Summary
Die elektrophysiologische Technik der intrazellulären Aufnahme wird gezeigt, und verwendet, um spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen in der Verbindung Auge eines Schmetterlings bestimmen.
Abstract
Intrazellulärer Aufnahme ist eine leistungsfähige Technik verwendet, um zu bestimmen, wie eine einzelne Zelle auf einen gegebenen Reiz reagieren. In einer Vision Forschung, hat die intrazelluläre Aufnahme war in der Vergangenheit eine übliche Technik zu studieren Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen auf verschiedene Lichtreize verwendet, die noch heute verwendet wird. Es bleibt jedoch ein Mangel an detaillierten Methodik in der Literatur für die Forscher die intrazelluläre Aufnahme Experimente im Auge zu replizieren wollen. Hier präsentieren wir das Insekt als Modell für die Untersuchung Augenphysiologie allgemeiner. Insekten Sehzellen sind in der Nähe der Oberfläche des Auges angeordnet und sind daher leicht zu erreichen, und viele der Mechanismen in der Vision beteiligt sind, über Tierphyla konserviert. Wir beschreiben das grundlegende Verfahren für in vivo intrazelluläre Aufnahme von Sehzellen im Auge eines Schmetterlings, mit dem Ziel, diese Technik für Forscher mit wenig Erfahrung in electrophysiology. Wir stellen die Grundausstattung benötigt, wie ein Live-Schmetterling zur Vorbereitung der Aufnahme, wie ein Glas-Mikroelektrode in eine einzelne Zelle einfügen, und schließlich die Aufnahmeverfahren selbst. Wir erklären auch die grundlegende Analyse der rohen Reaktionsdaten für die spektrale Empfindlichkeit der einzelnen Zelltypen zu bestimmen. Obwohl unser Protokoll über die Bestimmung spektraler Empfindlichkeit konzentriert, andere Reize (zB polarisiertes Licht) und Variationen des Verfahrens sind zu diesem Setup anwendbar.
Introduction
Die elektrischen Eigenschaften von Zellen, wie Neuronen werden durch Messen Ionenfluss durch die Zellmembranen als Änderung der Spannung oder des Stroms beobachtet. Eine Vielzahl von elektrophysiologischen Techniken entwickelt worden bioelektrischen Ereignisse in Zellen zu messen. Neurone in den Augen von Tieren zugänglich sind und ihre Schaltungsanordnung ist oft weniger komplex als im Gehirn, diese Zellen gute Kandidaten für eine elektrophysiologische Untersuchung zu machen. Gängige Anwendungen von Elektro im Auge umfassen Elektroretinogramm (ERG) 1,2 und Mikroelektroden intrazelluläre Aufnahme. ERG beinhaltet in oder auf dem Auge eines Tieres eine Elektrode platziert, ein Lichtreiz Anwendung und Messung der Änderung der Spannung als Summe der Antworten aller Zellen in der Nähe 3-6. Wenn man bei der Charakterisierung von spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen speziell interessiert ist, oft mehrere Zelltypen gleichzeitig an verschiedenen Stärken auf einen bestimmten Reiz reagieren; somitschwierig sein kann, die Empfindlichkeiten von spezifischen Zelltypen aus ERG-Daten zu bestimmen, insbesondere dann, wenn verschiedene Arten von spektral ähnlichen Sehzellen im Auge sind. Eine mögliche Lösung ist transgene Drosophila mit dem Photorezeptor (Opsin) Gen von Interesse in den meisten R1-6 Zellen im Auge ausgedrückt zu schaffen und führen Sie dann ERG 7. Mögliche Nachteile dieser Methode sind nicht zu niedrig Expression des Proteins Photorezeptor 8, und die lange Zeitrahmen für die Erzeugung und das Screening von transgenen Tieren. Für Augen mit weniger Arten von spektral unterschiedlichen Photorezeptoren, die Anpassung des Auges mit farbigen Filter können mit Absenken der Beitrag einiger Zelltypen zu dem ERG, wodurch Schätzung der spektralen Empfindlichkeitsmaxima 9 helfen.
Die intrazelluläre Aufnahme ist eine weitere Technik, wo eine feine Elektrode, die eine Zelle und ein Stimulus spießt angewendet wird. Die Elektrodenaufzeichnungen nur, dass indivIdual Zelle Antwort , so dass von der Aufnahme und mehreren einzelnen Zellen 10-14 spezifischen Empfindlichkeiten von physiologisch unterschiedlichen Zelltypen zu analysieren ergeben. Obwohl unser Protokoll auf der Analyse der spektralen Empfindlichkeit konzentriert, sind die grundlegenden Prinzipien der intrazellulären Aufnahme mit scharfen Elektroden für andere Anwendungen modifizierbar. Mit einer anderen Vorbereitung einer Probe, zum Beispiel, und mit scharfen Quarzelektroden kann man aus tiefer in den optischen Loben oder anderen Regionen im Gehirn, die sich an der Frage abhängig gefragt. Zum Beispiel Antwortzeiten einzelner Sehzellen 15, Zell - Aktivität in den optischen Loben 16 (Lamina, Medulla oder Lobula 17), Gehirn 18 oder andere Ganglien 19 kann auch mit ähnlichen Techniken aufgezeichnet werden, oder Farbreize mit Polarisation ersetzt werden könnte 20 -22 oder Bewegungsreize 23,24.
Phototransduktion, das Verfahren, mit dem LichtEnergie absorbiert und in ein elektrochemisches Signal, ist ein altes Merkmal gemeinsam fast alle heutigen Tierstämme 25. Die visuelle Pigment gefunden in Sehzellen und verantwortlich für Phototransduktion Einleitung ist Rhodopsin. Rhodopsine in allen Tieren sind aus einem Opsin - Protein, einem Mitglied der 7 transmembranen G - Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie und ein zugehöriges Chromophor hergestellt , das aus der Netzhaut oder ein ähnliches Molekül 26,27 ableitet. Opsin Aminosäuresequenz und chromophore Struktur beeinflussen die Absorption von auf verschiedene Wellenlängen von Licht Rhodopsin. Wenn ein Photon durch den Chromophor absorbiert wird das Rhodopsin aktiviert wird, einen G-Protein - Kaskade in der Zelle initiiert, die an der Öffnung der membrangebundenen Ionenkanäle 28 schließlich führt. Anders als die meisten Neuronen unterziehen Sehzellen abgestufter Potentialänderungen, die Lichtreizes als relative Änderung der Reaktionsamplitude mit wechselnden gemessen werden kann. Typischerweise eine gegebenePhotorezeptortyp drückt nur ein Opsin - Gen (obwohl Ausnahmen existieren 8,10,29-31). Anspruchsvolle Farbsehen, wie sie in vielen Wirbeltieren und Gliederfüßern gefunden wird, wird mit einem komplexen Auge von Hunderten oder Tausenden von Sehzellen erreicht jeweils ein oder gelegentlich mehr Rhodopsin Arten ausdrücken. Visuelle Information wird durch den Vergleich Antworten, die über dem Fotoaufnehmer Mosaik über komplexe nachgeschalteten neuronalen Signalisierung im Auge und Gehirn erfasst, was in der Wahrnehmung eines Bildes komplett mit Farbe und Bewegung.
die rohen Antworten eines Sehzellen auf unterschiedliche Wellenlängen des Lichts über die intrazelluläre Aufnahme Nach der Messung ist es möglich, seine spektrale Empfindlichkeit zu berechnen. Diese Berechnung basiert auf dem Prinzip der Univariance, die besagt , dass eine Reaktion der Photorezeptorzelle auf der Zahl der Photonen abhängig ist, aber nicht auf die besonderen Eigenschaften der Photonen absorbiert es 32 absorbiert. Jedes Photon, das abso istrbed von Rhodopsin wird die gleiche Art von Reaktion induzieren. In der Praxis bedeutet dies , dass eine rohe Reaktionsamplitude der Zelle entweder aufgrund einer Erhöhung der Lichtintensität (mehr Photonen zu absorbieren) zu erhöhen, oder zu einer Verschiebung der Wellenlänge in Richtung auf seine maximale Empfindlichkeit (höhere Wahrscheinlichkeit von Rhodopsin , dass die Wellenlänge absorbieren). Wir nutzen dieses Prinzip in Bezug zellulären Reaktionen bei bekannter Intensität und der gleichen Wellenlänge zu Reaktionen bei unterschiedlichen Wellenlängen und der gleichen Intensität, aber unbekannten relative Empfindlichkeit. Zelltypen werden oft von der Wellenlänge, bei der ihre Empfindlichkeit Peaks identifiziert.
Hier zeigen wir eine Methode für die intrazelluläre Aufnahme und Analyse der spektralen Empfindlichkeit von Photorezeptoren im Auge eines Schmetterlings, mit einem Fokus auf machen diese Methode besser zugänglich zu der weiteren Forschung. Obwohl die intrazelluläre Aufnahme in der Literatur häufig bleibt, vor allem in Bezug auf das Farbsehen bei Insekten, haben wir gefunden, that Beschreibungen der Materialien und Verfahren sind in der Regel zu kurz für die Wiedergabe der Technik zu ermöglichen. Wir präsentieren diese Methode im Video-Format mit dem Ziel, die leichter Replikation ermöglicht. Wir beschreiben auch die Technik leicht erhältlich und preisgünstige Ausrüstung. Wir wenden uns an gemeinsamen Vorbehalte, die oft nicht gemeldet werden, die Forschung verlangsamen, wenn eine neue und komplexe Technik zu optimieren.
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Protocol
Alle Tiere wurden so human wie möglich behandelt. Die Insekten wurden als Puppen aus Costa Rica Entomologischen Versorgung, Costa Rica verschifft.
1. Heliconius Pupae Pflege
- Hang alle pupae beabstandet 2-3 cm voneinander entfernt in einer befeuchteten Kammer unter Verwendung von Insektenstifte.
- Nach dem Schlüpfen, erlauben Flügel Schmetterlinge in einer befeuchteten Kammer mindestens 1 Tag am Leben zu trocknen dann halten für und füttern täglich eine verdünnte Lösung Honig vor der Aufnahme.
- Verdünnen Honig mit Wasser auf etwa 20% Honiglösung nach Volumen, und gießen Sie in eine flache Petrischale.
- Bringen Sie einzelne Schmetterlinge auf der Petrischale, eins nach dem anderen. Bei der Lösung mit ihren vorderen tarsi zu berühren, werden die Schmetterlinge automatisch ihre Rüssel verlängern und trinken aus der Petrischale. Wenn ihr Rüssel nicht automatisch verlängert wird, sollte Zange die Rüssel herauszuziehen und es in die Honiglösung einzuführen.
2. Optische Spur, Kalibrierung und Mes-ement of Experimental Lichtbedingungen
- Legen Sie eine 150 W Xenon-Bogenlampe mit Gehäuse und Universal-Netzteil und einem angeschlossenen Kondensator Linsenanordnung an einem Ende einer Tabelle mindestens einen Meter lang helles weißes Licht liefern.
ACHTUNG: Xenonbogenlampen erzeugen extrem helles Licht mit einer starken UV-Intensitäten. Schutzbrillen sollten zu jeder Zeit getragen werden und sollte die Lampe vom Hersteller als gerichtet verwendet werden Ansammlung von Ozon durch die Wechselwirkung von UV-Licht mit Luftsauerstoff zu verhindern. - Stellen Sie eine optische Spur einen Meter in der Länge für das austretende Licht der Gehäuseanordnung zu passieren durch (Abbildung 1).
- In der folgenden Reihenfolge auf der optischen Spur mit ungefähren Abständen: 1) ein konvexer Siliciumdioxid oder Quarzlinse 40 cm von dem Kondensor Baugruppe, 2) ein neutrales Dichtefilter Rad (ohne Filter derzeit im Lichtweg) 22 cm weiter entlang die Spur, 3) eine Blende mit Antriebseinheit 14 cm von der ND-Filters, 4) eine konkave Siliciumdioxid oder Quarzlinse unmittelbar benachbart nach dem Verschluss und 5) eine kollimierende Strahlsonde 6 cm weiter entlang dem entfernten Ende der Spur.
- Affix eine 600 & mgr; m Durchmesser Glasfaserkabel an die kollimierenden Strahlsonde.
Hinweis: Je nach Lichtintensität, eine 5-10 mm Durchmesser Glasfaserkabel erforderlich sein kann, genug Licht, um andere Preps zu liefern und kann für diese ersetzt werden. - Stellen Sie den Abstand, Höhe und Winkel jedes optischen Elements, so dass der Lichtstrahl austritt, die Montage an der höchsten Intensität möglich ist.
- Als optische Spurelemente mit verschiedenen Anwendungen unterscheiden sich geringfügig können, stellen Sie sicher, dass alle Elemente Licht im UV-A- und sichtbaren Bereich (315-700 nm) übertragen.
- Sobald die optische Spur zusammengesetzt ist, messen das Licht, das das Setup durchläuft unter Verwendung eines Spektrometers. Kalibrieren Sie das Spektrometer zunächst eine Kalibrierung Lampe mit einem bekannten Spektrum mit und der Software des Herstellers.
Hinweis: Wir beschreiben die Produkte von Ocean Optics für Klarheit mit eingerichtet , jedoch unter anderer Hersteller (zB Avantes) verkaufen vergleichbare Produkte.- Schalten Sie die Wolfram Kalibrierlampe mindestens 45 Minuten vor der Messung.
- So kalibrieren, schließen Sie das Spektrometer über USB an einen Computer mit der dazugehörigen Software installiert ist. Dann schließen Sie das Spektrometer an der Wolfram Kalibrierlampe über einen UV-sichtbaren Sende Kosinuskorrektor.
- Wählen Sie "Neu Absolute Einstrahlungsmessung" von der Registerkarte "Datei", und wählen Sie das Spektrometer als "Quelle".
- Folgen Sie den Anweisungen, um eine neue Kalibrierung "cal" Datei zu erstellen. Wenn Sie gefragt werden, legen Sie die zur Verfügung gestellten Daten-Datei für das bekannte Spektrum der Lampe Wolfram Kalibrierung im Bereich des sichtbaren Lichts (300-800 nm) in die Software, die automatisch das korrigierte Spektrum des Spektrometers Ausgabe berechnet.
- Speichern Sie die Kalibrierungsdatei. Laden Sie diese Datei, wenn initializing die Software für alle zukünftigen Messungen von Lichtspektren das Spektrometer.
- Sobald das Spektrometer kalibriert ist, verwenden diese die Lichtspektren aus dem Versuchsaufbau aufzunehmen. Jenseits, wenn die Software geöffnet wird, wählen Sie "Neu Absolute Einstrahlungsmessung" und laden Sie die zuvor gespeicherte Kalibrierungsdatei. Nehmen Sie als nächstes ein Dunkelspektrum durch das gesamte Licht zum Spektrometer zu blockieren.
- Mit dem Spektrometer zur Zeit die gewünschten experimentellen Lichtbedingungen zu messen, stellen Sie die Integrationszeit (4 ms), Scans zu mitteln (5) und Boxcar Breite (5), so wird das Spektrum richtig skaliert und geglättet. Halten Sie die Einstellungen die gleichen für alle spektralen Messungen, so dass die Lichtintensitäten von verschiedenen Messungen verglichen werden können.
- Messung der Spektren für ungedämpft weißes Licht, für alle neutralen Dichtefilter während der Experimente verwendet werden, und für jede Bandpaß - Interferenzfilter (Abbildung 2).
- Measure des Weißlichtspektrums ohne Filter in dem Lichtweg durch das freie Ende des Glasfaserkabels von dem Schritt 2.2.2 zum Spektrometer zu befestigen. Mit der Kalibrierungsdatei aus Schritt geladen 2.3, speichern Sie die weiße Lichtspektrum mit der Software des Spektrometers als Textdatei.
Hinweis: Spectra gespeichert als Textdateien, die Wellenlängenliste (x-Koordinaten) in einer Spalte und der Intensität des Lichts (y-Koordinaten) in der zweiten Spalte, so daß die Daten in eine Tabelle für Schritt 2.6 geladen werden kann. - Mit dem gleichen Setup wie in Schritt 2.5.1, notieren Sie das Spektrum von jeder optischen Dichte (OD) (0-3,5 OD) während der Experimente, die von der Neutraldichte Drehfilter (ND) Rad in der optischen Spur, und speichern Sie die Textdatei für jeder OD.
- Mit dem gleichen Setup wie in Schritt 2.5.1, legen Sie die 10-nm-Interferenz halbe Bandbreite eins nach dem anderen in den Lichtweg filtert und das Spektrum für jeden Filter beobachtet aufzeichnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede der 41 verschiedenen Interferenzfiltern with peak Lässigkeiten beabstandet alle 10 nm von 300 bis 700 nm. Filter weiter voneinander entfernt (20 nm) sind akzeptabel für die meisten Anwendungen (für Spektren, siehe Abbildung 2).
- Measure des Weißlichtspektrums ohne Filter in dem Lichtweg durch das freie Ende des Glasfaserkabels von dem Schritt 2.2.2 zum Spektrometer zu befestigen. Mit der Kalibrierungsdatei aus Schritt geladen 2.3, speichern Sie die weiße Lichtspektrum mit der Software des Spektrometers als Textdatei.
- Korrekte für Unterschiede in der Intensität von Licht, wenn Interferenzfilter im Lichtweg platziert. Jedes Interferenzfilter ermöglicht eine unterschiedliche Anzahl an Photonen zu passieren, und die geringe Übertragung einiger Filter macht es schwierig Intensität weiter zu dämpfen, so daß alle Filter die gleiche Anzahl von Photonen ermöglichen.
- Um die relative Intensität (I) für jede 10 nm Bandbreite Interferenzfilter zu berechnen, lösen für I in dem Ausdruck I = T / sec, wobei T die Fläche unter der Spektralkurve jede 10 nm Interferenzfilter (von 2.5.3) und s ist die maximale absolute Bestrahlungsstärke (y - Wert der gespeicherten Textdatei von 2.5.1) von weißem Licht bei der Spitzenwellenlänge jedes Filters (Abbildung 2 für ein Beispiel bei 520 nm) Vgl.
- Teilen Sie alle berechneten Intensities vom max Intensitätswert in 2.6.1 berechnet ein und nehmen die Reziproke der relativen normierten Werte für die Verwendung als Korrekturfaktor auf die Roh-Empfindlichkeit bei jeder Wellenlänge (siehe Schritt 6.4) angewendet zu normieren.
- Führen Sie die Schritte 2.1 bis 2.6 nur einmal vor einer Reihe von Experimenten. Im Laufe eines Experiments in regelmäßigen Abständen die absolute Bestrahlungsstärke der Xenon-Bogenlampe unter hellem Licht und Neutraldichtefilter, notieren Sie die Intensität des Lichtreiz, um sicherzustellen, ändert sich nicht.
- Im Verlauf eines Experiments, wenn eine zelluläre Antwort auf Licht, das durch den Interferenzfilter übertragen die maximale Antwortamplitude nähert, verwenden, um die ND-Filter, das Signal zu dämpfen. Wenn ND-Filter bei einem Experiment verwendet werden, entfällt die entsprechende Abnahme der Intensität bei der Berechnung der spektralen Empfindlichkeit.
- Richten Sie optische Spur, Kalibrierung und Filter Tage oder Wochen vor Experimenten beginnen. Halten Sie Filterabgedeckt Staubansammlung zu verhindern.
3. Aufnahmegerät einrichten
- Führen Sie das gleiche Glasfaserkabel für die Kalibrierung durch einen Faraday - Käfig verwendet und Montage auf einem goniometrisches Gerät wie ein Kardan Armumfang (siehe Abbildung 3 für Diagramm). Das Kabel wird etwa 10 cm vom Auge weg von der Probe sein.
- Legen Sie eine Metallstufe auf einem schwingungs isoliert Tabelle mit einem Elektrodenhalter montiert direkt über der Bühne unter der Kontrolle eines Mikromanipulator (Abbildung 4). Legen Sie den Arm Kardan so dass der Kopf des Probe in der Mitte der Kugel ist durch den Arm des Drehbewegung erzeugt.
- Verwendung eines intrazellulären Vorverstärker-System, das einen Verstärker wird (außerhalb des Faraday-Käfig) und Vorverstärker (heads, in der Nähe der prep innerhalb des Faraday-Käfig) montieren heads über der Metall Stadium, in dem die Probe platziert umfasst.
- Schließen Sie ein Koaxialkabel an die heads über einBNC-Anschluss. Split offen nur die Spitze am anderen Ende des Koaxial-Kabels und trennen den äußeren Metallmantel des Kabels aus dem inneren Draht.
- Löten Sie die äußere Hülle (auf Massepotential gehalten) mit einem Ende eines isolierten Kupferdraht mit einer Krokodilklemme am anderen Ende. Dieser Krokodilklemme wird an der Metallreferenzelektrode auf der Probenplattform (Schritt 5.1.4) befestigen.
- Löten Sie den inneren Draht des Koaxialkabels zu einem dünnen Silberdraht, wie der Aufzeichnungselektrode zu dienen. Dieser Draht sollte dünn genug sein, um in die Lösung gefüllte Glaselektrode in Schritt 5.2.3 zugeführt werden.
- Legen Sie ein Stereomikroskop an einem Schwenkarm und Basis auf der Holzbank außerhalb des Faraday-Käfig, so dass er geschwenkt werden kann in der Elektrode in das Auge zu senken und schwang wieder heraus, sobald die Elektrode im Auge ist.
- Stellen Sie sicher, alles Metall im Inneren der Faraday-Käfig ordnungsgemäß geerdet ist.
- Außerhalb des Faradayschen Käfigs, befestigen Sie den preamplifer ist mit dem Eingang eines 50-60 Hz Rauschverminderers (optional), und verbinden Sie den Ausgang an einen Kanal eines Oszilloskops über einen BNC-T-Adapter verwenden.
- Mit dem anderen Ende des T-Adapter, schließen Sie das Signal durch das Oszilloskop an einen Kanal der Hardware übergeben. Befestigen diese Hardware an einen Computer durch ein USB-Kabel, das Antworten mit dem Vorverstärker aufgezeichnet erlauben wird, von der Software auf dem Computer gelesen werden.
- Bringen Sie den Verschluss-Treiber von der optischen Spur auf den zweiten Kanal des Oszilloskops ein anderes T-Adapter und schließen Sie diese an einen Impulsgenerator, der die Frequenz und die Dauer der Lichtblitze kontrollieren wird für das Auge geliefert (Schritt 5.5).
Hinweis: Setup des Rigs selbst sollte nur einmal durchgeführt werden müssen. Brechen Sie hier, bis sie bereit Aufnahmen zu beginnen.
4. Vorbereitung auf den Tag der Aufnahme
- Schalten Sie die Xenon-Lampe mindestens 45 Minuten vor dem Experiment und schalten Sie den Glasmikroelektroden-Abzieher mindestens 30 Minuten vor dem pulling Glaselektroden.
- Schalten Sie alle Aufzeichnungsgeräte (Shutter, Verstärker, Schalldämpfer, Impulsgenerator, Oszilloskop und Datenerfassungshardware) und stellen Sie sicher, dass der Verschluss standardmäßig geschlossen wird, so dass keine Licht durch das Glasfaserkabel.
- Ziehen feinen Borosilikat (oder Aluminiumsilikat) Glasmikroelektroden (100-250 MOhm Widerstand ist ideal) mit einer Glasmikroelektroden-Abzieher. Verwenden Glaselektroden innerhalb von nur wenigen Stunden von gezogen.
- Verfüllung der Elektroden mit 3 M Kaliumchlorid (KCl). Beachten Sie, dass diese Lösung entsprechend modifiziert werden , um die Bedürfnisse der Forscher, zum Beispiel Injektion färben.
5. Specimen Prep und Aufnahmeverfahren
- Bereiten Sie die Probe
- Affix eine individuelle Schmetterling in einem kleinen Plastikbehälter mit heißem Wachs so der Kopf von einem Ende des Rohres unbeweglich und vorstehende ist. Wax nach unten Rüssel, Antennen und Flügel (Abbildung 5).
- Halten Sie ter mit einem trockenen Stück Wachs Bauch und das Rohr, indem ein nasses Gewebe im Inneren des Rohres hinter dem Bauch befeuchtete halten. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig unbeweglich ist.
- Montieren Sie das Rohr ein kleines Stück Wachs auf eine kleine Plattform mit einem Kugelgelenk mit, die zu einer magnetischen Basis befestigt ist.
- Unter einem Binokular, legen Sie eine Silberdraht von 0,125 mm Durchmesser in den Kopf über die Mundwerkzeuge als Referenzelektrode verwendet werden. Vor dem Versuch, den Draht fixieren dauerhaft an der Plattform in der Weise, dass der Kupferdraht in Schritt 3.3.2 es aufstecken kann, sobald die Plattform, auf die Bühne zur Aufnahme platziert ist.
- Sobald die Referenzelektrode in einer geeigneten Position ist, kann es durch schnelles Schmelzen und anschließendes Abkühlen Wachs um den Draht an Ort und Stelle gehalten werden.
- eine zerbrechliche Kohlenstoffstahl Rasierklinge, Griffteil des Messers mit einem Messerhalter verwenden und ein kleines Stück abbrechen zum Schneiden der Hornhaut zu verwenden.
- Schneiden Sie ein kleines Loch (~ 10 ommatidiein im Durchmesser) in der linken Hornhaut mit der Rasierklinge und versiegeln Sie das Loch mit Vaseline Austrocknungs zu verhindern.
- Sobald die Hornhaut geschnitten wird, legen Sie die Aufzeichnungselektrode in das Auge so schnell wie möglich, weil Hämolymphe im Auge schnell aushärtet und machen es unmöglich, eine Elektrode einzufügen. Wenn möglich, die Zerlegung in die Anlage durchführen, wo die Aufnahme stattfinden wird.
Hinweis: Vaseline sollte nicht auf den Rest des Auges verschmiert werden, da dies die Optik defokussieren.- Wenn nicht bereits auf der Bühne, legen Sie die montierte Probe und die Plattform auf die Bühne in der Aufnahme rig. Schließen Sie den headsErdungsDraht aus Schritt 3.3.2 an die Referenzelektrode auf der Probenplattform mit Krokodilklemmen.
Hinweis: Wenn möglich, einen roten Filter verwenden, um das Tier zu beleuchten. - Verwenden Sie eine Lichtquelle mit Schwanenhals-Anhänge kurz auf die Probe unter einem Stereoskop Licht, während die Aufzeichnungselektrode in das Auge zu senken.
- Imsert das auf die heads aus Schritt 3.3.3 in die KCl-Lösung in der Rückseite eines Glasmikroelektrode verbunden Silberdraht. Montieren Sie die Glaselektrode auf dem Elektrodenhalter.
- Stellen Sie den Elektrodenhalter, so dass die Mikroelektroden direkt über dem Loch ist zuvor in der Hornhaut geschnitten, etwa einen Millimeter über der Hornhaut. Senken die Mikroelektrode in das Auge unter Verwendung des Mikromanipulators, bis eine Schaltung vervollständigt ist, wie durch eine große Änderung im Potential (mV) auf dem Oszilloskop dargestellt.
- Wenn nicht bereits auf der Bühne, legen Sie die montierte Probe und die Plattform auf die Bühne in der Aufnahme rig. Schließen Sie den headsErdungsDraht aus Schritt 3.3.2 an die Referenzelektrode auf der Probenplattform mit Krokodilklemmen.
- Einmal im Auge, schwingen die Stereoskop außerhalb des Faraday'schen Käfigs, und schalten Sie die Lichtquelle Beleuchtung der Probe ab. Der Raum sollte dunkel gehalten werden, so dass das Auge dunkel angepasst wird.
- Den Widerstand der Elektrode durch einen 1 nA Strom, der von dem Verstärker Anwendung und der Feststellung der Spannungsänderung. Der Widerstand sollte im Bereich zwischen 100 bis 250 M & Omega; typischerweise. Höhere Widerstände sind kennzeichnend für Verstopfung oder Verbiegen der Elektrode und niedrige Widerstände von elektrOde Bruch.
- Aktivieren Sie den Pulsgenerator so öffnet sich der Verschluss einen Lichtblitz mit einer 50 ms Dauer so dass alle 0,5 Sekunden, und lassen Sie es zu blinken für die Dauer des Experiments fortzusetzen.
- Stellen Sie den Impulsgenerator, so dass es Blitze von bis zu 50 ms Dauer ermöglicht. Diese Dauer und 0,5 Sekunden Pause zwischen den Blitzen hält die Probe so nah dunkel wie möglich während des Experiments angepasst. Fünfzig ms liegt in der Nähe der kürzeste Blitzdauer, die die gleiche Amplitude in Reaktion als mehr Abbrennzeiten entlocken wird.
- Re-measure Antworten sowohl am Anfang und am Ende des Experiments (Schritt 5.16). Im Laufe von etwa 20 Minuten ein Experiment diese Blitzeinstellungen nicht verschlechtern die Reaktion über die Zeit. Verschiedene Preps können Anpassungen an diese Flash-Einstellungen erforderlich.
- Positionieren der Cardan Arm, so daß die Lichtwellenleiter in Richtung auf das Auge gerichtet.
- Überprüfen Sie das Oszilloskop für Spannungsänderung mit jedem Lichtblitz.Eine negative Änderung der Spannung bedeutet, dass die Elektrode eine Zelle noch nicht eingetreten ist.
- Bewegen Sie den Cardan Arm um die Probe, bis er in einem Winkel zu dem Auge positioniert ist, an dem es eine maximale Spannungsantwort ist.
- Drehen Sie den Mikromanipulator hin und her, so dass sehr kleine vertikale Bewegungen der Elektrode in beide Richtungen, während leicht die Basis des Elektrodenhalter tippen oder die Buzz-Funktion auf dem Vorverstärker verwenden. Weiter machen kleine Anpassungen , bis eine depolarisierende Lichtverhalten auf dem Oszilloskop angezeigt (Abbildung 6).
- Stellen Sie die Kardan-Arm wieder um den Einfallswinkel zu finden, wo ein Lichtblitz die größte depolarisierende Signal erzeugt. Bilden kleine Anpassungen mit dem Mikromanipulator und verwenden, um die Summen-Funktion auf den Verstärker wie erforderlich um sicherzustellen, dass die Elektrode stabil in die Zelle aufnimmt und daß es in der Zelle für das gesamte Experiment bleiben wird (siehe Schritt 5.11).
- Sobald das Setup stabil ist, beginnen Recording. Eine stabile Aufzeichnung sollte geringem Hintergrundrauschen und einen gleichbleibend großen depolarisierenden Reaktion wenig in Ruhe zu keiner Veränderung Potential (mindestens 10: 1-Signal-Rausch-Verhältnis).
- Führen Sie die Software auf dem Computer, und beginnen ein "neues Experiment", das ein Pop-up-Fenster mit vier Kanälen geöffnet.
- Stellen Sie die Spannungsskala in der oberen rechten Ecke des Software-Fensters auf 500 mV. Der erste Kanal wird die Antworten von der Elektrode in Echtzeit aufgezeichnet anzuzeigen, während der zweite Kanal, der die Rechteckwelle von dem Funktionsgenerator erzeugten aufzeichnen wird, wenn das Signal auf die Datenerfassungshardware über dem Oszilloskop zugeführt wird zeigt, wenn der Verschluss geöffnet ist . Die beiden anderen Kanäle sind nicht benötigte.
- Klicken Sie auf "Start" in der unteren rechten Ecke der Aufnahme zu beginnen, und lassen Sie die Software für die Dauer des Experiments zu laufen. Stellen Sie den Zoom der x (Zeit) und y (Spannung) Achsen so, dass die Antworten klar sind.
- Zuerst mit weißem Licht, notieren bei 3,5 OD (etwa 5-10 sec) bis 10 Einzelantworten mit dem ND-Filter Rad nach oben.
- Nächster Datensatz die gleiche Anzahl von Antworten bei 3,3 OD, dann 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1, usw. in jeder Kombination bis 0.0 OD. Diese Antwortamplituden auf die ND-Filter-Serie liefert die Antwort-log Intensitätskurve in Abschnitt 6. Wenn Bleichen auftritt, weniger Blitze helle Reize im Verlauf des Experiments verwenden.
- Aufzeichnen der Antwort der Zelle auf alle Wellenlängen, die Interferenzfilter verwenden.
- Zuerst finden die Spitzenwellenlänge. Ohne ND-Filter im Lichtweg (0,0 OD), legen Sie einen Filter UV-Sende im Lichtweg und kurz auf die Antwortamplitude beobachten. Wiederholen Sie mit einem blauen Sendefilter, einem grünen Sendefilter und einem roten Sendefilter, die eine Vorstellung davon geben, sollte, wo die Spitzenantwort sein wird.
- Verwenden Sie Filter bei etwa 350, 450, 550, 650 nm den allgemeinen Bereich der Spitzenempfindlichkeit zu finden inSchritt 5.14.1. Die genaue Wellenlänge keine Rolle spielt in dieser ersten Suchphase, da alle Wellenlängen wird im nächsten Schritt aufgenommen werden. Wenn Schätzungen der Spitzen Empfindlichkeiten bestehen, oder sie wurden bereits aufgenommen, die Verwendung bekannter Wellenlängen, um schnell die Spitzenantwort zu identifizieren.
- Sobald die Spitzenantwort oder nahe daran erkannt wird, Rekord bei dieser Wellenlänge für 10 Antworten (ca. 5 sec).
- Nachdem bei der Wellenlänge der Spitzenempfindlichkeit der Aufzeichnung Aufzeichnung mit den anderen Interferenzfilter, 300 bis 700 nm bei 10 nm-Schritten. Starten Sie von der Spitze und Schritt aus in Richtung einer längeren oder kürzeren Wellenlängen durch die Filter aus dem Lichtweg Swapping eins nach dem anderen (zB wenn die Spitzenreaktion bei 520 nm, Rekord Antworten bei dieser Wellenlänge zuerst, dann 510 nm, gefolgt von 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, und so weiter, bis keine keine Antwort).
- Lassen Sie für bis zu 10 Antworten pro Filter (5 sec pro Stück). Wenn Interferenzfilter austauschen, damit die Zelle bzw.ond auf 1-2 Blitze Weißlicht ohne Filter im Lichtweg, die hilfreich ist, zu überwachen, ob die Peak-Antwort über die Zeit verschlechtert. Reduzieren Sie die Anzahl der Antworten oder der OD erhöhen, wenn Bleichen auftritt.
- Wenn die Antwort im Rahmen einer Interferenzfilter zu nahe bei 0 OD auf die maximale Reaktion unter weißem Licht ist, dann mit ND-Filter dämpfen. Die Interferenzfilter und die Größe des Glasfaserkabels in diesem Experiment verwendet dämpfen stark die Intensität des Lichts, und so ND-Filter werden in der Regel nicht benötigt.
- Wenn die Aufnahme stabil bleibt, erneut aufzeichnen Wellenlängen um die Spitzenantwort, die zur Bestätigung der vorherigen Antwort Amplituden als pseudoreplicate dient und hilft, die Reaktion zu gewährleisten, hat sich nicht im Laufe der Zeit abgebaut werden. Sobald alle Wellenlängen aufgenommen, erneut aufzeichnen die Antworten unter der ND-Serie, wie in Schritt 5.12.
- Sobald die Aufnahme beendet ist, klicken "Stop" auf der Software, und die Aufzeichnung für die Analyse zu speichern.
- Nach einem Experiment, opfern, um die einzelnen durch Einfrieren oder mehrere Minuten Kühlung durch schnell folgte dem Kopf und Zerkleinern des Thorax Trennen.
- Fahren Sie alle Geräte nach unten. Brechen Sie hier notwendig, wenn vor der Analyse zu tun.
6. Spektrale Empfindlichkeit Analyse
- Mit der Software verwendet, um rohe Antworten aufzuzeichnen, die Berechnung der mittleren Antwort Amplitude von 10 einzelnen Antworten für jeden Filter der ND-Serie und für jeden Interferenzfilter.
- Erstellen Sie eine Antwort-log - Intensität (VlogI) Funktion aus dem ND - Filter Serie aufgezeichnet in den Schritten 5,12-5,13 (Abbildung 7). Dies geschieht durch Auftragung der logarithmischen Intensitätseinheiten (OD) auf der X-Achse, und die Reaktion auf jede Intensität auf der y-Achse.
- Der spektralen Empfindlichkeit der Zelle bei unterschiedlichen Wellenlängen abgeleitet werden, passen typischerweise die Naka-Rushton-Gleichung an die Daten aus Schritt 6.2 und diese Gleichung verwenden, um experimentell erhaltenen spektralen Reaktionen verschiedener Wellenlängen t betreffeno relativen Photonen erforderlich, dass die Reaktion bei einer konstanten Wellenlänge zu entlocken (in diesem Fall weißes Licht).
Hinweis: Die Naka-Rushton - Gleichung ist: V / V max = I n / (I n + K n), wobei I die Reizstärke ist, V ist die Antwortamplitude, V max die maximale Antwortamplitude, ist K der Stimulus Intensität geben ½ V max und n die exponentiellen Steigung. Verschiedene Verfahren können diese Gleichung verwendet werden, um den VlogI Daten anzupassen, einschließlich der Kurvenanpassungssoftware oder Codebasierte statistische Pakete. - Um die Naka-Rushton Gleichung mit einfachen Berechnungen und ein Tabellenkalkulationsprogramm passen, transformieren die VlogI Antwortdaten für jeden Reizintensität: log [(V max / V) - 1]. Führen Sie anschließend die lineare Regression auf den transformierten Daten die Gleichung der Linie der besten Passform zu erhalten.
Hinweis: V max muss größer sein als alle gemessenen Antworten; dies konsistent zu halten, schätzt diese Methode V max als 1% greater als der höchste gemessene Antwort. - Aus der Gleichung der Regressionsgeraden, schätzen den Exponenten (n) durch die negative Steigung nehmen, und log (K) = y-Schnitt / n.
- Der spektralen Empfindlichkeit der Zelle bei unterschiedlichen Wellenlängen abgeleitet werden, passen typischerweise die Naka-Rushton-Gleichung an die Daten aus Schritt 6.2 und diese Gleichung verwenden, um experimentell erhaltenen spektralen Reaktionen verschiedener Wellenlängen t betreffeno relativen Photonen erforderlich, dass die Reaktion bei einer konstanten Wellenlänge zu entlocken (in diesem Fall weißes Licht).
- Sobald die Parameter für V max, n, und K wurden geschätzt, bestimmen die relative Anzahl von Photonen bei jeder Wellenlänge der spektralen Antwort der Zelle hervorzurufen , erforderlich von der gemessenen spektralen Empfindlichkeit bei einer gegebenen Wellenlänge als (V) einstecken und Lösung für I.
- Multiplizieren die berechnete Reizintensität (I) aus Schritt 6.3 mit dem Korrekturfaktor für jeden Interferenzfilter (aus Schritt 2.4.3) bei jeder Wellenlänge.
- Um die Empfindlichkeit müssen alle Intensitäten der Kurve V log-I in Beziehung gesetzt werden, damit sie verglichen werden können. Tun Sie dies , indem jede Wellenlänge Intensität bezüglich V max oder K, berechnet in Schritt 6.2.3 bis ½.
- Subtrahieren jede korrigierte Wellenlänge Intensität (Schritt 6.4) von K.
- Dann gilt für jede Wellenlänge Intensität, fügen Sie diese "Abstand von K "Wert K und multiplizieren mit (-1).
- bringen Weiter alle Datenpunkte positive durch den Absolutwert der niedrigsten Datenpunkt das Hinzufügen in der Reihe jeder Wellenlänge.
- Finden Empfindlichkeit bei jeder Wellenlänge, die durch den Kehrwert aller neu berechneten Intensitäten von Schritt 6.5.1 nimmt. Transformieren der Daten so, dass die Empfindlichkeitsspektrum zwischen 0 und 1 fällt.
- Nachdem er von mehr als einer Zelle des gleichen Typs Durchschnitt Aufzeichnung der endgültigen Antworten und Grundstück mit Standardfehlerbalken oder 95% Konfidenzintervall (Abbildung 8).
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Representative Results
Für viele Elemente der Aufnahme - Setup, eine schriftliche Beschreibung liefert nicht genügend Detail. 1 ist eine schematische Darstellung der Komponenten in der gesamten Aufnahme - Setup beteiligt. In Figur 2 Spektren werden für weißes Licht und jeden Interferenzfilter ein Gefühl dafür , warum ein Korrekturfaktor benötigt wird, aufgetragen , und was benötigt wird , um diese Korrektur zu berechnen. 3 zeigt Bilder und ein Diagramm des Cardan Arm , die für diese verwendet wird , Experimente. 4 ist ein zusammengesetztes Bild der Aufzeichnungsstufe und Mikromanipulator zeigt, Fig . 5 verschiedene Schritte bei der Herstellung eines Schmetterlings für das Experiment zeigt.
Sobald eine Aufzeichnung beginnt, bedeutet eine negative Änderung der Spannung in Reaktion auf einen Lichtblitz , daß die Elektrode außerhalb einer Zelle ist, wie in 6a. Die Stärke der Reaktion hängt von der Nähe der ElektrodeSpitze auf eine Photorezeptorzelle und dem Einfallswinkel des Lichtblitzes. Die Antwort sollte groß sein (> 30 mV) , bevor die Spitze in eine Zelle nahe genug ist aufzuspießen. 6b zeigt eine klare depolarisierende Reaktion auf einen Lichtreiz, bedeutet den Eintritt in eine Sehzellen. Das Ruhepotential sollte stabil sein, und die Antwortamplitude sollte groß (mindestens 40 mV) sein, obwohl die absolute Amplitude beträchtlich variieren. Wir messen die relative Reaktion, so ist es wichtig, dass das Signal-Rausch-Verhältnis hoch ist. Wenn das Potential stark ändert ruht, sieht die Antwortwellenform ungewöhnlich, oder die maximale Reaktion zu niedrig ist, dann vergleicht relativen Reaktionen über alle Interferenzfilter unmöglich wird. Beispiele für unbrauchbare Aufnahmen sind in Figur 6c, 6d dargestellt.
Nach einer erfolgreichen Aufnahme abgeschlossen, müssen die ND - Antworten und die Naka-Rushton Gleichung aufgetragen werden sollte , 33 an die Daten angepasst werden, shown in Abbildung 7. Diese Zahl wird aufgetragen ohne Interferenzfilter den ND - Filter Serie. Wenn die Aufzeichnung stabil ist, sollten die Daten aus dem ND-Filterserie vor und nach dem Experiment ähnlich sein. Spektrale Empfindlichkeit wird durch Anpassung der Naka-Rushton Gleichung auf die VlogI Plot in Abbildung 7, dann die Lösung für (I) für jede Antwort (V) bei einer bestimmten Wellenlänge bestimmt, wie in den Berechnungen des § 6 des Protokolls erklärt.
Ein repräsentatives Beispiel für die spektrale Empfindlichkeit von einer einzigen Aufnahme abgeleitet ist in 8a (bitte beachten Sie dieses Beispiel zeigt reale berechneten Daten, aber die Spitze verschoben wurde als dieses Ergebnis nicht veröffentlicht) aufgetragen. Zelltypen können durch Spitzenempfindlichkeit bei einer ähnlichen Wellenlänge und Gesamtform des Empfindlichkeitsspektrum klassifiziert werden. Ähnliche Zelltypen werden dann gemittelt und die mittlere Empfindlichkeit wird mit Standardfehlerbalken bei jeder Wellenlänge in Figu geplottetre 8b. Spektralen Empfindlichkeiten der drei typische Zelltypen in einem Insekt gefunden werden in 8c gezeigt (Größe und Fehlerbalken sind aus realen Daten berechnet, aber die Peaks verschoben).
Abb . 1: Schematische Darstellung der Aufnahmekomponenten Komponenten des Lichtweges, Probenaufbau und Aufnahme - Hardware angezeigt. Optische Spur sitzt auf der Holzbank außerhalb des Faradayschen Käfigs. Xe, Xenonbogenlampe, Cd, Kondensator Montage, Lx, konvexe Linse, ND, Neutraldichtefilter Rad, Cf, Interferenzfilter, S, Shutter, Lc, konkave Linse, Co , kollimierende Strahlsonde, Fo, Glasfaserkabel. Der Faraday-Käfig sitzt auf demHolzbank um die Probe. Die Holzbank sitzt oben, aber nicht der Schwingrührvorrichtung isoliert Marmortisch unter berühren. Aufzeichnen (Rc) und Referenz (Rf) Elektroden sind mit dem heads (Hs) angebracht ist . Rc in das Auge eingeführt wird , (E) und Rf in einen anderen Teil des Körpers eingeführt wird . Der heads ist Teil des Vorverstärkers (Pa) Einrichtung außerhalb des Faradayschen Käfigs. Das Signal wird von dem Vorverstärker durch das Humbug Rauschreduzierer (Hb) und in das Oszilloskop (Os) geleitet. Vom Oszilloskop wird das Signal durch die Powerlab Hardware (PLB) und in den Laptop - Computer (CPU) geführt , wo sie durch die LabChart Software gelesen wird. Der Verschluss wird durch einen Funktionsgenerator (FG) gesteuert , die durch einen zweiten Kanal auf dem Oszilloskop übergeben wird, und auch durch einen zweiten Kanal auf der Powerlab Hardware geleitet werden kann , wenn dieses Signal als auch aufgezeichnet werden wird.
Abbildung 2:. White Light und Interferenzfilter Spectra Gebrauchte Korrekturfaktoren zur Berechnung der gemessenen Spektren in Schritt 2.5 des Protokolls von 300 bis 700 nm gezeigt, für weißes Licht sowie jede der 41 Interferenzfiltern. Jedes Interferenzfilter Spektrum wird mit nur diesen Filter im Lichtweg gemessen. T 520 entspricht der Fläche unter dem Spektrum für den Peak - Filter mit 520 nm und 520 s entspricht der Intensität des weißen Lichts bei Spitzenwellenlänge des Filters, 520 nm. Diese Werte werden bei der Berechnung der Korrekturfaktoren für jeden Filter (in diesem Fall 520 nm) verwendet, wie im Schritt 2.6 in dem Protokoll beschrieben.
Abbildung 3:. Beschreibung des Perimeter Kardan Arm Verwendet in den Experimenten Der Kardan Arm hält das Glasfaserkabel und ermöglicht die volle sphärische Rotation und Winkeleinstellung , so dass Licht kann bei der richtigen Einfallswinkel in die Zelle aufgenommen wird geliefert werden. (A) Top - down - Ansicht. (B) Blick von der Seite in einem Winkel. Die Zahlen entsprechen dem gleichen Teil in allen Panels. (1) Die Bodenplatte ermöglicht eine vollständige Kreis Drehung in der horizontalen Ebene. (2) Die vertikale Platte ermöglicht die volle Kreisrotation des Arms in einer vertikalen Ebene. (3) Dieser Zylinder hält den Metallarm mit dem faseroptischen Kabel an dem Ende, und es erlaubt eine zweite vertikale Ebene der kreisförmigen Drehung senkrecht zu (2). (4) Das Glasfaserkabel wird i gehaltenn am Ende des Arms, und Licht wird in der Versuchsanordnung in Richtung der Position der Probe gerichtet.
Abbildung 4:. Die Komponenten der Aufnahme - Einrichtung (A) Kunststoffrohr verwendet , um die Probe zu halten. (B) Draufsicht auf die Plattform , auf der die Probe und das Rohr montiert sind. (C) Seitenansicht von Kugel- und gemeinsame Plattform mit Magnetfuß (1). Referenzelektrode gehalten immobile mit Leim und Wachs auf der Seite der Plattform (2). Die Referenzelektrode um Krokodilklemme gewickelt und dort verlötet, einen Befestigungsbereich, in der der headsReferenzElektrode Clip (3). (D) Elektrodenspitze unter 20 - facher Vergrößerung. Maßstabsbalken, 25 & mgr; m. (E) Bühne, Elektrodenhalter und Mikromanipulator - Setup. Die heads (1) oberhalb der Vorrichtung mit der festenSilber Aufzeichnungsdraht (2), und die Referenzelektrode mit Krokodilklemme (3) befestigt ist. Der Elektrodenhalter (4) mit einer manuellen Mikromanipulators befestigt (5) mit einem Beitrag unter dem mit einem Knopf für eine vertikale Bewegung eingestellt werden kann oder für eine horizontale Bewegung des Elektrodenhalters geschoben oder gezogen werden. Die magnetische Plattform mit Probe sitzt auf der Bühne (6) direkt unter dem Elektrodenhalter. (F) Der Faraday - Käfig umgibt die Aufnahme - Setup mit einem Bildschirm, oder unten in der Vorderseite nach oben gezogen werden kann. Aluminiumfolie wird unter allen Geräten mit Gummi-Pads auf der Oberseite platziert. Das faseroptische Kabel (1) führt in den Käfig von der optischen Spur außen und wird durch die Cardan Arm (2) in Richtung auf die Stufe (3) gerichtet ist. Die Aufnahmestufe und Manipulator Vorrichtung in einem Sandkasten (4) ruht auf einem Marmortisch unter dem Setup platziert. Alle anderen Geräten beruht auf der Holzbank oben, die nicht den Marmortisch berührt. Der Sandkasten sitzt oben auf dem Marmortisch in einem Lochgeschnitten aus dem Holztisch, so dass die Probe vollständig vibrierend von der Ausrüstung auf der hölzernen Tischplatte isoliert ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Schmetterlings - Prep (A) Der Schmetterling in das Rohr eingeführt wird und der Kopf, Flügel und Antennen werden mit heißem Wachs immobilisiert. Die indifferente Elektrode wird in die Mundwerkzeuge (1) eingesetzt, ein Stück trockenes Wachs wird verwendet, um den Bauch zu halten, nach unten (2), und ein nasses Gewebe hinter der Probe angeordnet. (B) Nahaufnahme des Kopfes gewachst nach unten. Das Auge aufgezeichnet werden aus (1) klar aus Wachs oder Schmutz gehalten, und die Referenzelektrode (2) in die Mundwerkzeuge eingesetzt und heißem Wachs wird schnell geschmolzen über um es in Position zu halten.(C) Ein Loch geschnitten in das Auge , wo die rosa-weiß Sehzellen Schicht zu sehen ist. Schwarzpigment und Gelb Hämolymphe fehlen. (D) Seitenansicht der Probe mit einem Glas Aufzeichnungselektrode (1) in das Auge eingesetzt, und der indifferenten Elektrode (2) an der Kopfstufe befestigt, die eine Schaltung vervollständigen sollte wie auf dem Oszilloskop zu sehen. Klicken Sie hier um zu sehen eine größere Version dieser Figur.
Abb . 6: Raw Antworten von Sample - Aufnahmen Jede Antwort entspricht einem einzelnen Lichtblitz von 50 ms Dauer (schwarze Balken). (A) Ein Beispiel für die große negative Spannungsänderung , die gerade betrachtet werden solltebevor eine Zelle eingeben. (B) Eine saubere Aufzeichnung sollte wenig Hintergrundrauschen und eine große depolarisierenden Reaktion, typischerweise von mindestens 40 mV. (C) Ein Beispiel für eine schlechte Aufnahme aufgrund des negativen Potentialänderung nach dem Hauptpeak (Pfeilspitzen). (D) Ein weiteres Beispiel für eine schlechte Aufnahme. Das Ruhepotential wird derzeit große Schwankungen (roter Balken) und die große Menge an Hintergrundrauschen kann die Amplitude des Ansprechens (Pfeilspitze) verdunkeln.
Abbildung 7:. Antwort-Intensity Log-lineare Funktion Füllte Kreise zeigen die gemessenen Reaktionen einer Zelle 3,5-0 OD, für diesen Versuchsaufbau. Die Lichtintensität ist auf einer logarithmischen Skala. Bei sehr hohen Intensitäten wird die Reaktion gesättigt ist, und bei sehr geringen Intensitäten eine kleine Antwort andauert statt entlang der Linie auf Null fällt. Ter Naka-Rushton Gleichung 33 ist auf diese nicht-lineare Form (gepunktete Linie) ausgestattet.
Abb . 8: Spektrale Empfindlichkeit Beispiele (A) eine einzige repräsentative Antworten der Zelle wurden aufgezeichnet und die relative spektrale Empfindlichkeit wurde berechnet. Der Höhepunkt dieser Zelle ist bei 440 nm, was bedeutet, es am besten auf blaues Licht reagiert. Einzelzellendaten aussehen kann laut (Peak bei 380 nm). (B) Zellen , die mit der gleichen relativen Peak und Form zusammen gemittelt und Standardfehlerbalken werden hinzugefügt. Hier sieben blaue Zellen, die aus sieben Personen wurden starke Beweise gemittelt wird, dass ein Zelltyp in dieser Spezies bei 440 nm maximal empfindlich auf Licht vorhanden ist. (C) Dieser Prozess kann für alle Zelltypen wiederholt werden gefunden, und aufgetragen zusammen. Insekt Augen sind sehr unterschiedlich in ihrer spektralen Empfindlichkeiten aber eine typische insect können Spitzen hier bei 370 nm, 440 nm und 510 nm gezeigt haben. Beachten Sie, dass diese spektralen Empfindlichkeiten sind alle berechneten realen Daten verwendet, aber die Spitzen haben sich verschoben worden, weil die Daten noch nicht für diese Art veröffentlicht wird.
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Discussion
Die intrazelluläre Aufnahme kann eine schwierige Technik, aufgrund der vielen technischen Schritte zu meistern beteiligt. Für eine erfolgreiche Experimente müssen einige wichtige Punkte berücksichtigt werden. Erstens ist es wichtig, eine richtig schwingungsisolierten Tisch zu haben, an dem das Experiment durchgeführt wird. Viele Forscher verwenden Luft-Tabellen, die vollständig die Tischplatte von der Basis trennen, überlegene Schwingungsisolierung zu geben. Unser Setup beinhaltet einen dicken Marmortisch mit einem Sandkasten auf, in die platziert wird, um die Mikromanipulator / Elektrodenhalter / Probentischgerät. Dies ist eine effektive und kostengünstige Alternative zu einem Lufttisch, vor allem, wenn der Zugang zu in-house Gas oder Druckluft ist eine Einschränkung. Zusätzliche vibrationsdämpfende Maßnahmen wie passive Luftfederung getroffen werden können, oder die Zugabe von Dämpfungselementen an den Tischbeinen (zB geöffnet Tennisbälle, Fahrradschläuche, dicke Gel - Pads). Darüber hinaus ist es wichtig, dass der experimentelle Aufbau im Inneren sein,Faraday-Käfig mit allem, was richtig geerdet ist. Der Faraday-Käfig sollte ein Metall-Mesh-Sieb in der Vorderseite haben, die entfernt werden kann, wenn einfach in den Käfig und ersetzt arbeiten bei der Aufnahme. Selbst eine kleine Menge an Umgebungs elektrisches Rauschen (insbesondere 50 Hz Lärm von der Hauptstromversorgung AC) kann eine ansonsten gute Aufnahme unbrauchbar machen.
Wenn die Probe vorbereitet, Hämolymphe und Pigmentschichten die Ommatidien umgibt, kann erfolgreiche Aufnahmen verhindern. Wenn das Loch in der Hornhaut geschnitten wird, zu groß, normale Pumpen von Hämolymphe im Körper bewirkt, dass die Flüssigkeitsoberfläche an der Schnitt Seite nach oben und unten, in einer instabilen Aufnahme führt. Sobald das Loch geschnitten wird, Hämolymphe und Oberflächenpigmentschichten wird schnell zu einem undurchdringlichen Schorf gerinnen selbst wenn sie mit Vaseline verschlossen, so ist es wichtig, die Elektrode in das Auge so schnell wie möglich zu bekommen. Ringer-Lösung kann auch anstelle von Vaseline verwendet werden. Die Erdungselektrode kann in die eingeführt werdenMundwerkzeuge oder in den Stumpf eines geschnittenen Antenne.
Zusätzlich ist es oft hilfreich, um das Tier zu halten, wie dunkeladaptierten wie möglich. Für dieses Verfahren umfassen halten Schritte, um den Aufnahmeraum sehr dunkel, Streulicht von der Xenon-Lampe Blockierung vom Eintritt in den Faraday-Käfig, kurzer Dauer Stimulus blinkt (30-50 ms), und eine ausreichend niedrige Frequenz zwischen den Blitzen (0,5 oder höher). Wenn ein visuelles Pigment ein Photon absorbiert, schaltet das Chromophor in Rhodopsin von 11- cis - 3-hydroxyretinal zu all - trans - Retinal, die Konformationsänderung des Opsin - Protein zu induzieren, und den gesamten Komplex als Metarhodopsin Aktivierung, die das G - Protein initiiert Kaskade. Photo-Bleich tritt auf, wenn Licht mit hoher Intensität den Chromophor verursacht von dem Opsin-Protein physisch zu trennen. Es ist ein limitierender Faktor bei diesem Versuch, da die Elektrode nur stabil Antworten aufzeichnen wird von innerhalb der Zelle für eine bestimmte Zeitdauer, bevor es aus fälltoder die Membran beschädigt ist. Aus diesem Grund brechen wir nicht die Zelle, sich zu erholen, aber wir haben einen Blitzdauer und Frequenz verwenden, die wir gefunden haben, nicht die Zelle die Reaktion im Laufe der Zeit verschlechtern. Es ist wichtig, sowohl die Frequenz und die Intensität des Lichts zu verringern, wenn Photobleaching auftritt.
Während der Aufnahme eine große Elektrodenspitze oder große Bewegung durch die Elektrode kann die Zelle beschädigen, wenn die Membran zu durchdringen. Nur feine Spitzen (mindestens ~ 100 M & Omega;) und kleine Bewegungen verwendet werden sollte, wenn eine Zelle zur Aufnahme nähert. Wenn die intrazelluläre Aufnahme auf andere Anwendungen angewendet wird, wie Gehirnaufnahmen, extrem feine, stabile Elektroden können unter Verwendung von Quarzglas gezogen, aber ein Fach puller muss für diese Elektroden verwendet werden. Wenn zuerst eine Elektrode ziehen Programm machen, überprüften wir Spitze Widerstand durch die Elektrode Verfüllung, es an den Elektrodenhalter in einem Mock-Setup zu sichern, und die Spitze und Masseelektrode in Salzlösung setzt. Next rechneten wir mit einem aktuellen Änderung der Spannung auf dem Oszilloskop zu messen. So verschieben wir die Elektrodenspitze eine manuelle Mikromanipulator verwenden, die entlang zweier Achsen bewegt. Andere Manipulatoren bestehen einschließlich digitaler diejenigen, die Bewegung entlang allen drei Achsen ermöglichen, und diese können für diese oder komplexere Anwendungen verwendet werden. Es gibt viele Möglichkeiten, eine Stufe zur Aufzeichnung zu bauen, und es gibt viele verschiedene Arten von Hardware und Software in die Aufnahme verwendet und die beobachteten Daten zu analysieren. Unser Setup stellt eine einfache, einfache und kostengünstige Einrichtung der Aufnahme rig.
Bei der Konstruktion des VlogI Kurve entwickelte Funktionen , die von Naka und Rushton 33 und andere , 34,35 - Konto für die nichtlinearen Bereiche der aufgetragenen Antworten. Verschiedene Verfahren werden verwendet , diese Kurve an die Daten anzupassen, und wir geplottet die Ergebnisse eines solchen Verfahrens , das nicht Kurvenanpassungs - Software erfordert, obwohl auch andere Verfahren geeignet sind 36,37 (
Eine Beschränkung des Verfahrens besteht darin, dass, wenn die Studie Organismus mehr als einer genetisch ähnlichen Opsin in das Auge drückt, es schwierig sein kann, zu identifizieren, welche Opsin mRNA entspricht wahrscheinlich die spektralen Klasse von Photorezeptorzellen. Um dieses Problem zu überwinden, hat dieses Verfahren mit Farbstoffinjektionen kombiniert worden und in situ - Hybridisierung oder Immunhistochemie , um erfolgreich die Opsinen identifizieren ausgedrückt in 10 aufgezeichnet Zellen.
Unsere Methode ist einfach und zugänglich für Forscher nicht vertraut mit visuellen Elektrophysiologie. Diese Technik ist weit verbreitet in den Neurowissenschaften, aber spezifische und klare Methoden sind in der Literatur nicht vorhanden, so dass dieses Verfahren nur schwer zu reproduzieren. Obwohl viele Variationen dieser Technik vorhanden sind, bieten wir eine einfache Möglichkeit, die spektrale Empfindlichkeit in der Verbindung Auge zu messen. Die physiologischen Daten ist ein wichtiges Beweisstück in Geschichten der visuellen Ökologie und Evolution 41. Opsin Sequenzvariation ist eng mit der Empfindlichkeit einer Photorezeptorzelle verbunden sind, diese Methode ideal für Studien machen die genetische Grundlage für phänotypische Veränderungen zu untersuchen. Die Messung der Sehzellen Empfindlichkeiten können auch mit Verhaltensfarbunterscheidungstests gepaart werden, die physiologische Grundlage für wichtige Unterscheidungsschwellen in Vision Farbe zeigt 42-46. In genetischen oder therapeutische Manipulationen in Drosophila zum Beispiel, dieses Technik kann ein guter Weg sein , die richtige physiologische Funktion des Auges oder des Gehirns als auch 47,48 zu messen. Obwohl uns nicht die erste oder die komplexeste Methode der intrazellulären Aufnahme in das Auge, unsere Hoffnung ist, dass wir diese Methode für die Wiedergabe und die Integration mehr machen können außerhalb der formalen Neurowissenschaften in Forschungsprogramme leicht zugänglich sind.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken dem späten Rudy Limburg für die Kardan Armumfang Herstellung, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, und Raju Metherate uns Ausrüstung für die Kreditvergabe, und Almut Kelber und Kentaro Arikawa, für Ermutigung. Diese Arbeit wurde von einem National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship an KJM und NSF Zuschuss IOS-1257627 ADB unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
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