Protocol
Diergeneeskundig gebruik en welzijn moeten zich houden aan de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren volgende protocollen beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Mouse weefselmonsters werden verstrekt door medewerker Dr. Chuanbin Mao.
1. Mouse Tissue afdeling Voorbereiding
- Plaats geheel muis betreffende orgaan (hersenen, nier, lever, etc.) in het midden van een kleine plastic's (bijvoorbeeld 12-well celcultuur plaat) en onder in weefselverwerkingsproces verbinding tot ongeveer 10 mm bedraagt. Zorg ervoor dat er geen bel gevormd in het weefsel verankeren verbinding en dat het orgaan wordt geplaatst in de gewenste oriëntatie (bijv sagittale, coronale, etc.).
- Onmiddellijk plaats weefsels in vloeibare stikstof voor Snelkoeling. Voor de lange termijn opslag, slaan de bevroren monsters in een -80 ° C vriezer.
- Neem de bevroren muis orgel en ontdooien tot -15 ° C in een temperaopnieuw gecontroleerd cryomicrotoom.
- Secure weefsel op een stalen basis met ongeveer 500 ui weefselverwerkingsproces verbinding en plaats op een cryomicrotoom snijden monteren zodat de gewenste oriëntatie snijden wordt aan het mes.
- Gedeelte van het weefsel een 12 urn dik. Plaats coupes weefsel plakjes op polycarbonaat microscoop dia's en laten drogen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor de lange termijn opslag, slaan de bevroren dia in een -80 ° C vriezer.
2. Cell Culture
Opmerking: Celkweek werd uitgevoerd in bioveiligheidskast (Biosafety Level II) onder steriele omstandigheden. HeLa-cellijn werd gebruikt als een modelsysteem, en cellen werden gekweekt in compleet kweekmedium met de volgende gebruikelijke protocollen:
- Warm reagentia (bijvoorbeeld trypsine, fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en celkweekmedium) aan 37 ° C.
Opmerking: De cel kweekmedium bevat anorganische salts, aminozuren, vitaminen en anderen. Voor een volledige lijst van bestanddelen, wordt verwezen naar de formulering van de fabrikant. - Verkrijgen celmonster (bijvoorbeeld 1 ml celsuspensie HeLa) toevoegen aan 9 ml volledig celkweekmedium in een standaard 10-cm celkweekplaat. Het aanvankelijke aantal cellen ongeveer 0,5 x 10 6 cellen / ml. Houd in kweek bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2-3 dagen tot de groeiende oppervlak bedekt bij 70-80% van de celcultuurplaat. Record cel passage nummer voor elke opeenvolgende toer.
- Voer cel passage (dwz cel splitsen) in de celkweek plaat.
- Aspireren groeimedium en gebruik 5 ml 1x PBS aan de cellen te spoelen. Verwijderen PBS met een steriele opzuigpunt en incubeer de cellen met 2,5 ml trypsine (0,25%) gedurende ~ 5 min bij 37 ° C om de cellen los te maken van de kweekplaat.
Opmerking: De werkelijke trypsine behandelingstijd moeten worden geoptimaliseerd op basis van de specifieke trypsine product gekocht van de fabrikant. Inadequate behandelingstijd laat de cellen gehecht aan de plaat, terwijl overmatige behandeling leidt tot celdood. - Stop trypsine activiteit door toevoeging 7,5 ml compleet celkweekmedium, en vervolgens gelijkmatig resuspendeer de cellen (totaal volume 10 ml). Gebruik de cel suspensie voor cultuur (stap 2.2) of bereiding van SCMS monsters (stap 2.4).
- Aspireren groeimedium en gebruik 5 ml 1x PBS aan de cellen te spoelen. Verwijderen PBS met een steriele opzuigpunt en incubeer de cellen met 2,5 ml trypsine (0,25%) gedurende ~ 5 min bij 37 ° C om de cellen los te maken van de kweekplaat.
- Bereid de cel monsters voor SCMS experimenten.
- Plaats individuele micro dekking dia's in een 12-well plaat en voeg 1,8 ml celkweekmedium en 0,2 ml celsuspensie in de put.
- Meng cellen onder zacht roeren van de plaat en incubeer in een 5% CO2 omgeving bij 37 ° C gedurende ~ 24 uur. Om behandeling met geneesmiddelen uit te voeren om de gekweekte cellen, voeg een geneesmiddelverbinding-oplossing (bijvoorbeeld in DMSO (dimethylsulfoxide)) in 12-well celkweek plaat.
Opmerking: De uiteindelijke geneesmiddelconcentratie (bijvoorbeeld, 10 nM, 100 nM, 1 uM en 10 uM) en tB EHANDELING af (bijvoorbeeld 4 uur) worden naar gelang van het specifieke doel van de studies. Cellen worden aan de micro dekglaasjes en klaar voor de CSMS experimenten (stap 6).
3. Single-probe Fabrication
- Plaats de dual-boring kwarts buis (binnendiameter (ID) 127 micrometer, buitendiameter (OD) 500 pm) in een laser micropipet trekker en trek een dual-bore kwarts naald. Gebruik de volgende parameters als uitgangspunt: Warmte = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del = 150, en Pul = 250 (alle eenheden zijn eenheden van de fabrikant). Zorg ervoor dat de trok dual-bore kwarts naald heeft een taps toelopende tip voor een optimale probe eigenschappen. Snijd de trok tip zodat er ~ 5 mm lang van unpulled dual-bore kwarts capillaire linksaf aan de andere kant.
Opmerking: De feitelijke parameters van de laser trekker moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van de specifieke omstandigheden van het instrument. - Snijd een ~ 80 mm doorsnede van fused silica capillair (ID 40 pm, OD. 105 pm) als het oplosmiddel verstrekken van capillaire, en plaats deze in een boring op het platte uiteinde van de dual-boring kwarts naald.
- Snijd een mm sectie ~ 40 van fused silica capillair (ID 40 pm, OD 105 pm) en het gebruik van een scheermes te scheren ~ 5 mm van de polyimide coating van het middelpunt. Gebruik een propaan vlam om snel te verwarmen en trek het gefuseerde capillaire in een nano-elektrospray ionisatie (ESI) zender met een fijne taper. Snijd een nano-ESI emitter (~ 7-10 mm lang), en plaats deze in de andere boring op het platte uiteinde van de dual-boring kwarts naald. U kunt ook gebruik maken van de laser trekker tot een boete taper te produceren.
- Breng een minimale hoeveelheid (~ 1-2 pi) UV uithardende hars op de vlakke voorzijde van de dual-boring kwarts naald en stollen de hars met een LED UV lamp voor ~ 20 seconden om het oplosmiddel te verzekeren verschaffen capillair en nano- ESI emitter. De procedures voor de afzonderlijke delen in één-probe assembleren getoond in figuur 1a.
- Snijd een standaard microscoop glass slide (1 "x 3") in de lengte doormidden. Plaats de single-probe op een einde van het glaasje zodat de nano-ESI emitter naar buiten gericht. Breng de reguliere epoxy om het lichaam van de enkel-sonde, zodat het wordt bevestigd aan het glaasje (Figuur 1b). Laat 's nachts voor verharding. Stel de gefabriceerde één probe met geïntegreerde interne probe opstelling (figuur 1c), waarbij een massaspectrometer is verbonden zoals geïllustreerd in figuur 1D.
4. Bouw de geïntegreerde Single-probe MS Setup
- Wijzig de ionenbron-interface flens van de massaspectrometer en fabriceren de standaard (met instelbare positie en hoogte) van de digitale stereoscoop (figuur 1e en 1f).
- Boor een ionenbron-interface flens met twee gaten waardoor de bevestiging van een aluminium optische board. Maak een dia rail apparaat en een hoogteverstelling stang (verbonden aaneen XY podium voor fine tuning stand), zodat de digitale stereoscoop systeem kan worden bevestigd aan de aluminium optische plaat (figuur 1e).
- Bevestig de gewijzigde digitale stereo microscoop, een digitale USB microscoop, een miniatuur handmatig XYZ vertaling podium met een flexibele klem houder, de gemotoriseerde XYZ vertaling stadium systeem om de aluminium optische bestuur, dat op de aangepaste ionenbron-interface flens van de massaspectrometer is gemonteerd (figuren 1c en 1f). Met de flexibele klem houder naar glasplaatje bevestigd met een enkele probe bevestigen.
- Bevestig de single-probe setup om de massaspectrometer (figuur 1f). Pas de flexibele klemhouder en de miniatuur XYZ fase met de emitter van de single-probe plaatsen voor de ingang van de massaspectrometer. Gebruik de USB digitale microscoop (met verstelbare kijkhoek) aan de kant van de single-sonde naar een ingezoomd beeld van de single-p biedenrobe tip of nano-ESI emitter en de digitale stereoscoop (met instelbare hoogte) boven de enkelvoudige sonde naar de cellen en de sondepunt bekijken.
Let op: Het gebruik van de overeenkomstige ionenbron flens, kan deze geïntegreerde single-probe-systeem worden gekoppeld aan andere vormen van massaspectrometers uitgerust met ambient ionisatie bronnen.
5. Ambient MSI
- Ontdooi de sectie monster bij kamertemperatuur en plaats het op de gemotoriseerde XYZ translatietrap systeem onder de één-probe. Pas de monsterpositie door verandering van de coördinaten in de besturingssoftware.
- Met de spuit om de bemonstering oplosmiddel pomp met een geschikte snelheid (bijvoorbeeld 0,2 ul / min) is en daarbij het ionisatiespanning (bijvoorbeeld 5 kV). De selectie van de bemonstering oplosmiddel is flexibel, en de voorkomende omvatten MeOH: water (9: 1) en acetonitril. Het dode volume van de nano-ESI emitter werd geschat op ~ 3 nl en de tijd tussen de probe-surfa zijnce contact en ion signaal observatie is meestal minder dan 1 seconde 15.
Opmerking: De aangepaste ionenbron-interface flens kan de ionisatie spanning verlost te worden van de massaspectrometer een geleidende Unie door middel van een krokodil clip. De ionisatie spanning wordt dan overgedragen via een geleidende vakbond om het oplosmiddel in de capillaire en de single-probe kanalen, en toegepast op de nano-ESI emitter in de steekproef opgenomen analyten ioniseren. Zorg ervoor dat de ionisatie spanning wordt uitgeschakeld bij het aansluiten van de krokodil clip met de geleidende vakbond. - Stel de hoogte van de één-sonde zodat het rust net boven het oppervlak van het monster en kunnen oppervlakte-extractie van metabolieten voeren. Til de Z-stage, en gebruik vervolgens de USB digitale microscoop (aan de kant van de single-sonde) om de wijziging afstand tussen de single-sonde en het oppervlak weefsel te controleren. Monitor veranderingen in de massa spectrum tijdens deze hoogteverstelling, en stoppen met lifting de Z-fase waarin een verandering van de ionen signaal van oplosmiddel achtergrond weefsel metabolieten waargenomen.
- Herhaal stap 5.3 drie keer op drie verschillende punten in het stadium besturingsprogramma voor de geautomatiseerde oppervlak afvlakking aanpassing. Plaats het uiteinde van de één-probe op drie punten op het monsteroppervlak op een afstand van ongeveer 10 mm van elkaar. Voer hoogteverstelling door op de omhoog en omlaag iconen, en sluit de drie punten in de juiste positie in het kader van het "Plan-methode".
- Stel andere parameters voor rastering over de sectie van belang in het monster met behulp van dit programma. Voor de muis nieren secties hier wordt gepresenteerd, gebruik maken van een 10,0 um / sec rastering snelheid en 20 urn afstand tussen de lijnen. De gemotoriseerde fase systeem heeft een 0,1 urn minimum increment beweging. De afstand tussen de enkelvoudige sonde en weefsel wordt verkregen uit stap 5.3.
- Stel een werkwijze voor de automatische verwerving van MS spectra van de massaspectrometer. for massa resolutie hoog MSI op de muis nier monster, gebruikt u de volgende parameters: massa resolutie 60.000 (m / Δm), ~ 5 kV positieve modus, 1 microscan, 150 msec max injectie tijd en AGC op. Alle verkregen MS spectra die individuele lijnen van het beeld MS hadden hetzelfde aantal scans uniforme tijdsafstand tussen elke scan, wat aangeeft dat de pixel grootte voor de gevormde beelden gelijkmatig verspreid.
- Start de MSI data-acquisitie. Start de MS overname volgorde voor de massaspectrometer, en dan starten de rastering volgorde voor de XYZ-besturingsprogramma.
- Bijvoorbeeld, in de MS data-acquisitie programma hier gebruikt, gaat u naar "Sequence setup", selecteer "New sequentie", het genereren van een set van bestanden voor een nieuwe volgorde genummerd van 01 tot en met X, waarbij X het aantal lijnen wordt gebruikt voor de image gewenste MS moeten worden genomen, en druk vervolgens op "Run sequentie".
- Gebruik een zelfgemaakte elektronisch apparaat, zodat de software om een conta producerenct sluiting signaal voor de massaspectrometer om de gegevens te verzamelen. Het schema wordt getoond in de figuur aanvullende (figuur S1) als referentie.
- Construct MS beelden van ruwe MS-bestanden met behulp van geschikte MSI visualisatiesoftware. Bijvoorbeeld, bij gebruik van de software per groep Laskin's ontwikkeld op PNNL 17, voert u de volgende stappen.
- Klik op 'Brows File. " Selecteer het eerste bestand verkregen uit de MSI experiment. Geef aan waar het bestand begint en eindigt bij 'Aantal lijnen. " Selecteer een bereik van m / z waarden voor de MS beeld bereik van minder dan "Enter MZ Range".
- Druk op de knop "Start" om het beeld creatie proces te starten. Zodra imago van de MS is gemaakt, klikt u op "Afbeelding opslaan" onder "Toolbar" om beelden in de computer op te slaan.
6. In situ live SCMS
- Setup de single-probe systeem per instruerenionen voor MSI. Stel het oplosmiddel (bijvoorbeeld MeOH / H2O of acetonitril) stroomsnelheid (bijvoorbeeld ~ 25 nl / min).
- Was de gekweekte cellen, die zijn bevestigd op de micro dekglas dia's, met PBS om de culturele media en extracellulaire drug componenten te verwijderen. Plaats cel met glasplaatje op de gemotoriseerde XYZ vertaling podium voor experiment.
Let op: U kunt ook de verse celkweekmedium (zonder dat foetaal bovine serum) aan de gekweekte cellen te spoelen. Minder ion onderdrukking is waargenomen. Bovendien kunnen cellen overleven langere tijd tijdens het experiment waar de omgevingstemperatuur (~ 20 ° C) is significant lager dan de kweektemperatuur (37 ° C). Het type geneesmiddel, oplossingsconcentratie en behandelingstijd varieert in verschillende studies. - Stel het digitale stereomicroscoop (boven het monster) op de punt van de enkele-sonde celpenetratie controleren tijdens de analyse. Gebruik de USB digitale microscoop (op de side van de single-sonde) aan de werkomstandigheden van de nano-ESI emitter op de single-sonde te controleren.
- Gebruik de gemotoriseerde XYZ podium controleprogramma en digitale stereo microscoop (boven cellen) om een cel van belang te lokaliseren, en nauwkeurig de positie van de single-sonde boven het monster. Start MS data acquisitie voor de tip één sonde in de cel wordt ingebracht.
- Gebruik de volgende parameters als referentie voor MS analyse met behulp van een hoge resolutie massaspectrometer: massa resolutie 100.000 (m / Δm), ~ 3 kV positieve en negatieve mode, 1 microscan, 150 msec max injectie tijd, AGC-modus op. Geautomatiseerde overname van MS spectra wordt gedaan door te klikken op "Start" in de MS data-acquisitie programma.
- Til de gemotoriseerde Z-fase door te klikken op het pictogram om het celmembraan binnendringen en houdt het opnemen van het MS signaal gegenereerd uit de cel. Een tijdsvertraging van 1-2 seconden wordt meestal waargenomen tussen de probe en het inbrengen MS signaaldetectie. De andere bevestigdcelpenetratie, een dramatische verandering van het MS signalen kunnen worden waargenomen bij de penetratie van het celmembraan. De MS signalen van intracellulaire verbindingen die gewoonlijk kan duren voor ~ 15-20 seconden voordat een significante daling.
- Lager in de cel met plaat om de tip één probe trekken uit de cel. Het duurt meestal <15 seconden voor het ion signalen van de cellulaire verbindingen aan het geluidsniveau benaderen. Het oplosmiddel flow voor ~ 3 min volledig de single-probe spoelen. Ondertussen, de positie van de gemotoriseerde XYZ podium systeem naar de volgende cel te lokaliseren te worden geanalyseerd. Elke cel experiment vereist ~ 3 min worden bereikt.
Representative Results
De single-probe werd met succes gebruikt voor de analyse van MSI omgevingstemperatuur doorsnede muis nierweefsel 15. Het apparaat maakt gebruik van het mechanisme van oppervlaktevloeistof micro-extractie (figuur 1a), die zeer efficiënt analyt extractie uit een klein gebied verschaft, waardoor voorkomende ion signalen intensiteiten in de MSI resultaten. Zo hebben de signaalintensiteiten van meer dan 10 7 bereikt voor bepaalde overvloedige metabolieten (Figuur 2a). Een groot aantal metabolieten werden gedetecteerd op deze wijze, waaronder een aantal sfingomyeline (SM) en fosfatidylcholine (PC) soorten als [SM (34: 1) + Na] + (725,5575 m / z) [PC (32: 0) + H] + (734,5700 m / z) [PC (34: 1) + Na] + (782,5696 m / z), en [PC (38: 5 + Na)] + (814,5726 m / z). Deze verbindingen werden geïdentificeerd met een hoge massa resolutie en nauwkeurigheid van massa's wanneer gekoppeld to een hoge resolutie massaspectrometer. Zo werd de identificatie bereikt met minder dan 4 ppm m / z massanauwkeurigheid (dat wil zeggen het verschil tussen de waargenomen en theoretische waarden) voor elke metaboliet (figuur 2b) in hier gepresenteerde resultaten. Bovendien, tandem MS-analyses (dwz, MS / MS) werden ook uitgevoerd voor meer vertrouwen identificeren van de soorten van belang. 15
Door de mogelijkheid van het uitvoeren van efficiënte vloeibare micro-extractie op een klein gebied, kan de interne-probe apparaat worden gebruikt om een hoge ruimtelijke resolutie MSI experimenten onder omgevingsomstandigheden 15. Zo zijn gedetailleerde MS afbeeldingen muizennier secties verkregen illustreert de ruimtelijke verdeling van geselecteerde metabolieten (figuur 2c). De ruimtelijke resolutie van het beeld MS werd bepaald op 8,5 urn na het veelgebruikte gegeven van het hebben van de transiti. op punt van een scherp functie bepaald binnen een 20-80% intensiteit verandering van het signaal MS 18 Bij fosfolipide [PC (38: 5 + Na)] + op de muizennier gedeelte, de functie overgang tussen de binnenste medulla en de buitenste merg plaatsvindt over een scan cyclus in de chronogram, waarin een intensiteit verandering groter dan 20-80% bereik. Gebaseerd op het monster bewegingssnelheid (10,0 um / sec) en MS-gegevens opnamesnelheid (0,85 sec / spectrum), het monster bewegingsafstand in een MS scancyclus (8,5 urn), dat wil zeggen, de MSI ruimtelijke resolutie, kan worden berekend (Figuur 2d). Deze ruimtelijke resolutie is een van de hoogste nog bereikt voor ambient MSI technieken uitgevoerd op biologische monsters.
Voor SCMS was één probe kan de analyse van afzonderlijke levende HeLa cellen 16 bereikt. De tip grootte van de interne probe is gewoonlijk minder dan 10 um (Figure 3a), die klein genoeg is direct in te voegen in vele typen eukaryote cellen, waarvan de diameter ~ 10 um, voor de extractie en MS analyse. Het inbrengproces van de single-sondepunt in een cel kan visueel gevolgd worden met een digitale stereomicroscoop (figuur 3b) en het celmembraan penetratie kan worden bevestigd door middel van de snelle en significante verandering van massaspectra van PBS (of vers celkweek gemiddeld) intracellulaire verbindingen (figuren 3c en 3d). De experimenten in zowel positieve als negatieve ion modus worden uitgevoerd om bredere types moleculaire species te detecteren. Zo werden 18 verschillende soorten lipiden die in de positieve modus, zoals sfingomyelinen (SM) en fosfatidylcholinen (PC), terwijl adenosine fosfaten (AMP, ADP en ATP) werden in de negatieve ion modus (figuren 3c en d) gedetecteerd. De vertraging tussen de single-sonde inbrengen into een cel en het signaal detectie was typisch minder dan twee seconden, waardoor een bijna real-time detectie van cellulaire metabolieten. SCMS werd ook toegepast op experimenten waarbij de cellen werden behandeld met geneesmiddelen tegen kanker (bijvoorbeeld OSW-1, paclitaxel en doxorubicine) 19]. De overeenkomstige geneesmiddelen kan worden gedetecteerd in HeLa-cellen na 4 uur behandeling in een reeks concentraties (dat wil zeggen, 10 nM, 100 nM, 1 uM en 10 uM) in DMSO (dimethylsulfoxide) met de onbehandelde cellen (alleen toevoegen DMSO ) als controles. De MS signalen van drugs waren niet aanwezig in de extracellulaire of PBS controle (figuur 3e), maar waren gedetecteerd in de afzonderlijke cellen met behulp van de single-probe MS techniek (alleen 100 nM behandeling resultaten worden getoond in figuur 3f). Omdat cellen werden gespoeld met PBS (of verse celkweekmedium) aan extracellulaire verbindingen en verontreinigingen te verwijderen, de detectie van endogene metabolieten (bijvoorbeeld een cel lipidend adenosine fosfaten) en exogene verbindingen (bijvoorbeeld geneesmiddelen tegen kanker) geeft aan dat de interne-probe MS techniek kan worden gebruikt om intracelluaire analyseren.
Figuur 1. Fabricage en configuratie van de single-probe voor ambient MSI en SCMS analyse. A) procedures Fabrication van de single-sonde. B) Foto van een gefabriceerde single-probe bevestigd aan een glasplaatje. C) Foto van de single- probe opstelling bevestigd aan een massaspectrometer. d) Diagram van de interne probe-opstelling gekoppeld aan een massaspectrometer. Tijdens een experiment, wordt de bemonstering oplosmiddel continu ontvangen van de spuit, wordt de ionisatie spanning op de geleidende eenheid van de massaspectrometer worden twee digitale microscopen monster plaatsing controleren, de gemotoriseerde XYZ stadiumsysteem wordt gebruikt om het monster Motion Control, en een massaspectrometer wordt gebruikt voor de analyse. e) Foto van de aangepaste digitale stereoscoop systeem. f) Foto die de digitale stereoscoop door een optische board aan de ionenbron-interface flens. Klik hier om bekijk een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Resultaten van een omgevingstemperatuur MSI studie van een muis nier sectie met een hoge ruimtelijke en massa-resolutie. A) Een vertegenwoordiger massa spectrum van de single-probe MSI. De maximale intensiteit van gedetecteerde metabolieten 3,39 x 10 7 (willekeurige eenheden) te bereiken. B) Een selectie van de gedetecteerde metabolieten gepresenteerd met hun massa nauwkeurigheid. C)MS afbeeldingen [PC (32: 0) + H] + en [PC (34: 1) + Na] + uit een sectie muizennier bij 8,5 micrometer ruimtelijke resolutie. PC: fosfatidylcholine. Schaal bar: 2 mm; 0.20 mm (inzet) d) Vaststelling van de ruimtelijke resolutie van het beeld van de MS. [PC (38: 5) + Na] + (aangepast met toestemming van referentie 15). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Resultaten van een omgevingstemperatuur SCMS analyse van geneesmiddel behandelde HeLa cellen met hoge massa resolutie. A) ingezoomde foto van de single-sondepunt die een typische grootte van <10 urn in diameter. B) Foto gemaakt op de plaats van één probe inbrengen in een HeLa cel. Schaal bar: 50 pm.c) Een typische positieve ion modus massaspectrum met de identificatie van een aantal PC (fosfatidylcholine) soorten. d) Een representatieve lijst van metabolieten gedetecteerd SCMS analyse van HeLa-cellen zowel in positieve en negatieve ion modus. ef) Massa spectra de controle en de behandelde (100 nM OSW-1) cellen (aangepast met toestemming van referentie 16). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur S1. Schakelschema van het elektronische apparaat dat wordt gebruikt om contact te sluiten signaal te produceren voor massaspectrometer om gegevens te verzamelen. Klik hier om te bekijken of te downloaden dit cijfer.
Discussion
De single-probe is een multifunctioneel apparaat dat kan worden gebruikt voor zowel MSI en SCMS experimenten. De single-probe opstart (inclusief translatietrap systemen, microscopen, ionenbron flens-interface, etc.) als een add-on component die flexibel kan worden aangepast aan de bestaande massaspectrometer. Een snelle uitwisseling tussen de single-probe setup en de conventionele ESI ionenbron kan worden bereikt binnen één minuut. In principe, met de geschikte ionenbron-interface flens, de één-probe installatie kan worden aangepast aan de andere massaspectrometers. Bovendien kan de bemonstering oplosmiddel dat verschillende reagentia worden gebruikt met de single-probe opstart reactief MSI en SCMS experimenten, die de detectie van vollere biomoleculen sterk verbetert. Behalve dierlijke weefsels en cellijnen, de één-probe is eveneens geschikt voor het analyseren andere biologische systemen zoals planten. Daarom, met dezelfde experimentele opstelling ensoortgelijke opleiding van de gebruikers, kan een verscheidenheid aan studies worden uitgevoerd met behulp van een enkel instrument en door dezelfde gebruikers, waardoor een efficiënte en veelzijdige experimenten worden uitgevoerd met de minimale trainingstijd en instrumentatie kosten.
Het belangrijkste onderdeel van de single-probe MS techniek is de sonde zelf. De kwaliteit van de single-sonde heeft een significante invloed op zijn prestaties, die de kwaliteit van zowel de MSI en SCMS experimenten grotendeels bepaalt. Bij het fabriceren van single-probes, zorg ervoor dat de haarvaten binnenkant van de dual-boring buizen stevig vastgelijmd aan de kans op oplosmiddel lek tijdens de experimenten te elimineren. Het is cruciaal om een minimale hoeveelheid UV uithardbare epoxy, zodat de openingen en capillairen niet tijdens de fabricage probe verstopt gebruiken.
De single-probe werd gebruikt om een hoge ruimtelijke en massa resolutie ambient MSI voeren van biologische monsters 15. Het grote voordeel van ambient MSI bovennon-ambient werkwijzen is dat monstervoorbereiding minimaal wordt gehouden zonder de noodzaak van een vacuüm omgeving bemonstering, waardoor het te analyseren monster in een bijna natieve toestand 8. Een van de belangrijkste hindernissen voor de meeste andere ambient MSI techniek onvoldoende ruimtelijke resolutie 1 geweest. Vergeleken met de desorptie gebaseerde MSI technieken (zoals DESI en LAESI), de kleine tip grootte van de interne-sonde maakt een meer robuuste en efficiënte oppervlaktevloeistof micro-extractie wordt uitgevoerd met een klein oppervlak, wat leidt tot een hoge ruimtelijke resolutie van 8,5 micrometer, die tot de hoogste zijn weliswaar via omgevingstemperatuur MSI 15 technieken. Bovendien, aanpassing van de bestanddelen van de bemonstering oplosmiddel geeft extra flexibiliteit om de experimenten. Bijvoorbeeld bemonstering oplosmiddelen bevattende reagentia (bijvoorbeeld dicationic verbindingen) gebruikt reactieve MSI experimenten, waardoor een aanzienlijke toename van het aantal geïdentificeerde metabolieten per experiment 20. Het andere voordeel van de single-sonde is de geïntegreerde ontwerp, dat het bedieningsgemak biedt gedurende de hele data-acquisitie proces. Omdat de afstand tussen de naaldpunt en het oppervlak weefsel is zeer gevoelig voor ion signaalintensiteit en stabiliteit, het verkrijgen van een vlakke weefselsectie en geleidende oppervlaktelaag afvlakking aanpassing van de afstand variantie te minimaliseren is een sleutel voor hoogwaardige MSI experimenten. Hieruit volgt dat de single-probe MSI technieken zijn niet geschikt om een hoge ruimtelijke MS beelden van oneffen oppervlakken te verkrijgen.
Naast het vervaardigen van een hoge kwaliteit probe zorgvuldig afstemmen van het instrument is essentieel voor een succesvolle MSI experiment. Van alle afstemstappen, om de hoogte van de punt enkele sonde boven de weefselsectie oppervlak de meest kritische is. Het instellen van de hoogte probe, pomp de bemonstering oplosmiddel en zet de ionisatiespanning, zodat alleen het oplosmiddel achtergrond ionen signalen OBSERV kaned. controleren wordt deze verandering van het massaspectrum terwijl de probe-afstandsvlak zorgvuldig verminderen door het opheffen van de gemotoriseerde Z-fase tot sterke en stabiele ionen signalen van weefselsectie kan worden waargenomen; deze hoogte probe wordt gebruikt voor MSI gegevensverzameling tijdens het experiment. Bovendien, een geoptimaliseerde oplosmiddel stroomsnelheid is essentieel voor MSI experimenten. Stel het debiet met de geoptimaliseerde probe hoogte. Zorg ervoor dat er geen oplosmiddel verspreid over het weefsel oppervlak (dat wil zeggen, debiet te hoog is) of de vorming bubbel in de nano-ESI emitter (dat wil zeggen, het debiet te laag is).
De single-sonde is een multifunctioneel apparaat voor bioanalyse. Naast de MSI experimenten, is het in staat zijn die vrijwel in real time in-situ SCMS gedetailleerde chemische informatie van levende eukaryote cellen 16, hetgeen een groot voordeel ten opzichte van andere vacuüm opheldering gebaseerd SCMS technieken (zoals MALDI 10 en SIMS 21 (bijvoorbeeld dicationic verbindingen) worden gebruikt in de experimenten SCMS en een breder scala van celbestanddelen kan in een levende cel dan ooit worden gedetecteerd (lopend onderzoek, gegevens niet getoond). Hoewel de real-time analyse van de chemische profielen van levende enkele cellen, als gevolg van de cel binnendringen van membraan en extractie van cellulaire inhoud ervan, zullen de cellen onderzocht worden gedood na het experiment, hetgeen impliceert dat de één-probe SCMS techniek nog een destructieve methode. Bovendien kan de sondepunt en nano-ESI emitter in de single-probe gemakkelijk verstopt voor onervaren gebruikers. Om de kans op verstopping apparaat te verminderen, zorgen voor om te voorkomen dat het aanraken van de kern bij het plaatsen van de punt single-sonde in een cell. Bij verstopping kan de inrichting worden geregenereerd door het opwarmen van de verstopte sondetip of nano-ESI emitter met een zelfgebouwde verwarmingselement 16. Een andere beperking van de interne probe SCMS techniek is dat slechts het kleefmiddel cellen (dat wil zeggen, zijn cellen gehecht aan oppervlakken) kunnen worden geanalyseerd met behulp huidige opstelling. Echter, door het opnemen van de cel manipulatiesysteem in de enkele-probe MS inrichting bredere celtypen kunnen worden bestudeerd in de toekomst.
Vergelijkbaar met de MSI experiment, het verkrijgen van een hoge kwaliteit probe en een geoptimaliseerde oplosmiddel stroomsnelheid is essentieel voor SCMS studies. Bij het stemmen van het oplosmiddel stroomsnelheid, wordt de punt single-sonde geplaatst boven het monster (dat wil zeggen, geen contact met de cel of het kweekmedium), en ervoor te zorgen dat er geen oplosmiddel druipen van de sonde of de vorming bubbel in de nano-ESI emitter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Single-probe fabrication | |||
| Dual bore quartz tubing, 1.120’’ × 0.005” × 12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
| Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
| Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 110 µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
| UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
| LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
| Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
| Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
| Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
| Microscope slide (glass) | C & A Scientific - Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
| Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
| Mass spectrometer | |||
| LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
| Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
| Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| Contact closure device | |||
| USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
| Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
| Single-probe setup | |||
| Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
| Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
| Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
| Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
| Digital stereo microscope, 250X - 2,000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
| USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
| Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
| Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
| Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
| Solvents | |||
| Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
| Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
| 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
| 10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
| 12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
| T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
| Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
| Tissue imaging | |||
| Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
| Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
| Microscope slide (polycarbonate) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P | |
References
- Vickerman, J. C. Molecular imaging and depth profiling by mass spectrometry-SIMS, MALDI or DESI? Analyst. 136 (11), 2199-2217 (2011).
- Schwamborn, K. Imaging mass spectrometry in biomarker discovery and validation. J. Proteomics. 75 (16), 4990-4998 (2012).
- Schwamborn, K., Caprioli, R. M. MALDI Imaging Mass Spectrometry - Painting Molecular Pictures. Mol Oncol. 4 (6), 529-538 (2010).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18120-18125 (2008).
- Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. Simultaneous imaging of small metabolites and lipids in rat brain tissues at atmospheric pressure by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 82 (3), 982-988 (2010).
- Laskin, J., Heath, B. S., Roach, P. J., Cazares, L., Semmes, O. J. Tissue Imaging Using Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84 (1), 141-148 (2012).
- Wu, C., Dill, A. L., Eberlin, L. S., Cooks, R. G., Ifa, D. R. Mass spectrometry imaging under ambient conditions. Mass. Spectrom. Rev. 32 (3), 218-243 (2013).
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-Cell MALDI-MS as an Analytical Tool for Studying Intrapopulation Metabolic Heterogeneity of Unicellular Organisms. Anal. Chem. 82 (17), 7394-7400 (2010).
- Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-cell lipidomics: characterizing and imaging lipids on the surface of individual Aplysia californica neurons with cluster secondary ion mass spectrometry. Anal. Chem. 85 (4), 2231-2238 (2013).
- Shrestha, B., et al. Subcellular metabolite and lipid analysis of Xenopus laevis eggs by LAESI mass spectrometry. PLoS One. 9 (12), e115173 (2014).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass. Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 26 (6), 986-993 (2015).
- Pan, N., et al. The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Thomas, M., et al. Visualization of High Resolution Spatial Mass Spectrometric Data during Acquisition. 2012 Annual International Conference of the Ieee Engineering in Medicine and Biology Society (Embc). , 5545-5548 (2012).
- Luxembourg, S. L., Mize, T. H., McDonnell, L. A., Heeren, R. M. High-spatial resolution mass spectrometric imaging of peptide and protein distributions on a surface. Anal. Chem. 76 (18), 5339-5344 (2004).
- Zhou, Y., et al. OSW-1: a natural compound with potent anticancer activity and a novel mechanism of action. J Natl Cancer Inst. 97 (23), 1781-1785 (2005).
- Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 27 (1), 124-134 (2016).
- Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary ion MS imaging to relatively quantify cholesterol in the membranes of individual cells from differentially treated populations. Anal. Chem. 79 (10), 3554-3560 (2007).
