Summary

Biología de Sistemas de regulación metabólica por el estrógeno receptor de señalización en cáncer de mama

Published: March 17, 2016
doi:

Summary

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Abstract

Con el advenimiento de los -ómicas aproxima a la comprensión de las enfermedades crónicas como el cáncer y el síndrome metabólico ha mejorado. Sin embargo, la minería eficaz de la información en los conjuntos de datos a gran escala que se obtienen de microarrays de expresión génica, los experimentos de secuenciación profundas o perfiles metabólicos es esencial para descubrir y luego efectivamente las reguladores críticos de fenotipos de células enfermas. Receptor de estrógeno α (ER) es uno de los factores de transcripción que regulan los programas maestro de genes que son importantes para los cánceres de mama estrógeno de respuesta. A fin de comprender el papel de ER de señalización en el metabolismo de cáncer de mama se utilizó transcriptomic datos, cistromic y metabolómicos a partir de células MCF-7 tratadas con estradiol. En este informe describimos la generación de muestras de ARN-Seq, chip-Sec y los experimentos de metabolómica y el análisis computacional de integración de los datos obtenidos. Este enfoque es útil para delinear novela molcular mecanismos y circuitos de regulación de genes que son regulados por un factor de transcripción particular que afecta el metabolismo de las células normales o enfermas.

Introduction

Los estrógenos son reguladores importantes de muchos procesos fisiológicos, tanto en hembras y machos, incluyendo los tejidos reproductivos, tejidos metabólicos, cerebro y hueso 1. Además de los efectos beneficiosos en estos tejidos, los estrógenos también conducen los cánceres que surgen de mamaria y tejidos reproductores. Los estrógenos funcionan principalmente a través de las exigencias ambientales para inducir efectos específicos del tipo celular. secuenciación profunda de los transcritos regulados por ER ER usando ADN análisis de los sitios de unión de ARN-Sec y en todo el genoma utilizando el chip-Sec demostró ser útil para entender cómo funciona ER en diferentes tejidos y los cánceres que surgen de ellas. Nosotros y otros han publicado los perfiles de expresión de genes asociados con los receptores diferentes (ER) vs 2,3 ERβ, diferentes ligandos 3-5 y diferentes coregulators 2,4,6,7.

RNA-Seq es el principal método para examinar el transcriptoma, que ofrece una mayor precisión y eficiencia en comparación con ba microarraysanálisis de la expresión génica de sed 8. ARN obtenido a partir de líneas celulares 2-4,7, tejidos o muestras tumorales están en secuencia, asignada a los conjuntos genómicas disponibles y se identifican los genes regulados diferencialmente. La inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) se emplea para diseccionar la unión a sitios de unión reguladoras conocidas cromatina factor de transcripción y coregulator. Chip-Sec (CHIP seguida de secuenciación de alto rendimiento) proporciona una detección imparcial de sitios de unión globales. La metabolómica es otro enfoque de la biología de sistemas cada vez más utilizada, que mide cuantitativamente, la respuesta multiparamétrico dinámica de los sistemas vivos, incluyendo a varios estímulos químicos y perturbaciones genéticas.

Mediante la realización de perfiles metabólicos global, una lectura funcional puede obtenerse a partir de células, tejidos y sangre. Además, la información de los experimentos del transcriptoma no siempre reflejan los cambios reales en el nivel de enzimas que contribuyen a las vías bioquímicas. ConjuntoEl análisis de los datos del transcriptoma y metabolome nos permite identificar y correlacionar los cambios en la expresión de genes con los cambios reales de metabolitos. El aprovechamiento de la información de todos estos grandes conjuntos de datos de escala proporcionan los detalles mecanicistas para comprender el papel de los factores de transcripción que regulan los sistemas biológicos complejos, especialmente los que se refieren al desarrollo humano y las enfermedades como el cáncer y la diabetes.

La naturaleza compleja del genoma de los mamíferos hace que sea difícil de integrar e interpretar los datos obtenidos de los experimentos del transcriptoma, cistrome y metabolome totalmente. La identificación de eventos de unión funcionales que puedan dar lugar a cambios en la expresión de los genes diana es importante porque se identifican los sitios de unión una vez funcionales; subsiguiente análisis, incluyendo la unión de transcripción (TF) motivo de análisis, se podría realizar con mayor precisión. Esto lleva a la identificación de las cascadas de TF biológicamente significativos y mecanismos. También Comparis directosen experimentos de RNA-Seq y Chip-Seq no siempre son posibles ya que los datos de cada experimento tienen diferentes escalas y ruidos, y en algunos casos las señales significativas están oscurecidas por el ruido de la población. No tenemos conocimiento de ningún estudio que integra información de estos tres enfoques independientes pero relacionados para entender la regulación metabólica de particular ER en el cáncer de mama. Por lo tanto, nuestro objetivo general de este trabajo es relacionar sucesos de unión productivos a la expresión de genes y cambios de metabolitos. Con el fin de lograr este objetivo, hemos integrado los datos de RNA-Seq, Chip-Seq y metabolómica experimentos y se identificaron los estrógenos inducida ER eventos que conducirían a cambios de expresión génica en las vías metabólicas de unión. Por primera vez, proporcionamos un conjunto completo de protocolos (Figura 1) para generar chip-Sec, el RNA-Seq y metabolómica perfiles y la realización de análisis integrador de los datos para descubrir nuevos circuitos de genes que regulan el metabolismo de mamalíneas celulares de cáncer.

Protocol

1. Preparación de las muestras de RNA-Seq Cultivo Celular y Tratamiento Cultivar las células MCF7 en una mejora de MEM (IMEM) más medio de rojo de fenol con 10% de calor inactiva FBS, 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C en 5% humidificado atmósfera de CO2. Nota: La misma línea de células y condiciones de cultivo celular se utiliza durante todo el estudio. Semillas 100.000 células MCF7 por pocillo en placas de 6 pocillos. Tienen por triplicado para cada trata…

Representative Results

transcriptómica Para el análisis de los genes expresados ​​diferencialmente por E2 tratamiento, se optó por realizar un experimento de RNA-Seq. Además de proporcionar información sobre los niveles de ARNm, los datos de RNA-Seq también se pueden utilizar para controlar los cambios en (largos ARNs no codificantes, microRNAs) no codificantes de ARN y eventos de splicing alternativo. Nosotros no proporcionamos información sobre el análisis de los genes no codificantes ARN …

Discussion

En este artículo, describimos la generación y análisis integrador de la metabolómica datos de RNA-Seq, chip-Sec y de las células MCF-7 que son tratadas con E2. Hemos desarrollado un conjunto de protocolos strategizing para utilizar los métodos más eficientes y amigables mercancías suaves usuario que producen descubrimiento biológicamente relevante. A nuestro entender, el nuestro es el primer estudio para integrar -ómicas datos de tres análisis diferentes y nuevas vías metabólicas identificadas que ER regula…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Alimentación y la Agricultura, Departamento de Agricultura de Estados Unidos, premio ILUM-698-909 (ZME) y Pfizer, Inc (ZME). Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Departamento de Agricultura de Estados Unidos.

Materials

Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0mL Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit® RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer
Qubit® Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

References

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. . Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. . . Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Play Video

Cite This Article
Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

View Video