בזווית של 45 ^o לקבל cannulae 2 - כל אחד עם לקצה חד. הרחב את הקצה שאינו מחודד של הצינורית ידי הולם אותו על מחט 29 G של מזרק אינסולין 0.5 סמ"ק.
   3. הסר את הצינורית, ולצייר 220 μl של תמיסת מלח לתוך המזרק. הקש כדי לסלק בועות אוויר. התאימו את cannulעל המחט, לדחוף את הבוכנה במזרק כדי לפלוט את האוויר ולהבטיח זרימה חופשית של פתרון באמצעות צינורית. כוון את עוצמת הקול עד 200 μl.
2. Intra-Oral Cannulation של submandibular בלוטת Duct
   הערה: חיטוי מכשירים לפני ההליך, לעקר ב-בין ההליכים מעקרים חרוז חם.
   1. לשקול את העכברוש ספראג Dawley, ולחלק את נפח מחושב של קטמין (42 מ"ג / ק"ג) / xylazine (8 מ"ג / ק"ג) / acepromazine (1.4 מ"ג / ק"ג) לערבב בתוך מזרק.
   2. לרסן את החיה ידי אחיזה בבסיס הזנב בין האצבע המורה ואת האגודל של יד אחת זזה מצד שני על הגוף לקלוט את זה. הנח את האצבע והאמה לאורך צידי הראש בזמן להחזיק את הגוף עם האגודל האצבעות הנותרות.
   3. להזריק את חומר ההרדמה בשרירי הגפיים האחוריים. אשר עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן רפלקס palpebral. החל סיכת עין כדי למנוע בעוד יובשחיה היא בהרדמה.
   4. מניח את החיה על פלטפורמה-ומעוצבת (איור 1), ולעסוק הוא שן החותך העליון בסרגל הרוחבי. משוך את הלסת התחתונה על ידי looping גומייה סביב התחתונות ועיגון אותו הרציף.
   5. לעבור תפר סטרילי דרך הלשון והרם אותו להעלות את רצפת הפה. הצמד את התפרים עם hemostat, ולהעביר מעל המשקוף הרוחבי.
   6. הרחב את הלחיים עם מפזר לחי שהותקן (איור 1), ותחת מיקרוסקופ לנתח לאתר את הגבשושיות תת הלשוניות על רצפת הפה.
   7. אחוז לקצה החד של הצינורות מתבצעים PE10 באמצעות מלקחיים עדינים. בעדינות לתפעל את הקצה של הצינורית לתוך פתח ductal על הגבשושיות תת הלשוניות. אשר מיקום של הצינורית ידי שחלה זה 3 - 5 מ"מ לתוך הצינור; לוודא שהוא עובר ללא כל מכשול.
3. Submandibular בלוטת חינוך קדםllation
   1. להזריק אטרופין (0.5 מ"ג / ק"ג) תת עורי בתוך בעורפו, ולהמתין 10 דקות עבור הפחתה בהפרשות הרוק.
   2. אבטח את הצינורית אל פתח צינור עם טיפת cyanoacrylate (דבק), ולאפשר לו להתייבש. להנחיל הפתרון בבלוטה (200 μl / הבלוטה) על ידי בוכנת לחיצה על המזרק לאט בקצב של ~ 50 μl / min.
   3. מרסק את הצינורות עם hemostat, ובזהירות להסיר את המזרק. שמור את הצינורות בצינור עבור 30 - 60 דקות עד שהחיה להכרתו. הסר תפר שמחזיק את הלשון.
   4. מעבירים את החיה לכלוב נפרד, ולהשתמש מנורת חום כדי לשמור אותו חם במהלך ההתאוששות. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו לשמור recumbence sternal.
   5. אחרי החיה היא אמבולטורי מלא, לשכן אותו בבית הביבר עם גישה חופשית למזון ומים.

2. בהתאמה לשפת הקרנה מופרדתשל בלוטות submandibular

1. לרסן את החיה כפי שתואר קודם לכן, להרדים עם הממשל תוך שרירית של קטמין (33 מ"ג / ק"ג) / xylazine (6 מ"ג / ק"ג) / acepromazine (1 מ"ג / ק"ג) תערובת של הגפיים האחוריות. אשר עומק ההרדמה, ולהחיל סיכה לעיניים.
2. מניחים את פרקדן חיה על השולחן מאיץ ליניארי, ולהרחיב הצוואר שלה על ידי הטיית הראש. Collimate בתחום הקרינה (רוחב חריץ 3 סנטימטרים) כדי להקיף את האזור מהגבול התחתון של הלסת התחתונה לחלק העליון של עצם החזה.
3. מניחים בולוס 1 ס"מ שווה-רקמה על האזור, ולהתאים את המרחק בין מקור קרינה העליון של בולוס ל -100 ס"מ.
4. מקרינים את החיה (2.5 Gy) באמצעות קרן פוטונים 6 MV של מאיץ ליניארי. מנת שיעור, גודל שדה, ומרחק ממקור קרינת בולוס משטח יכתיב את זמן החשיפה. ב הנוכחי להגדיר, חיות הוקרנו בשיעור מנה של ~ 1 Gy / min.
5. חזור על חשיפה; 2.5 Gy / יום עבור סכום כולל של 8ימים; 4 ימים / שבוע עם מרווח 2 ימים שביניהם. שמור על חמי החיה במהלך התאוששות. מעבירים את החיה כדי ביבר אחרי זה אמבולטורי מלא.
6. אסוף רוק הבלוטה submandibular מגורה 8 שבועות לאחר קרינה כדי למדוד את תפקוד בלוטת ^14. להרדים בעלי חיים תחת הרדמה על ידי זלוף הלב של pH בופר paraformaldehyde קר 4% / פוספט 7.2. לעקור בלוטות submandibular עבור היסטולוגית ו immunohistochemical מנתח ^14.

Representative Results

התאמת טכניקת sialography פולשנית, טיפול המקומי של בלוטות רוק גדולות אינו ריאלי. ממשל Retroductal בבלוטות רוק עכברוש submandibular נוסה על ידי cannulation פנים פה של הצינוריות של וורטון (איור 2). צינוריות הרוק של וורטון הפתוחות על הגבשושיות תת-לשוניים ממוקמות על רצפת הפה, אבל הפתחים אינן גלויות בקלות. החדרת הצינורית הייתה, אם כן, נעשתה על ידי חיטוט עדין. כדי למנוע דימום לא נעים או ניקוב צינור, שום כוח ששימש בעת הצבת הצינורית. מעבר התנגדות ללא חלקות של הצינורית בצינור אושר על ידי חזרה עדינות ושוב תנועה של הצינור.

Cannulation במהלך ניסויים ראשוניים אושר על ידי יציקת הבלוטה עם hematoxylin או פתרון trypan הכחול, והערכת מכתים בלוטה בחיות מורדמות (איור 3). Glנפח ולמלא הוברר על ידי הדמית ההכתמה של עץ ductal בבלוטות משורש. עבור בעלי חיים במשקל 150 - 250 גרם, מילוי מלא של הבלוטה הושג עם 200 - 250 μl של פתרון. עירוי ראפיד יכול להגביר את לחץ הבלוטה להגביר את הסיכון לפציעה biospread. כדי למנוע הרס רקמות, הפתרון היה מנוהל בהדרגה בשיעור של ~ 50 μl / min

בלוטות submandibular עכברוש ניתנים להשוואה בלוטות הפרוטיד ברגישות שלהם לקרינה ^15. בלוטות submandibular נחקרו כי הם יכולים להיות מוקרנים באופן סלקטיבי מבלי שייגרם השפעות חוץ-היעד חמורים (איור 4). חוסך של חלל הפה ואת נפח גדול של בלוטות הפרוטיד למזער את ההשפעה של דלקת בפה ו יובש בפה חריפה על בריאותם של חיות התוצאה הניסיונית. המחקרים הקודמים שלנו בחולדות בוצעו עם מינונים יחידים, גבוהים של קרינת ^11,16, אבל frac מינון tionated הוא יותר רלוונטי בקליניקה. באזור הצוואר של בעל החיים, ולכן, חשוף מדי יום במנות קטנות של קרינה. כדי להשיג הצטברות אחידה של מינון הקרינה בתוך בלוטות submandibular הממוקם ליד פני העור, בולוס רקמות רכות-שווה עשוי ג'ל הומוגנית עם צפיפות של סמ"ק 1.03 g / הונחה על הצוואר בזמן הקרנות.

השפעת תכנית קרינה מופרדת על זרימת רוק כפי שנקבע ב -8 שבועות לאחר הקרינה מראה כי חשיפה יומיומית במרווחים של 2.5 Gy מופחתת זרימת רוק בתלילות. ירידה של פי 10 ליד בתפוקת רוק נרשמה חיות מוקרנות בניגוד לבעלי חיים שאינם מוקרן (מבחן T- של סטודנטי 2-צדדיים, p <0.01; איור 5) ^14. התוצאות אישרו הקמת hypofunction הרוק-induced קרינה בחיות.

ge = "1">
איור 1. בניית פלטפורמה אישית ו-פיזור לחי. חוט נוקשה 4 מ"מ היתה מכופפת מלבן 3-צדדית (11 ס"מ גובה X 13 ס"מ רוחב) כמוצג, והבר רוחבי היה מורכן במרכז. קצות חוט היו כפופות לתוך לולאות, וברגים הועברו דרכם כדי לחזק את מערך ללוח פלסטיק (25 ס"מ אורך x 15 ס"מ רוחב x 0.8 ס"מ עומק). בורג מרכזי הוכנס אחורי סנטימטר 5 הרכבת התיל. הוא שימש כדי לעגן את הגומייה כי פתחה את הלסת התחתונה הבלעה:. מנהג בנוי הלחי-מפזר עשוי מכופף חוט עבה הפנויה 1 מ"מ "U לעצב" עם קצוות מתרחבים. וצינור פלסטיק הועברו על קצות החוט כדי למנוע נזק רירית buccal. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

: לשמור-together.within-page = "1">
איור 2. Cannulation של עכברוש submandibular בלוטת טרמינל צינוריות. הלשון היא העלתה לרומם את רצפת הפה, ואת cannulae פוליאתילן הוחדרו לתוך פתחי צינור submandibular הממוקם על רצפת הפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3. עירוי של פתרון Hematoxylin ב בלוטת submandibular כדי לאשר את הטכניקה. מכתים בלוטה מעיד על הממשל המוצלח של הפתרון בבלוטת submandibular. שים לב בלוטת sublingual בפינה השמאלית העליונה אינה מוכתמת. בלוטת שליטה הלא חדורים מוצגת בצד השמאל.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. מיקום של בעלי חיים עבור הקרנה. החיה הוא הניח פרקדן על שולחן מאיץ ליניארי, וראש שכותרתו חזרה להאריך את הצוואר. רוחב החריץ collimated היה 3 ס"מ. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אפקט איור 5. של קרינה מופרד על תפקוד בלוטת submandibular. מלוח הוחדר בבלוטות submandibular לפני הקרינה. הצוואר של החיה היה מוקרן שברים של 2.5 Gy / יום במשך 8 ימים. את DATהמוצגים הם ממוצע ± SEM של קצב זרימת הרוק submandibular מגורה 8 שבועות לאחר השלמת תוכנית קרינה. הדמות לשכפל באישור זכויות יוצרים מטיפול האדם ג'ין, מרי אן ליברט, מו"ל Inc. ^15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

בלוטות רוק לעתים קרובות לקבל מינון קרינה מעבר לסף של התאוששות רקמה בחולים עובר טיפול הקרנות לסרטן צוואר הראש, אבלציה בחירה של בלוטות צוואר, או ממאירויות המטולוגיות אזוריות. למרות תאי acinar מפריש נוזל של הבלוטה הם מובחנים סופנים, הם באופן פרדוקסלי רגישים לקרינה. פונקצית הפרשת טיפות בתוך השבועות הראשונים של קרינה, ותוצאות ניזק בלתי הפיכות בלוטות פלט רוק תחתון כרוני. כדי להתמודד עם תפקוד בלוטת עניים יובש הפה הזה מתפתח, שימור או שיקום של תפקוד הפרשה הוא קריטי. טיפולים חדשניים כדי להגן מפני או לתקן את הנזק קרינה נחקרות ^{1, 8-11, 16-20.}

ממשל מערכתי של טיפולים נושא את הסיכון הגלום של תופעות לוואי ברקמות הלא ממוקד. משלוח מכוון אל בלוטות הרוק פוחת סיכון זה. ריפוי גנטי Retroductal הוא יעיל במניעת או¹ remedying נגע בלוטת הרוק קשור ^{קרינה, 9-, 11, 16,17,20.} עם זאת, תוך שימוש באותה טכניקה, בלוטות הרוק ניתן גם reengineered להביע ומפרישים חלבונים, ectopically. ניצול מסלול הפרשה האנדוקרינית basolateral בתאי רוק, ביטוי transgene ואת הפרשת הורמון לדם יכולים להיות מושגת ^21. החדרת גנים לשם בלוטות רוק, יכולה אם כן, תוארך ביעילות התיקון להפרעות אנדוקריניות מסוימות.

למרות cannulation של צינוריות הרוק בלוטה חיות קטנות יכול להיות מסובך, בפועל היא מרכזית השחזה הטכניקה. לקצה החד של cannulae יכול שריטה בקלות במהלך החדרה, ולעשות עירוי קשה. הגברת חזרה בלחץ תוך גירוש הפתרון צריך להזהיר מראש של עיקול בצינור, לבין ההכרח מחדש cannulate צינור. וריאציות אנטומיות כגון פתח צינור סוטה או tortuosity צינור גדל, יחד עם פתולוגיות מגבילי פהפתיחה כמו צְבִיתַת הַלְסָתוֹת או סיסטיק submucous יכול לעשות משלוח בלוטת submandibular אתגר. עירוי של צבע impermeant בעת תרגול הטכניקה יכולה להיות אינדיקציה שימושית משלוח מדויק. מיקום נכון של cannulae עירוי עדין, ללא התנגדות הם גורמים חשובים להצלחת ההליך.

חולי סרטן מטופלים לעתים קרובות עם פוטוני megavoltage שנוצרו על ידי מאיץ ליניארי. קרינה מחולקת מדי בוקר במנות קטנות יותר במהלך שבועות. חלוקה מנה מעניק תקופות של התאוששות בין קרינה להפחית רעילות על בתאים בריאים לרגש גידולים. מאוד קורות אנרגיה חודרות של מאיץ ליניארי שימושיות לטיפול בגידולים עמוקים. וגם, לטיפול בגידולים קרובים יותר לעור, בולוס שווה-רקמות משמש כדי להפחית את עומק חדירת פוטון. בדומה בקליניקה, מאיץ ליניארי נמסר קרינה מופרד יכול לשמש מקומית להקרין submaבלוטות ndibular של חיות קטנות. עם זאת, העמדה של בלוטות מיד מתחת לעור מחייבת את המיקום של בולוס להשיג> מינון קרינה 90% בתוך בלוטות. העובי של בולוס מחושב בהתאם האנרגיה של פוטונים ואת העומק הרצוי של חדירה לרקמות.

במאמר זה, אנו מספקים הנחיות ניסיון לביצוע החדרת בלוטת submandibular retroductal הקרנת מופרדים מקומית של בלוטות submandibular חולדה. תקוותנו היא כי השיטות הדגישו תסייענה התקנה ניסיונית החוקר להעז לתחום radiotoxicity בלוטת רוק.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intramedic Polyethylene tubing (PE10)	Becton Dickson	427401
1/2 cc Insulin Syringe U-100	Becton Dickson	309306
Artificial Tears	Miller Vet Supply	5098-9840-64
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Perma-Hand silk suture	Ethicon	K833H
Graefe forcep	Fine Science Tools	11051-10
Olympus SZX16 Stereo Microscope	Hunt Optics and Imaging
6 MV Linear Accelerator	Elekta
Bolus - Skinless	Civco	MTCB410
Heat Lamp	Braintree Scientific	HL-1 110V