Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.
Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.
Immunohistochemie (IHC) is een standaard laboratorium techniek voor detectie van eiwitten in weefsel en IHC nog veel gebruikt in zowel onderzoek als diagnostische pathologie. De evaluatie van IHC kleuring is vaak semi-kwantitatieve, de invoering van mogelijke vertekening in de interpretatie van de resultaten. Veel semikwantitatieve benaderingen ontwikkeld die zowel kleurintensiteit en kleuring mate nemen in einddiagnose 1-4. Andere systemen omvatten scoring intensiteit en subcellulaire locatie om expressie 5 beter te lokaliseren. Opname van de gemiddelde scores van de verschillende kijkers wordt vaak gebruikt om de effecten van één kijker vertekening 6 minimaliseren. Ondanks deze inspanningen subjectiviteit analyse blijft, met name wanneer zij de mate van kleuring 7. Protocol standaardisatie en het minimaliseren van de subjectiviteit van de menselijke inbreng is van cruciaal belang voor het creëren van accurate, reproduceerbare IHC resultaten.
content "> Er zijn andere opties naast IHC voor het bepalen van proteïne expressie in weefsels. In het onderzoek instelling is immunohistochemie traditioneel beschouwd als middel om eiwit lokalisatie 8 onderzoeken, terwijl andere technieken zoals immunoblotting worden beschouwd als gouden standaard voor het onderzoeken eiwitexpressie . Bepaling weefsel of cel compartiment-specifieke expressie is moeilijk zonder integratie van geavanceerde technieken zoals mobiele fractionering of laser capture microdissectie 9,10. Het gebruik van fluorescente antilichamen op weefselobjectglaasjes biedt een redelijk compromis, maar achtergrond autofluorescentie door NADPH, lipofuscins, reticulaire vezels, collageen en elastine kunnen accurate kwantificering lastig 11 te maken.Geautomatiseerde computationele pathologie platformen zijn een veelbelovende richting voor meer objectieve kwantificering van pathologie kleuring 12-15. De combinatie van multispectrale beeldvorming met weefsel microarraysfaciliteert high-throughput analyse van eiwitexpressie in grote steekproefomvang. Bij deze technieken analyse van eiwit-co-lokalisatie, kleuring heterogeniteit en weefsel- en subcellulaire lokalisatie mogelijk terwijl zowel inherente vooroordelen en tijd voor analyse aanzienlijk verminderen, terwijl terugkeer data in een continu plaats categorische indeling 16. Daarom was het doel van deze studie naar het nut van en de methodologie voor het uitvoeren van multiplex-immunohistochemie met de analyse, het gebruik van multispectrale imaging software te demonstreren.
Dit protocol is geschreven voor handmatige, multiplex immunohistochemische kleuring van een weefselsectie dia met vier geoptimaliseerde monoklonale antilichamen. Als representatief experiment, kern anti-konijn oestrogeen receptor alpha (ERa) en androgeenreceptor (AR) gemultiplext met membraangebonden anti-muis CD147 en membraangebonden anti-muis E-cadherine. Elk antilichaam van keuze kan worden substituted voor de hierin genoemde antilichamen, maar elke combinatie van antilichamen vereist afzonderlijke optimalisatie. Voorbehandeling van alle antilichamen identiek zijn. De AR en CD147 antilichamen moet individueel en vervolgens worden geoptimaliseerd als een cocktail. Elk antilichaam wordt gedetecteerd met een biotine-vrij polymeersysteem en één van 4 unieke chromogenen.
Het gebruik van traditionele immunohistochemie gaan eiwitexpressie wordt beperkt door subjectieve, semi-kwantitatieve analysemethoden 22,23. Advance platforms zijn gemaakt voor high-throughput analyse van biomarker expressie en lokalisatie. Gedetailleerde segmentatie van zowel weefsel en subcellulaire compartimenten kunnen gebruikers biomarker expressie, lokalisatie, en co-lokalisatie te studeren met andere markers van belang. In eerdere studies hebben we het nut van IHC en multispectrale, vooral wanneer gebr…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken de Universiteit van Wisconsin Translational Research Initiatives in Pathologie laboratorium, mede ondersteund door de UW afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde en UWCCC subsidie P30 CA014520, voor het gebruik van de faciliteiten en diensten.
Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating:Health – 0, Fire – 3 , Reactivity-0 |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating:Health – 0, Fire –1 , Reactivity-0 |
Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating:Health – 1, Fire –0 , Reactivity-0 |
Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
Diva Decloaker | Biocare Medical | DV2004 | This product has been classified as non‐hazardous based on the physical and/or chemical nature and/or concentration of ingredients. |
Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
Nuance software | PerkinElmer | NUANCEEX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |