Abstract
-omicsの出現により、がんやメタボリックシンドロームなどの慢性疾患の我々の理解が向上した近づきます。しかし、遺伝子発現マイクロアレイから得られる大規模なデータセット、深いシーケンシング実験または代謝プロファイリングにおける情報の効果的な採掘が明らかにした後、効果的に病気の細胞の表現型の重要な調節因子を標的とすることが不可欠です。エストロゲン受容体α（ERα）は、エストロゲン応答性乳癌のために重要である遺伝子プログラムを制御するマスター転写因子の一つです。乳がん代謝におけるERαシグナル伝達の役割を理解するために、我々はトランスクリプトーム、エストラジオールで処理されたMCF-7細胞からcistromicとメタボロームデータを利用しました。この報告では、RNAのSeq、ChIPの-のSeqとメタボロミクス実験と得られたデータの統合的なコンピュータ分析のためのサンプルの生成を説明しました。このアプローチは、新規モルの輪郭を描くのに有用ですcularメカニズムおよび正常または疾患細胞の影響代謝特定の転写因子によって調節されている遺伝子調節回路。
Introduction
エストロゲンは生殖組織、代謝組織、脳や骨1を含む。女性と男性の両方における多くの生理学的プロセスの重要な調節因子です。これらの組織において有益な効果に加えて、エストロゲンはまた、乳房および生殖組織から生じる癌を駆動します。エストロゲンは主に細胞型特異的な効果を誘導することのERを介して動作します。 ChIP-のSeqを用いてRNA-のSeqとゲノムワイドERαDNA結合部位の解析を使用してERαによって調節転写産物のディープシーケンシングは、ERαがそれらから生じる異なる組織および癌においてどのように動作するかを理解するのに有用であることが判明しました。我々と他の人は、異なる受容体（ERβ対ERα）2,3、異なるリガンド3-5と異なるコレギュレーター2,4,6,7に関連した遺伝子発現プロファイルを公開しています。
RNA-のSeqは、マイクロアレイBAと比較して、より高い精度と効率を提供し、トランスクリプトームを検討するための主要な方法であり、sedの遺伝子発現解析8。細胞株2-4,7、組織または腫瘍試料から得られたRNAは、利用可能なゲノムアセンブリにマッピングされ、配列決定され、示差的に調節する遺伝子が同定されます。クロマチン免疫沈降（チップ）は、公知の調節結合部位に結合する転写因子および補調節因子、クロマチンを分析するために使用されます。 ChIP-のSeq（ハイスループットシークエンシングに続いてのChIP）は、グローバル結合部位の公正な検出を提供します。メタボロミクスは別ますます使用されるシステム生物学のアプローチ、定量的に測定し、化学物質や遺伝的摂動を含む様々な刺激に対する生体系の動的マルチパラメトリック応答です。
グローバル代謝プロファイリングを行うことにより、機能的な読み出しは、細胞、組織、及び血液から得ることができます。また、トランスクリプトーム実験からの情報は常に生化学的経路に貢献する酵素のレベルの実際の変化を反映するものではありません。合わせましたトランスクリプトームとメタボロームデータの分析は、実際の代謝物の変化と遺伝子発現の変化を識別し、相関させることを可能にしています。すべてのこれらの大規模なデータセットからの情報を活用することは、複雑な生物学的システムを調節する転写因子、人間開発とがんや糖尿病などの疾患に関連し、特にものの役割を理解するために機械的な詳細を提供します。
哺乳動物ゲノムの複雑な性質は、それが困難な統合と完全にトランスクリプトーム、cistromeとメタボローム実験から得られたデータを解釈することができます。一旦機能的結合部位が同定されているため、標的遺伝子の発現の変化をもたらす機能的結合事象を同定することが重要です。転写結合（TF）モチーフの分析を含む分析し、その後、より高精度に行うことができます。これは、生物学的に意味のあるTFカスケードおよびメカニズムの同定をもたらします。また、直接comparis各実験からのデータは、異なるスケールとノイズを持っており、いくつかのケースでは意味のある信号が人口ノイズによって覆い隠されているので、RNAのSeqとチップのSeq実験の上で常に可能ではありません。我々は、乳癌におけるERαによる直接の代謝調節を理解するために、これらの三つの独立が関連のアプローチからの情報を統合し、任意の研究を認識していません。そこで、本論文では、当社の全体的な目標は、遺伝子発現および代謝物の変化に生産的な結合事象を関連付けることです。この目標を達成するために、我々は、RNAのSeqチップ-のSeqおよびメタボロミクスの実験からのデータを統合し、代謝経路における遺伝子発現の変化をもたらすイベントを結合ERα誘導されるエストロゲンを同定しました。初めて、我々は乳房の代謝を調節する新規遺伝子回路を明らかにしたChIP-のSeq、RNA-のSeqとメタボロミクスのプロファイリングを生成し、データの統合的な分析を行うためのプロトコル（ 図1）の完全なセットを提供します癌細胞株。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RNA-のSeqサンプルの調製
- 細胞培養および治療
- 改良MEM（IMEM）+ 10％熱不活性FBS、加湿5％CO 2雰囲気中で37℃で1％のペニシリン/ストレプトマイシンを有するフェノールレッド培地で培養MCF7細胞。
注：同じ細胞株および細胞培養条件は、試験全体を通して使用されます。 - 6ウェルプレートにウェル100,000 MCF7細胞を播種。各治療のための三連を持っています。 3日目に、培地を除去し、または各ウェルに10 -8 M E2ずに2ミリリットルに新鮮な培地を追加します。加湿5％CO 2雰囲気中、37℃で24時間プレートをインキュベート。
- 細胞を収穫各ウェルに1mLのRNA単離試薬（酸グアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム）を添加し、室温（RT）で5分間インキュベートします。その後、1.5ミリリットルチューブにピペッティングし、預金による細胞ライセート試薬を集めます
- 改良MEM（IMEM）+ 10％熱不活性FBS、加湿5％CO 2雰囲気中で37℃で1％のペニシリン/ストレプトマイシンを有するフェノールレッド培地で培養MCF7細胞。
- RNAの単離
- 200μlのchlorofoを追加10秒間、1ミリリットルの細胞ライセート試薬（1.1.3）と渦へのrm。 5分間、室温でインキュベートします。 4℃で15分間、16,000×gで遠心分離サンプル。遠心分離後、他の相を乱すことなく、新しいチューブに水相（上部）を転送。
- 転送-水相と新しいチューブに500μlの100％イソプロパノールを追加し、転倒混和。 -20℃で一晩インキュベートします。 4℃で10分間、16,000×gで試料を遠心。チューブの底にペレットを観察します。上清を捨て、短時間のボルテックスによって750μlのRNaseフリーの70％エタノールでペレットを洗浄。
- 4℃で5分間、6000×gで遠心分離サンプル。上清を除去し、残りのすべてのエタノールを収集するために4℃で1分間、16,000×gでサンプルを遠心します。ゲルローディングチップでピペッティングすることにより、残りのエタノールを除去し、10分間ダウン空気乾燥まで側チューブを設定します。 depen 20-50μlのDEPC処理水にペレットを溶解しペレットのサイズに鼎。
- プロトコール4次RNAクリーンアップキットを用いてRNAを精製します。プロトコル9次蛍光光度ベースのアッセイキットを用いてRNA濃度を測定します。
注：260 nmでのODを260nmでODのRNA濃度及び比率を決定するために採取し、280 nmでのサンプルの純度を決定するために使用されます。これは、バイオアナライザーアッセイを用いてRNAの品質をチェックすることをお勧めします。 - 配列決定のために約0.5〜1μgの精製RNAを取ります。
注：バイオテクノロジーセンターは、シークエンシングライブラリを作成し、ペアエンドは、以前に2詳述した方法を用いてシーケンシングを読んで実行します。
ChIP-のSeqサンプルの調製
- 細胞培養および治療
- 種子増殖培地中で10cmプレート500,000 MCF7細胞。
注：各プルダウンについて16のプレートを使用しました。 3日目に、培地を除去し、またはそれぞれに10 -8 M E2ずに5ミリリットルに新鮮な培地を追加プレート。 45分（37℃、加湿5％CO 2雰囲気中で）のための細胞を扱います。
- 種子増殖培地中で10cmプレート500,000 MCF7細胞。
- クロスリンクとセルハーベスト
- 、クロマチンを架橋15分間室温でインキュベートし5ミリリットル培地に250μlの37％ホルムアルデヒドを追加します。 5ミリリットルの氷冷1×MEMで細胞を洗浄することにより、架橋を停止します。
- プレートあたり250μlの細胞溶解緩衝液（10mM EDTA、50mMのトライのHCl、1％SDS、0.5％N、N-dimethyldodecan -1-アミンオキシド）で細胞を採取します。
- クロマチン断片化
- 必要なクロマチンのサイズに到達するために30のアンペアで30秒×8のための細胞を超音波処理。 30秒の超音波処理した後、氷上で各サンプルを冷却します。
- 16で遠心分離し、4℃で10分間、000×gで、かつ慎重には、底にペレットを乱すことなく、上清をピペット。
- 上清の5μlアリコートを取り、そして以前に10記載されているように、1.5％アガロースゲルによる電気泳動によるDNAのサイズを確認してください。理想的なサイズDNAの200から500塩基対の間でなければなりません。
- クロマチン免疫沈降
- 入力として、細胞溶解物の25μlのを保存します。 50mlのチューブに20mlのIP緩衝液（2mMのEDTA、100mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、および0.5％のTriton X）、ERα抗体（500μlのF10と500μlの細胞溶解物を4mlを混合HC- 20）、および500μlのPROTAとProtGタンパク質磁気ビーズをコーティングします。 chromatin-抗体複合体の形成を可能にするために、4℃で一晩回転させることにより混合物をインキュベートします。
- 洗浄およびリバース架橋
- 洗浄バッファーを除去するために、磁化の側に磁気ビーズを収集するために、磁気スタンドを使用してください。
- 25 mlの洗浄緩衝液中で磁気ビーズを洗浄I（2mMのEDTA、20mMのトリスHCl、0.01％SDS、1％トリトンX、および150mMのNaCl）。徹底的にすべての磁気ビーズを混合ウェルのWiあるまで、チューブを反転側に沿ってチューブにゆっくりと25ミリリットルの洗浄緩衝液を追加し、DNA-タンパク質複合体を乱すことなく、磁気ビーズを洗浄するために、ペレットとして現れることなく、洗浄バッファー番目。別の方法として、チューブを反転する回転子を使用しています。サンプルをボルテックスしないでください。以下の手順で同じ方法を用いた磁気ビーズを洗浄します。
- 25ミリリットル洗浄緩衝液II（2 mMのEDTA、20mMのトリスHCl、01パーセントSDS、1％トリトンX、および500mMのNaCl）に磁気ビーズを洗ってください。
- 25ミリリットル洗浄緩衝液IIIに磁気ビーズを洗浄（1.6 mMのEDTA、10mMのトリスHCl、1％NP-40、1％Dexycholateおよび250mMのLiClを）。
- 二回25ミリリットル1×TEバッファー（1mMのEDTA、および10mMのトリスHCl）に磁気ビーズを洗ってください。
- 500μlの溶出緩衝液でDNAを溶出（1％SDS、および10mMのNaHCO 3）、その後、4チューブに500μlのDNAの溶出を割り当てます。入力からのDNAは、125μlの溶出緩衝液でDNAを溶出します。
- 加熱ブロック上で65℃で一晩チューブをインキュベートします。でも、全てのチューブを介して熱を保つためにアルミホイルで加熱ブロック上でチューブをカバーしています。開口部からそれらを保つために、チューブに重みを置きます。</李>
- DNA単離
- 室温で5分間チューブを冷却します。 ChIPのDNA単離キットを使用して、プルダウンサンプルからDNAを分離します。メーカーからの指示に従ってください。
- 65℃での溶出バッファーをウォームアップ。各チューブに結合緩衝液625μLを加えます。溶液が透明になるまで沈殿物が形成される場合は、別の250μlの結合緩衝液を追加します。
- 30秒間16,000×gで列遠心上にサンプルをロードします。 250μlの洗浄緩衝液でサンプルを洗ってください。初めてそれを使用する際に、洗浄緩衝液にエタノールを追加することを忘れないでください。洗浄を繰り返します。
- 15μlの溶出緩衝液でDNAを溶出させます。同じのDNAは約55μlのDNAを達成するために、4管からプルダウン組み合わせます。
- DNA精製キットを使用した入力DNAを単離します。
- 65℃での溶出バッファーをウォームアップ。各チューブに625μlの結合緩衝液を加え、10分間インキュベートします。コレクションVol 2ミリリットルでカラムにサンプルをロードしますチューブ上。
- 、750μlの洗浄緩衝液で1分間、16,000×gで遠心分離したサンプルを洗ってください。残りの緩衝液を除去するために遠心分離を繰り返します。 EB30μlの中にDNAを溶出します。
- 修正11で商業蛍光色素アッセイを用いてDNA濃度を測定します。
- 試薬とDNAサンプルを希釈するためのアッセイ緩衝液として1×TEに20倍のTE緩衝液を希釈します。 5μlのに単離されたDNAを取り、1×TEで50μlの中にそれを希釈します。
- 2から/ mlのDNAストック溶液を、ブランクから1までの範囲のDNA標準を作る10、100、1000μgの/ mlの。 96ウェルプレートでは、二重に25の各標準μlのと同様にDNAの希釈を割り当てます。 （標準のための三連が推奨されます。）
- プラスチックチューブに1×TE緩衝液中のdsDNA試薬から200倍に希釈することによって作用試薬を準備します。光を避けるためにアルミホイルで作業試薬溶液をカバーしています。各サンプルに試薬を作業200μlのを追加します。に5分間、室温でcubate。光を避けるためにアルミホイルでプレートを覆います。
- （480nmで、発光520 nmで励起）蛍光プレートリーダーを使用して試料の蛍光を測定します。 DNA濃度に対する蛍光のDNA標準曲線を生成します。生成されたDNAの標準曲線に基づいて、試料の濃度を決定します。
- 室温で5分間チューブを冷却します。 ChIPのDNA単離キットを使用して、プルダウンサンプルからDNAを分離します。メーカーからの指示に従ってください。
- 定量PCRを使用したChIP実験の検証
- DNAを単離し、水で20μlの中に希釈し2μLを取ります。 2.5μlのDNAの希釈、5μlのグリーンI PCRマスターミックス、1μlのプライマー、および1.5μlのヌクレアーゼフリー水を混合することにより、三連で定量PCR反応を設定します。
- ステップ2 39回繰り返し、60秒、10秒、60℃、95℃：60秒、95°C、ステップ2：ステップ1：以下のプログラムを使用して、FastリアルタイムPCRシステムを用いて定量PCRを実行します。
- 配列決定のためのバイオテクノロジーセンターに10 ngのDNAサンプルを送信します。
注：バイオテック時間センターは、指示に従ってライブラリにChIPのDNAを準備し、以前に2を詳述した方法を用いて、単一の読み取りシーケンシングを行います。
3.メタボローム測定用試料調製
- 細胞培養および治療
- 種子増殖培地中で10cmプレート40万MCF7細胞。各治療のための3つのサンプルを調製します。検出のために十分な細胞を受信するために、各サンプル中の2つのプレートを使用してください。 3日目に、培地を除去し、細胞へまたは10 -8 M E2ずに5ミリリットルに新鮮な培地を追加します。 24時間（37℃、加湿5％CO 2雰囲気中で）のための細胞を扱います。
- 試料捕集
- 簡単にプレートを数回傾けた後、PBSを吸引し、プレートにPBS 1X 5ミリリットルの氷冷を追加します。二回繰り返し、最後の洗浄後、できるだけ多くのPBSを削除します。
- 各プレートにプレ冷アセトンの750μlを添加して、細胞をこすり取ります。二つのプレートからアセトン中で細胞を組み合わせで氷上で2 mlチューブに。
- 正規化のための細胞数
- 各治療のために、細胞定量化のための2つの追加のプレートを使用します。 、プレートから細胞を添付脱HEの2ミリリットルを追加するには、各プレートに（1×HBSS、10mMのHEPES、0.075％のNaHCO 3、および1mM EDTA）バッファーと5分間インキュベートします。
- HE緩衝液中で細胞をピペッティングすることにより細胞を回収し、よく混ぜます。血球計数器を用いて細胞数をカウントするために20μlの細胞溶液の合計を使用します。
- ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）分析を用いて代謝産物を同定および定量するメタボロミクスセンターに送信する前に-80℃で試料を保存します。
4.統合的分析
- RNA-のSeqデータ解析：
- FastQCを使用してFASTQファイルの品質チェックを実行します：読むQC（http://galaxy.illinois.edu）
- NGSのツールの下で読む：QCと操作FastQCを選択します。現在historからの生データファイルをアップロードY。
注：ジョブが複数の出力がある場合がありますので、ために何であったかを思い出させるために、出力ファイルのタイトルを与えることをお勧めします。
- NGSのツールの下で読む：QCと操作FastQCを選択します。現在historからの生データファイルをアップロードY。
- 実行し、出力ファイルには、歴史の下に表示されます。各シーケンスファイルに対して同じ手順を繰り返します。 NGSの下にクリップを使用してアダプターをトリム：FASTXツールキット。
- 整列はのRefSeqゲノム参照アノテーション12（デフォルト値）でTophat2を使用してhg19に読み込みます。
- RNA分析：NGSのツールの下Tophat2選択します。ライブラリーペアのタイプ（ペアエンド対シングルエンド）を示しています。
- 現在の履歴から入力FASTQファイルをアップロードします。参照ゲノムを選択します。デフォルトの設定を選択します。または変更するには、完全なパラメータ・リストを使用します。
- 実行し、それは二つの出力ファイルが生成されます：1は、接合部のUCSCのBEDのトラックです。別の一つは、BAM形式で読み取りアライメントのリストです。
- シークエンスデータ解析ツールにBAMファイルをアップロードします。クワントを用いた発現値を計算しますificationツール。
- デフォルト値を使用して発現解析ツールを使用して差動でアップレギュレートされる遺伝子を同定し、変更> 2およびp値 <0.05倍。同様に、デフォルト値を使用して発現解析ツールを使用して差動でダウンレギュレートされる遺伝子を同定し、変更<0.5およびp値<0.05倍。
- FastQCを使用してFASTQファイルの品質チェックを実行します：読むQC（http://galaxy.illinois.edu）
- ChIP-のSeqデータ解析：
- 揃えFASTQはギャラクシーでBowtie2 13（デフォルト値）を使用してhg19に読み込みます。
- マッピング：NSCのツールの下Bowtie2を選択します。ライブラリがメイト対形成（ペアエンド対シングルエンド）であるかどうかを確認します。現在の履歴からFASTQファイルをアップロードします。
- 参照ゲノムを選択します。デフォルトのパラメータ設定を使用します。実行し、マッピングされたシーケンスは、BAMファイルとして読み込むと、それは出力ファイルを生成します。すべてのシーケンスファイルのための手順を繰り返します。
- 以前に2を説明したように、MACS 14 6.0e-7のp値カットオフおよび0.01のFDRを使用してピークを識別します。
- メタボロミクスデータ解析：
- KEGG_IDsに代謝物の化学名を変換します。
- 対車両で検出されたレベルを比較することにより示差的に調節代謝産物を同定する。E2は（2倍のカットオフは、この研究において使用した）サンプルを処理しました。
- 統合分析：
- 配列決定データ分析ツールを使用してERα結合部位を有する遺伝子を同定します。距離カットオフとして20キロバイトを使用して、遺伝子機能に領域を翻訳。
- カットオフとして、それぞれp値 <0.05で、倍数変化> 2を用いてRNA-のSeqデータ解析から、差動で、上下調節遺伝子を特定し、変更<0.5倍。ベン図の比較を用いて、遺伝子を含むERα結合部位のリストと比較してください。
- CytoscapeのMetscape 15モジュールを使用してE2変調代謝経路を特定するには、このリストを使用します。
- アプリからMetscapeモジュールを選択することにより、ネットワークを構築し、その後、経路-BAS選びますエドオプション。
- 生物（ヒト）を選択します。 E2規制されていない化合物リストの選択データファイル（KEGG ID）もE2は遺伝子リストをアップレギュレート。
- ネットワークの種類として化合物-Reaction -Enzyme-遺伝子を選択してください。クエリとして化合物/遺伝子を選択してください。
- ネットワークを構築します。 E2ダウンレギュレート化合物や遺伝子を使用して繰り返します。
- 揃えFASTQはギャラクシーでBowtie2 13（デフォルト値）を使用してhg19に読み込みます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
トランスクリプトミクス
E2処理によって示差的に発現する遺伝子を分析するために、我々は、RNAのSeq実験を行うことにしました。 mRNAレベルについての情報を提供することに加えて、RNA-、配列番号データは、非コードRNA（長い非コードRNA、マイクロRNA）、および選択的スプライシング事象の変化を監視するために使用することができます。我々の研究の範囲は、代謝調節のために重要な遺伝子をコードするタンパク質を同定することであるので、我々は、非コードRNAまたは代替的に転写された遺伝子の分析に関する情報を提供していませんでした。しかし、RNA-のSeqは、差動遺伝子発現イベントの情報を取得する優れた方法です。
高品質読み取り得るためには、高純度のRNAを得ることが重要です。 RNAを単離した後、我々は、RNAクリーンアップキットを用いてRNAを精製しました。残念ながら、RNAの約50％が、このプロセスの間に失われ、RNAの出発量は、cに入れなければなりませんonsiderationは、精製工程の終わりまでに必要な量（100-500 NG）を得ました。
我々は非常に正確で、低存在量RNAの定量化のための好ましい方法である蛍光RNA HSアッセイを使用して、RNA収量を定量しました。次に、RNAサンプルの完全性と全体的な品質は、RNAの最小量を用いてゲル電気泳動に実行可能な代替案であるbioanlayzerを用いて調べました。分析は、全てのサンプルがサンプル（図2B）の整合性と純度を示す18Sおよび28SのrRNAのシャープでクリーンなバンドを持って示しています。 RNA完全性番号（RIN）は、RNAの品質管理のための標準として使用しました。 RIN 10が無傷のRNAを示し、RIN 6部分的に分解し、RIN3は強く16を分解しました。
RINは、配列決定実験のために、少なくとも7であるとことをお勧めします。私たちのRNAサンプルの全ては、9.6から9.9の間のRIN値を受信しました<強い>（図2A）。シーケンシングライブラリーは、そのような下流の準備ができていた各サンプル（表1）について得られた読み取り平均18,000,000高品質配列でイルミナ2500として超高スループットシーケンシングシステムを用いて、各試料からの高品質RNAの500ngのから構築しました分析。高スループットシーケンスの生データの全体的な品質を確認するには、FastQCは、各サンプルがの読み込みのために実行されました。 1つの車両のRNAのSeqデータのための代表的FastQCレポートが（ 図3）が示されました。ほとんどの読み出しのシーケンスの長さは約100塩基対（ 図3A）でした。各読み取りのために、品質スコアが最初の5塩基対のために32-34と6-100bp（ 図3B）36から38でした。 17990863の間でこの試料から発生読み取り、それらのほとんどは質34（ 図3C）よりも高いスコアました。シーケンスのリードあたりのGC含量も48％GCの平均の正規分布に従いました。全体的な品質読み込みのスコアが非常に高かったです。
ERα結合部位のCistromic分析
効率的な深いシーケンシングを達成するために、所望のサイズにDNA断片を得ることが重要な要素の一つです。現在の配列決定アプローチは、例えば、超ハイスループットシークエンシングシステムのため300〜600 bpの固体AB / 17のための100-200塩基対のDNA断片に異なる要件を有することができます。ゲル（図4）に示すように、この実験では、DNA断片の大部分は300 bpおよび600 bpの間です。別の方法として、読者はMNase消化を使用してクロマチンを準備することを選んだかもしれません、しかし、我々は我々の確立されたプロトコルは、高品質で必要なサンプルを提供し、再現性のある結果を提供感じます。各処理からのDNAとその対応する入力サンプルの十ngのEB緩衝液中で調製しました。 ChIPのDNAは、シングルリードの超ハイスループットシークエンシングシステムを使用して配列決定しました。 ChIPのDNAサンプルは、約もたらしました入力DNAを超える35.000,000が（表1）を読み出し、得られた一方で20,000,000読み取り。
メタボロミクス
GCMSを用いて哺乳動物細胞中で代謝産物を定量化するために、細胞塊の少なくとも10μgのが必要です。我々は実験と40万MCF7細胞を始めています。収穫の時までに、各プレートには約500,000個の細胞が存在しました。ピークによって示される代謝物の概要は、対照とエストラジオール処理したサンプル（図5）との間で比較しました。哺乳動物で知られている合計の60％をカウント同定された約100代謝産物です。ここでは、E2処理（表2）の有意な変化を示さトップ10代謝物のリストを提示します。全体的に、E2は、フルクトース及びマンノース代謝、ヒスチジン代謝、プリン代謝、コレステロール生合成およびビタミンB3代謝を含む経路をアップレギュレート。ダウンレギュレート経路はブタノmetabolisましたM、 デノボ脂肪酸生合成、ペントースリン酸経路、尿素サイクル及びアルギニンの代謝（ 表3）。
データ分析と統合
RNA-のSeq、ChIPの-のSeqおよびGC-MSのデータは、RNA-のSeqとチップのSeqに同定された遺伝子との比較後の手順（図6）の一連を介して処理し、分析したアップレギュレートの1セットと、エストラジオールによってダウンレギュレートされる遺伝子の一組を抽出しました。代謝のデータから、我々は、エストラジオール処理によって上下調節化合物の2セットを得ます。次に、視覚化し、人間の代謝15の文脈における遺伝子発現と代謝データを解釈するために、Metscape、Cytoscapeのためのアプリを使用していました。まず、ネットワーク内の化合物、反応、酵素、および遺伝子の要素を含むことを選びました。私たちは、クエリとアップレギュレーションE2（ 図7A）とダウンの二つのネットワークのような化合物/遺伝子を選択しました-regulation（ 図7B）を示しました。 Metscapeはまた、選択的経路にネットワークを構築するためのオプションを提供します。例えば、ダウンレギュレートされ、全体的なネットワークを構築し、データの同じセットを使用して、アンドロゲン、エストロゲン生合成および代謝経路のサブネットワークは、特定の経路への化合物/遺伝子からクエリを切り替えることにより生成しました。重要な変更を有する遺伝子または化合物は、明るい色で強調表示されました。記載されているように、ドロップダウンウィンドウから特定の経路を選択することに加えて、1は、選択されたエリアに「サブネットワークを作成」機能を適用することにより、サブネットワークを作成することができます。 図6AおよびBに示すように、ERαの活性化および遺伝子調節領域への直接結合は、乳癌細胞の多くの代謝経路に影響を与えました。我々の統合的な分析は、ERαを直接F（デノボ脂肪酸生合成経路のために重要である、と結合し、FASN遺伝子の発現を調節することが示されigure 7C）。またE2処置は、これらの経路にCYP4Z1、CYP2E1、CYP4B1、CYP2C8、TPO、GSTA4とGSTM2の発現を抑制することにより、アンドロゲン、エストロゲン生合成経路をダウンレギュレート。
図1：RNA-、配列番号チップ-、配列番号、およびメタボローム分析のためのRNA、DNAの試料および細胞溶解物の調製のワークフロー。
図2：アジレント2100バイオアナライザで分析RNAの代表的な電気泳動 RNA完全性番号（RIN）、RNAの質の指標は、9.9のように分析することによって与えられました。 （A）は、RNAサンプルの仮想ゲル画像では26Sと18Sの両方のバンドがシャープです。 （B）トンで、個々の微量の蛍光シグナル彼RNAは28Sピークの強度がより大きく18Sのピークがあることを示していると何の汚染が見られない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：RNA-、配列番号生データの代表的な品質チェック車両サンプルの配列データの一つはFastQCを用いて分析しました。 （A）100塩基対であるライブラリーの配列長分布。 （B）は、リード内の位置に沿って品質スコア。 （C）シーケンスあたりの品質スコアは、全配列の普遍的な高品質を示しました。 （D）理論分布と一致した読み取りあたりのGC含量。 ラを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のrgerバージョン。
図4：各試料からの細胞溶解物の超音波処理クロマチン断片のゲル電気泳動 5μlを最初のレーン上の千bpのプラスラダー1.5％アガロースゲルに流しました。断片の大部分は、300bpの間、および600である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：GC-MSからの代謝物を表すピークの概要は、上のパネルはコントロールから下部パネルしばらくE2処理したサンプルで同定されたピークを示しています。囲まれた領域は、それぞれpで表さ正確な代謝物を表示するには部屋があるました EAK。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：統合クラスタリング方法のフローチャート。
図7：Metscapeで組み込まれた遺伝子-代謝物データの可視化 （A）E2によってアップレギュレート経路のネットワーク。 （B）E2によってダウンレギュレート経路のネットワーク。 （C）E2は、サブネットワーク機能を適用することによって生成されたデノボ脂肪酸生合成ネットワークで調節されることが見出されFASNの近くの領域にERα動員を刺激しました。3832fig7large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：RNA- のSeqとチップのSeqの超高スループットシーケンスの概要。
表2：E2 処置と有意な変化を有するトップ10の代謝物のリスト。
表3：経路上下調節E2処理によって。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本稿では、生成およびE2で処理されたMCF-7細胞からのRNA-のSeq、ChIPの-のSeqとメタボロミクスデータの統合的な分析を説明しました。私たちは、生物学的に関連の発見を生み出す最も効率的な方法でユーザーフレンドリーなソフト用品を利用するために戦略的なプロトコルのセットを開発しました。我々の知る限り、我々は、3つの異なる分析から-omicsデータを統合し、ERα直接乳癌細胞において調節新しい代謝経路を同定するための最初の研究です。
トランスクリプトミクス
成功したトランスクリプトーム解析のための高品質のRNAで開始することが重要です。グッドプラクティスは、-80℃で保存し、使用中の氷上で維持し、多くの場合、手袋を変え、RNaseフリーベンチの作成など、RNA分解の可能性を排除します。 -20ºCで一晩のインキュベーションの添加は、RNA回収を向上させます。繰り返し凍結融解のRNAを回避するために、1は、下流procedurのためのRNAを割り当てることができます単離および精製の際にエス。シークエンシングエラーの存在を、サンプルからのcDNAを用いて定量RT-PCRは、多くの場合、RNA配列番号1に同定された示差的に発現された遺伝子を確認するために行われます。そのため、十分なRNAは、この目的のために確保する必要があります。我々は、スプライスバリアント、非コードRNAとmiRNAを分析することを可能にペアエンド配列決定を行います。高シークエンシングコストを回避するために、シングルエンドシーケンシングも実行することができます。マイクロアレイと比較して、RNA-SEQがより敏感であり、チップ上に設けられたプローブに限定されるものではありません。私たちは、コード配列上だけでなく、非コードする遺伝子と差別的スプライシングされた転写物のみならず情報を得ます。現在、リガンド処置ならびにマウスの実験から得られた組織の後に種々の細胞株のトランスクリプトームを分析するためにこの技術を使用しています。
Cistromics
超高スループット配列決定法は、ライブラリー構築のための最小限の5 ngのチップのDNAを必要とします。標準のCHIP-のSeqプロトコル18は、少なくとも10 ngのを持っていることをお勧めします。蛍光光度法で定量化は非常に重要です。このプロトコルでは、DNA濃度を決定するために、二本鎖DNA検出アッセイを用いました。 1つはまた、正確なDNA定量化のための蛍光アッセイを使用することができます。機材の違いのために、各研究室が所望のDNA断片のサイズを生成する独自の超音波処理プロトコルを確立するために非常に重要です。オーバーせん断大きなサイズのチップDNAが効率的な配列決定のために問題を作成しながら、ChIPのDNAは、標的DNAの濃縮の損失を引き起こす可能性があります。配列決定にDNAを提出する前に、qPCRにより、いくつか知られている地域の濃縮を検証することは常に重要です。技術はまだ免疫沈降のために使用される抗体の有効性および特異性により制限されます。確実に比較分析で使用することができる結合部位の情報を得るために、我々は、ENCODEチップ-のSeq標準以下の私たちの試薬 を検証し、19とstandarを使用一貫性のあるデータ・セットを提供してくれるdizedプロトコル。ポスト転写因子結合部位濃縮分析と結合チップ、SEQがまだクロマチンを転写因子の直接結合を決定するための最良の方法の一つです。我々は現在、他の細胞株におけるクロマチンと同様にエストロゲン応答マウス組織にリクルートキナーゼ、コレギュレーターおよび他の転写因子を研究するために、このプロトコルを使用しています。
メタボロミクス
ヒト乳癌細胞で成功したメタボリック・プロファイリングについては、慎重な試料調製が非常に重要です。このプロトコルで使用する細胞培養条件で細胞の量は、MCF7細胞に最適です。他の細胞株は、代謝物のかなりの数の検出のために多かれ少なかれ細胞が必要な場合があります。私たちは、それぞれの実験で、約100の代謝産物を得ます。この方法は、低濃度で存在している短命の代謝産物または代謝物の検出のために制限されています。この方法は、USIのしやすさを提供しています複数の代謝物を同定するために、単一のサンプル前処理をngの。我々は現在、マウス由来の血清および様々な組織でエストロゲン調節代謝物を識別するために、この技術を使用しています。
データ統合
多数のトランスクリプトミクスとcistromics研究は、MCF7細胞2,5-7,20など、乳癌細胞におけるエストロゲンシグナル伝達および遺伝子調節を研究するために行きました。本研究では、初めて、我々は、メタボロミクスのデータを追加し、直接リガンド添加時にERαによって規制された代謝ネットワークを推測しようとしました。この新しいアプローチは、細胞の代謝に影響を与えるエストロゲンによって調節ポイント分子回路網をピンすることができました。全体的に、我々の調査結果は、乳癌の生物学のマスター調節因子としてのERαの役割をサポートしています。
要約すると、我々はINTEGR治療をエストロゲンとした後、RNAのSeq、乳癌細胞からのChIP-のSeqとメタボロミクスのサンプルを生成するためのプロトコルの詳細な大要を提供しましたこれら-omicsアプローチから得られたデータのティブ分析。これらのプロトコルは、他の転写因子、核内受容体リガンドおよび栄養条件について同様の分析を行うために、研究者を可能にします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
イリノイ大学は、この補助金から給料の支援を受けたファイザー社ZMEとYCZから治験開始助成金を受けました。
Acknowledgments
この作品は、国立食糧農業研究所、米国農務省、受賞ILLU-698から909（ZME）とファイザー株式会社（ZME）からの助成金によってサポートされていました。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも米国農務省の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0 ml | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer |
| Qubit Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
- Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
- Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
- Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
- Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
- Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
- Zhang, Y., et al.
- Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
- Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).
