Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.
Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.
A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica de laboratório padrão para a detecção de proteína dentro do tecido, e IHC ainda é largamente utilizado tanto em pesquisa e de diagnóstico da patologia. A avaliação da coloração IHC é frequentemente semi-quantitativa, a introdução de potencial de polarização para interpretação dos resultados. Muitas abordagens semi-quantitativos foram desenvolvidos que incorporam tanto a intensidade da coloração e medida coloração em diagnóstico final 1-4. Outros sistemas incluem intensidade de pontuação e localização subcelular, a fim de melhor localizar a expressão 5. Incorporação de pontuações médias de vários espectadores é frequentemente utilizada, a fim de minimizar os efeitos da polarização único espectador 6. Apesar destes esforços, a subjetividade na análise ainda permanece, particularmente quando se avalia o grau de coloração 7. padronização do protocolo e minimizando a subjetividade da entrada humana é fundamental para a criação, resultados IHC reprodutíveis precisos.
conteúdo "> Há outras opções além de IHQ para determinar a expressão de proteínas no interior de tecidos. Dentro do contexto de investigação, a imunohistoquímica tem sido tradicionalmente considerado como um meio para analisar localização da proteína 8, enquanto que outras técnicas, tais como imunotransferência são vistos como padrão de ouro para investigar a expressão da proteína . tecido Determinar ou expressão específica do compartimento da célula é difícil sem incorporar técnicas avançadas, como fracionamento celular ou captura a laser microdissecção 9,10. O uso de anticorpos fluorescentes em lâminas de tecido oferece um compromisso razoável, mas o fundo autofluorescência devido à NADPH, lipofuscins, reticular fibras, colágeno e elastina pode fazer uma quantificação precisa difícil 11.Plataformas de patologia computacionais automatizados são uma direção promissora para a quantificação mais objetiva da coloração patologia 12-15. Combinando imagens multiespectrais com microarrays de tecidofacilita a análise de alto rendimento de expressão da proteína em grandes tamanhos de amostra. Com estas técnicas, a análise de co-localização de proteínas, a heterogeneidade coloração e tecidos e localização subcelular é possível, reduzindo substancialmente os preconceitos e tempo necessário para análise inerentes, ao retornar dados de uma contínua em vez de formato categórica 16. Por conseguinte, o objectivo do presente estudo foi demonstrar a utilidade da metodologia e imuno-histoquímica para a realização de análises com multiplexado, utilizando software de imagem multi-espectral.
Este protocolo é escrito para coloração imuno-histoquímica manual, o multiplex de uma única secção de tecido de slides com quatro anticorpos monoclonais otimizados. Como uma experiência representativa, de coelho anti-alfa nuclear do receptor de estrogénio (RctE) e o receptor de androgénio (AR) são multiplexados com anti-rato de CD147 ligado à membrana e ligada à membrana anti-ratinho de E-caderina. Qualquer anticorpo de escolha pode ser Substituted para os anticorpos aqui listadas, mas cada combinação de anticorpos requer otimização separada. Pré-tratamento para todos os anticorpos têm de ser idênticos. Os anticorpos de AR e CD147 deve ser optimizado individualmente e, em seguida, como um cocktail. Cada anticorpo é detectado usando um sistema de polímero livre de biotina e um de 4 cromogénios exclusivos.
A utilização de imuno-histoquímica tradicional para avaliar a expressão de proteínas é limitado por métodos subjectivos, semi-quantitativos de análise 22,23. plataformas de avanço de ter sido criado por análise de alto rendimento de expressão de biomarcadores e localização. segmentação detalhada de ambos os tecidos e compartimentos subcelulares permite aos usuários estudar a expressão de biomarcadores, localização e co-localização com outros marcadores de interesse. Em estudos anteriores,…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem à Universidade de Wisconsin Translational iniciativas de investigação no laboratório de patologia, em parte apoiado pelo Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial UW e concessão UWCCC P30 CA014520, para o uso de suas instalações e serviços.
Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating:Health – 0, Fire – 3 , Reactivity-0 |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating:Health – 0, Fire –1 , Reactivity-0 |
Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating:Health – 1, Fire –0 , Reactivity-0 |
Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
Diva Decloaker | Biocare Medical | DV2004 | This product has been classified as non‐hazardous based on the physical and/or chemical nature and/or concentration of ingredients. |
Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
Nuance software | PerkinElmer | NUANCEEX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |