Biología de Sistemas de regulación metabólica por el estrógeno receptor de señalización en cáncer de mama
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
Con el advenimiento de los -ómicas aproxima a la comprensión de las enfermedades crónicas como el cáncer y el síndrome metabólico ha mejorado. Sin embargo, la minería eficaz de la información en los conjuntos de datos a gran escala que se obtienen de microarrays de expresión génica, los experimentos de secuenciación profundas o perfiles metabólicos es esencial para descubrir y luego efectivamente las reguladores críticos de fenotipos de células enfermas. Receptor de estrógeno α (ER) es uno de los factores de transcripción que regulan los programas maestro de genes que son importantes para los cánceres de mama estrógeno de respuesta. A fin de comprender el papel de ER de señalización en el metabolismo de cáncer de mama se utilizó transcriptomic datos, cistromic y metabolómicos a partir de células MCF-7 tratadas con estradiol. En este informe describimos la generación de muestras de ARN-Seq, chip-Sec y los experimentos de metabolómica y el análisis computacional de integración de los datos obtenidos. Este enfoque es útil para delinear novela molcular mecanismos y circuitos de regulación de genes que son regulados por un factor de transcripción particular que afecta el metabolismo de las células normales o enfermas.
Introduction
Los estrógenos son reguladores importantes de muchos procesos fisiológicos, tanto en hembras y machos, incluyendo los tejidos reproductivos, tejidos metabólicos, cerebro y hueso 1. Además de los efectos beneficiosos en estos tejidos, los estrógenos también conducen los cánceres que surgen de mamaria y tejidos reproductores. Los estrógenos funcionan principalmente a través de las exigencias ambientales para inducir efectos específicos del tipo celular. secuenciación profunda de los transcritos regulados por ER ER usando ADN análisis de los sitios de unión de ARN-Sec y en todo el genoma utilizando el chip-Sec demostró ser útil para entender cómo funciona ER en diferentes tejidos y los cánceres que surgen de ellas. Nosotros y otros han publicado los perfiles de expresión de genes asociados con los receptores diferentes (ER) vs 2,3 ERβ, diferentes ligandos 3-5 y diferentes coregulators 2,4,6,7.
RNA-Seq es el principal método para examinar el transcriptoma, que ofrece una mayor precisión y eficiencia en comparación con ba microarraysanálisis de la expresión génica de sed 8. ARN obtenido a partir de líneas celulares 2-4,7, tejidos o muestras tumorales están en secuencia, asignada a los conjuntos genómicas disponibles y se identifican los genes regulados diferencialmente. La inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) se emplea para diseccionar la unión a sitios de unión reguladoras conocidas cromatina factor de transcripción y coregulator. Chip-Sec (CHIP seguida de secuenciación de alto rendimiento) proporciona una detección imparcial de sitios de unión globales. La metabolómica es otro enfoque de la biología de sistemas cada vez más utilizada, que mide cuantitativamente, la respuesta multiparamétrico dinámica de los sistemas vivos, incluyendo a varios estímulos químicos y perturbaciones genéticas.
Mediante la realización de perfiles metabólicos global, una lectura funcional puede obtenerse a partir de células, tejidos y sangre. Además, la información de los experimentos del transcriptoma no siempre reflejan los cambios reales en el nivel de enzimas que contribuyen a las vías bioquímicas. ConjuntoEl análisis de los datos del transcriptoma y metabolome nos permite identificar y correlacionar los cambios en la expresión de genes con los cambios reales de metabolitos. El aprovechamiento de la información de todos estos grandes conjuntos de datos de escala proporcionan los detalles mecanicistas para comprender el papel de los factores de transcripción que regulan los sistemas biológicos complejos, especialmente los que se refieren al desarrollo humano y las enfermedades como el cáncer y la diabetes.
La naturaleza compleja del genoma de los mamíferos hace que sea difícil de integrar e interpretar los datos obtenidos de los experimentos del transcriptoma, cistrome y metabolome totalmente. La identificación de eventos de unión funcionales que puedan dar lugar a cambios en la expresión de los genes diana es importante porque se identifican los sitios de unión una vez funcionales; subsiguiente análisis, incluyendo la unión de transcripción (TF) motivo de análisis, se podría realizar con mayor precisión. Esto lleva a la identificación de las cascadas de TF biológicamente significativos y mecanismos. También Comparis directosen experimentos de RNA-Seq y Chip-Seq no siempre son posibles ya que los datos de cada experimento tienen diferentes escalas y ruidos, y en algunos casos las señales significativas están oscurecidas por el ruido de la población. No tenemos conocimiento de ningún estudio que integra información de estos tres enfoques independientes pero relacionados para entender la regulación metabólica de particular ER en el cáncer de mama. Por lo tanto, nuestro objetivo general de este trabajo es relacionar sucesos de unión productivos a la expresión de genes y cambios de metabolitos. Con el fin de lograr este objetivo, hemos integrado los datos de RNA-Seq, Chip-Seq y metabolómica experimentos y se identificaron los estrógenos inducida ER eventos que conducirían a cambios de expresión génica en las vías metabólicas de unión. Por primera vez, proporcionamos un conjunto completo de protocolos (Figura 1) para generar chip-Sec, el RNA-Seq y metabolómica perfiles y la realización de análisis integrador de los datos para descubrir nuevos circuitos de genes que regulan el metabolismo de mamalíneas celulares de cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, describimos la generación y análisis integrador de la metabolómica datos de RNA-Seq, chip-Sec y de las células MCF-7 que son tratadas con E2. Hemos desarrollado un conjunto de protocolos strategizing para utilizar los métodos más eficientes y amigables mercancías suaves usuario que producen descubrimiento biológicamente relevante. A nuestro entender, el nuestro es el primer estudio para integrar -ómicas datos de tres análisis diferentes y nuevas vías metabólicas identificadas que ER regula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Alimentación y la Agricultura, Departamento de Agricultura de Estados Unidos, premio ILUM-698-909 (ZME) y Pfizer, Inc (ZME). Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Departamento de Agricultura de Estados Unidos.
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
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