הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק
Summary
At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.
Abstract
ויזואליזציה של אירועי איתות דינמיים בתאים חיים כבר אתגר. הרחבנו מערכת ביטוי חולף הוקמה, השלמה פלורסנט biomolecular (BiFC) assay בתאים אפידרמיס טבק, מאינטראקציה בין חלבונים בדיקות ניטור הפריסה המרחבית של הולכת אותות בתאי הצמח. בפרוטוקול זה, השתמשנו assay BiFC להראות כי האינטראקציה ואת האיתות בין יודה ארבידופסיס MAPKKK ו MAPK6 להתרחש קרום הפלזמה. כאשר בזל חלבון פיגום היה שיתוף הביע, האינטראקציה יודה-MAPK מחדש ושיתוף מקוטב מרחבית עם CFP-בזל. מערכת ביטוי טבק מהונדס זה מאפשרת בדיקה מהירה של איתות שינויי לוקליזציה ודינמית (פחות מ -4 ימים) והוא יכול להכיל מספר רב של צבעי חלבון פלואורסצנטי (לפחות שלוש). גם הצגנו שיטות מפורטות לכמת הפצת חלבון (לוקליזציה מרחבית סימטרית, או "קיטוב";) בתאי טבק. יש מערכת ביטוי טבק מתקדמת זו יש פוטנציאל להיות בשימוש נרחב לבדיקה מהירה של אירועי איתות דינמיים בתאי צמח חיים.
Introduction
חלבוני אינטראקציה בתוך מתחמי רשת טופס היררכיים מסובכים כי לשחק תפקיד מרכזי כמעט כל תהליכים ביולוגיים המתרחשים בסביבת הסלולר צפויה. עם זאת, מן התפתחות צמח לתגובות צמיחה, חל חוסר כלים נוחים שיכול לא רק במהירות אלא גם ביעילות לזהות ולנטר איתות אירועים אלה דינמיים ברמת subcellular.
מערכת ביטוי חלבון החולפת באפידרמיס עלה טבק מושכת יתרונות המאפשר הדמית חלבוני ניאון בתאים חיים. מערכת זו מספקת למחצה בתנאי vivo המאפשרים שלאחר translational שינוי חלבון ובדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון. על ידי בחינת אות YFP השלימה את השלמת פלורסנט bimolecular (BiFC) assay מודיע האפשרות של אינטראקציה בין חלבונים בתאי צמח. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל, שמרים ושתיים היברידיים (Y2H) ושיתוף-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC גם מספק אמצעי רב עוצמה של ביטוי חזותי תאים שבו אינטראקציות בין חלבונים עלולה להתרחש ברמה subcellular.
בגלל חלוקת התא סימטרית (ACD) שומרת גזע אוכלוסיית תאים תוך יצירת סוגי תאים חדשים לייצור רקמות / איברים, זה מנגנון הכרחי לקידום רב-תאיות איקריוטיים. פיתוח הפיוניות ארבידופסיס נוצל בעבר כמערכת מודל לחקר ACD בצמחים. התא המבשר, התא האם meristemoid, מהחלק סימטרי לייצר שני לתאי בת אחרים, meristemoid (עובר גזע חטיבות דמויי תאים לפני הסיום לתוך זוג התאים שומרים) ו תא קרקע השושלת הפיוניות (SLGC) (עשוי להתחלק להתמיין תא מדרכה), בהתאמה (איור 1). בשנת הפיוניות ACD, שבירת חלבון הרומן של אסימטריה בשושלת הפיוניות (בזל) מקוטבת premitotically לנהוג סימטריות חלוקות, אשר incאסימטריה גופנית lude ואסימטריה תא גורל 1. אשד MAPK המורכב של תודה MAPKKK ואת MAPKs, MPK3 ו -6 הנו מכשיר מרכזי דפוסי חלוקת הפיוניות ואימוץ גורל 2,3, 4,5.
לאחרונה, ג'אנג et al. קשר בין בזל חלבון קוטביות אל מסלול איתות Yda-MAPK ארבידופסיס הפיוניות 6 ACD. מסלול יודה-MAPK הקנונית, דרך MPK3 / 6, phosphorylates בזל ומפעיל הקיטוב שלו. פונקציות בזל פוספורילציה כמו פיגום ומגייסת יודה (Yda) ו MPK3 / 6 להקים קומפלקס חלבון ולרכז את איתות לעבר התא בקליפת 6. קיטוב של רכיבים MAPK ואת לולאת המשוב החיובי בין בזל ואת מסלול Yda-MAPK מייצג מנגנון חדשני עבור קיטוב חלבון בתאי הצמח. מקומית איתות MAPK מועשרת שאמורות להיות קשורים קשר הדוק בידול גורל תא ב הפיוניות ACD 6 (איור 1). אחד kנתוני הניסוי EY שתמכו מודל זה בא מן מבחני טבק המצביעים על חלוקה מחדש של המרחב MAPKs המושרה על ידי ביטוי של בזל 6.
באופן כללי, זה לא קל לעקוב אחר המקום שבו איתות MAPK מתרחשת משום מולקולות MAPK ולרוב מצאו מקום בתוך התא. במחקר זה, השתמשנו במערכת מפוצלת YFP לדמיין את האינטראקציה בין קינאז במעלה או במורד הזרם אלה להציע שבו ממסר איתות מתרחשת. בנוסף, אנו הרחבנו את השימוש במערכת BiFC ידי להביע שיתוף חלבון שלישי (CFP-tagged) עם זוג פיצול YFP (המרמז על אינטראקציה בין חלבונים) כדי לחזות האם וכיצד YFP השלים יכול להיות מווסת מרחבית על ידי השיתוף הביע חלבון CFP. בעשותם כך, הראינו כי שיתוף ביטוי של CFP-בזל המושרה מחדש המרחבי של אינטראקציות בין Yda ו MPK6, מן חלוקה שווה דפוסים מקוטב על קליפת התא של טבק epidermתאי al. מערכת זו ולכן יש פוטנציאל להתפתח לניטור אירועים איתות דינמי בתאי הצמח בתנאים כאשר תאים מאותגרים על ידי גירויים פנימיים או חיצוניים (כגון שיתוף ביטוי של חלבונים אחרים, יישום כימי, התקפה הפתוגן או שינויים סביבתיים, וכו '. ).
Protocol
Representative Results
Discussion
כללי גלישה ו שינויים אפשריים של מערכת הביטוי החולפת טבק התמר אות: התבטאות יתר של חלבון פלואורסצנטי (FP) -tagged חלבונים באפידרמיס הטבק שמש בהצלחה לבדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון subcellular בתאי צמח. עם זאת, לומד הפצת איתות דינמית של מורכבות חלבון planta הוא נושא מאת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.
Materials
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25x75mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24×50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40 x objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO , NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
