כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral
Summary
Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.
Abstract
Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.
Introduction
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקת מעבדה סטנדרטית עבור זיהוי של חלבון בתוך רקמות, IHC עדיין נעשה שימוש נרחב הוא במחקר והן פתולוגיה אבחון. ההערכה של מכתים IHC היא בדרך כלל חצי כמותית, החדרת הטיה פוטנציאלית לתוך פרשנות של תוצאות. רבי גישות וכמותיות פותחו אשר משלבות הוא בעצמה מכתימה והיקף מכתים לתוך אבחנה סופית 1-4. מערכות אחרות כוללות עוצמת ניקוד ומיקום subcellular כדי למקם טוב יותר ביטוי 5. התאגדות של ממוצע ציונים של צופים רבים לעתים קרובות מנוצלת כדי למזער את ההשפעות של צופה יחיד הטיה 6. למרות מאמצים אלה, הסובייקטיביות ניתוח עדיין נשאר, במיוחד כאשר אנו מעריכים את מידת מכתים 7. סטנדרטיזציה פרוטוקול וסובייקטיביות מזעור מכניסת האדם הוא בעל חשיבות עליונה ליצירת תוצאות IHC מדויק, לשחזור.
תוכן "> ישנן אפשרויות אחרות מלבד IHC לקביעת ביטוי חלבון בתוך רקמות. בתוך מערך המחקר, אימונוהיסטוכימיה נצפתה באופן מסורתי כאמצעי לבחון חלבון לוקליזציה 8, ואילו טכניקות אחרות כגון immunoblotting נתפסות תקן זהב על חקירת ביטוי חלבון . רקמת קביעה או תא תא ספציפי ביטוי קשה בלי שילוב של טכניקות מתקדמות כגון לכידת ליזר חלוק או תא microdissection 9,10. שימוש נוגדני ניאון בשקופיות רקמות מציע פשרה סבירה, אבל autofluorescence רקע בשל NADPH, lipofuscins, רשתי סיבי קולגן, ואלסטין יכול לעשות quantitation מדויק קשה 11.פלטפורמות פתולוגיה חישובית אוטומטיות הן כיוון מבטיח אלקטרוני כדי לכמת את המטרה יותר של מכתים פתולוגיה 12-15. שילוב הדמיה multispectral עם microarrays רקמותמאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של ביטוי חלבון מדגם גדולה. בעזרת שיטות אלה, ניתוח של שיתוף לוקליזציה חלבון, ההטרוגניות מכתימים, ורקמות ולוקליזציה subcellular אפשרי תוך צמצום ניכר הוא הטיות מובנהיות וסיכון זמן דרוש לניתוח, תוך חזרת נתונים רציף ולא 16 בפורמט הקטגורים. לכן, מטרת המחקר הנוכחי הייתה להדגים את התועלת של ומתודולוגיה לביצוע אימונוהיסטוכימיה מרובב עם ניתוח, באמצעות תוכנת הדמיה multispectral.
פרוטוקול זה נכתב עבור ידני, מכתים immunohistochemical זמני של שקופית קטע רקמה אחת עם ארבעה נוגדנים חד שבטיים מותאמים. כניסוי נציג, אלפא קולטן אסטרוגן נגד ארנב גרעיני (ERα) ו קולטן האנדרוגן (AR) הם multiplexed עם קרום הנכנס אנטי עכבר CD147 קרום הנכנס אנטי עכבר E-cadherin. כל נוגדן של בחירה עשוי להיות substitutאד עבור הנוגדנים המפורטים להלן, אבל כל שילוב של נוגדנים דורש אופטימיזציה נפרד. טיפול קדם לכל הנוגדנים חייב להיות זהה. נוגדני AR ו CD147 צריכים להיות מותאמים באופן אינדיבידואלי ולאחר מכן כמו קוקטייל. כל נוגדן מזוהה באמצעות מערכת פולימר ללא ביוטין ואחד 4 chromogens ייחודי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש אימונוהיסטוכימיה מסורתיים להערכת ביטוי החלבון הוא מוגבל על ידי שיטות סובייקטיביות, וכמותיות של ניתוח 22,23. פלטפורמות Advance נוצרו לניתוח תפוקה גבוהה הביטוי ולוקליזציה סמן ביולוגי. פילוח מפורט של שתי רקמות ותאים subcellular מאפשר למשתמשים ללמוד ביטוי סמן ביולוג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים אוניברסיטת יוזמות Translational מחקר ויסקונסין במעבדה לפתולוגיה, שנשען בחלקו על ידי UW המחלקה לפתולוגיה המעבדה לרפואה CA014520 P30 UWCCC מענק עבור שימוש במתקנים ושירותיה.
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating:Health – 0, Fire – 3 , Reactivity-0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating:Health – 0, Fire –1 , Reactivity-0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating:Health – 1, Fire –0 , Reactivity-0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
| Diva Decloaker | Biocare Medical | DV2004 | This product has been classified as non‐hazardous based on the physical and/or chemical nature and/or concentration of ingredients. |
| Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | NUANCEEX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |
References
- Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
- Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
- McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
- Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
- Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
- Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
- Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
- Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
- Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
- Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102 (2014).
- Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
- Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549 (2015).
- Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
- Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).
