쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서
Summary
The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.
Abstract
Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.
Introduction
알칼리 혜성 분석은 단일 세포 수준에서 DNA 가닥 나누기를 측정한다. 단일 세포 현탁액은 현미경 슬라이드에 아가에 매립하고 세포의 DNA를 포함하는 수퍼 코일 루프 nucleoids을 형성 용해. 양극으로 마이그레이션하는 DNA의 해제 가닥으로 가닥 나누기를 포함하는 DNA 루프에서 수퍼 코일의 손실 산도> (13) 결과에서 전기 영동, 형광 현미경으로 관찰 할 수 혜성 같은 구조를 생성. 단편화 된 DNA는 DNA 파괴 하나를 정량화하는데 사용될 수있는 단편의 크기 및 총 강도 (머리와 꼬리)에 비해 혜성 꼬리의 상대적 형광에 기초하여 "꼬리"에 혜성의 "헤드"에서 마이그레이션 2. 분석은 단순 구분, 다양한, 빠른, 1 상대적으로 저렴하다. DNA를 손상 에이전트에 의한 단편화 된 DNA의 검출은 세포의 DNA 손상을 정량화하기위한 분석을 사용 또는에서 핵을 격리 INDIVI잠재적 유전 독성 물질 (들)로 처리 동물의 이중 조직. 장점으로 인해 생체 내 혜성의 분석은 현재의 가늠자 조정에 국제 회의 (ICH) (3)과 유럽 식품 안전청에서 제품의 안전성 평가를 수행하기위한 (생체 내 소핵 분석과 쌍) 두 번째 생체 내 유전 독성 분석 (EFSA로 추천 ) 4 규제 지침. 우리가 실험실에서, 우리는 음식 재료, 의약품, 나노 물질 5-10에 의한 생체 내 DNA 손상을 평가하기위한 분석을 사용했다. 쥐 간 이러한 프로토콜의 예로서 사용되지만, 혜성 분석은 실험 동물의 다른 조직 / 기관만큼 조직으로부터 단리 할 수있다 그대로 단셀로 수행 될 수있다.
DNA 손상의 특정 타입은 염기성 알칼리 혜성 시험을 수정하지 않고 DNA 가닥 나누기로 검출하기 어렵다. 산화성 DNA 손상의 경우에, 스트랜드 Breaks은 같은 8 oxoguanine (8 oxoGua) 및 메틸 fapy – 구아닌 (11)에서 휴식을 만들어 인간의 8-oxoguanine-DNA-N-글리코 1 (hOGG1, 같은 수리 효소로 소화에 의해 DNA의 산화 적 병변에서 만들 수 있습니다. 또한, 효소 III (엔도 III)의 산화 피리 미딘 1 주로 휴식을 생성한다. 따라서, 효소 분해 단계의 추가가 분석을 생체 (12)의 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 구체적이고 민감한 방법을한다. 이러한 분석을 활용, 우리는 증명하고있다 쥐와 생쥐 6-8의 간에서 쥐 (10)의 중심부에 독성 물질에 의한 산화 적 DNA 손상.
시험관 내에서 민감한에 의해 식별 genotoxins에 대한 생체 분석에서 후속는 3,13 테스트로 1), 2) 여러 조직에서 생체 이물에 의한 DNA 손상의 메커니즘을 평가하기 : 알칼리 혜성 분석은 유전 독성과 인간 생체 모니터링에 많은 응용 프로그램이 있습니다 14 3)하면 조사발암 물질, 4), 5) 사람의 질병 직업적 노출 (16)을 조사하고 DNA 손상을 복구 (15)을 평가하기 위해 유전자 독성 또는 동작의 비 유전 독성 모드 (MOA) (7)를 사용하여 동작 6)에 대한 잠재적 인 높은 처리량 스크리닝 검사로서 기관 고유의 유전 독성 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 쥐의 간에서 모두 직접 산화 DNA 손상의 동시 측정을 설명합니다. 일반적인 프로토콜 (즉, DNA 손상되지 테스트 에이전트하지만 동물 조직의 취급 및 가공에 의해 유도 된) 단일 세포 또는 핵 최소 처리 유도 된 DNA 손상과 분리 될 수있는 모든 조직에 적용 할 수있다. 우리의 연구에서는 골수 7,9, 위 (6), 신장 (9), 방광 (9), 폐 <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
Materials
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels, (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the ‘comet’ assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
