Abstract
공막 커버와 눈을 보호하는 조밀 한 결합 조직이다. 그것은 주로 조밀 한 콜라겐 번들 (유형 I, III, IV, V, VI와 VII)로 구성되어있다. 그것의 형광도, 불투명, 두께에, 그것은 공 초점 현미경에 적합한 발견되지 않았습니다. 항원 검색을 위해 조직을 예열 특히, 면역을 위해 파라핀 포르말린 고정 공막을 사용하는 기술적 과제를 갖고 여기에 제시된 하나의 대체 방법. 공막 세포와 혈관을 모두 상대적으로 열악하기 때문에, 큰 조직 샘플의 사용을 보이는 세포를 방지하고, 선박 등의 해부학 적 부위에 관련된 자신의 위치 파악을 이해하는 데 도움이 모색되었다. 공 초점 현미경 큰 조직 샘플의 분석을 허용하기 위해, 적층 기술은 공막의 얇은 층을 생성하고자 하였다. CD31 혈관 및 림프관 내피 hyalu 결과의 분석에 따라로난 수용체 1 (LYVE1) 과학 시험에 대한 승인을 얻었다있는 양성 세포는,이 방법의 장점과 제한 사항이 설명되어 있습니다.
Introduction
공막은 조밀 한 결합 조직으로 구성되어 눈을 덮고있는 단단한 외부 층이다. 이것은 인공 구조물을 보호하기 위해 안압을 유지하도록 돕는다. 따라서, 공막은 명확한 비전을 위해 필수적이다. 그것은 림프 혈관 1,2없는 상태이며, 따라서 그것과 림프없는 내 눈 3-7 사이의 외부 림프없는 경계를 형성한다. 또한하여 힘줄과 해부학 적 유사성을 공유하고, 안구 근육 첨부 파일 사이트를 제공합니다. 공막은 주로 I 콜라겐 유형의 밀도가 번들로 구성되어 있으며 콜라겐 유형 III, IV, V, VI, VIII 8,9과 엘라스틴 10, 11의 작은 숫자를 가지고 있기 때문에,이 조직은 면역 조직 화학 염색을 위해 사용하기 쉬운 일이 아니다.
(1) 표면 혈관 episclera, 결막 및 장부의 캡슐 아래에 발견하고 측면과 일을 향해 : 해부학, 공막은 세 가지 주요 계층으로 분리 될 수있다궤도 대향 눈 E의 뒷면; (2) 기질 공막은 공막의 주요부; 및 (3) 바로 위에 위치 포도막 얇은 착색 층 라미 fusca를. 공막에 대한 우리의 해부학 적 지식은 20 세기의 전반부에서 주로 유래한다. 당시 연구자들은 주로 인도 잉크 주입 (12)를 사용하여 혈관이 13 ~ 15 주조에 의해 혈관의 해부학을 공부했다. 나중에, 그 혈관 16-19 연구에서 조사되었다.
그 이후로, 이전 기술이 향상되었으며 새로운 우리가 이전 해부학 적 지식을 보완 할 수있는 개발되었다. 우리는 림프계 혈관 내피 히알루 특정 수용체 -1 (LYVE1) 20 21 podoplanin 같은 신뢰성 림프 마커 가지고 이후 예를 들어, 단지 약 십왔다. 공 초점 현미경은 다른 TI의 해부학 적 특징을 연구에 대한 새로운 가능성을 제공합니다눈의 ssues. 여러 얼룩 세포의 분화 마커 나 혈관 등의 해부학 적 구조에 관하여 셀의 위치 파악에 사용하는 것은 허용한다. 샘플이 더 큰 크기이며 때 특정 세포 유형의 검색에서 우리가 샘플을 통해 검색 할 수 있습니다 때 개요를 제공합니다. Z 스택 기술, 공 초점 현미경은 100-200 μm의 최대 샘플을 사용할 수있다. 공막은 근육 삽입 뒤에 0.3 mm와 극부 (11)에서 1mm 사이의 두께가 다르다. 두께와 불투명 모두으로 인해 공막은 기존의 방법을 사용하여 공 초점 현미경에 적합하지 않습니다.
이 문제를 해결하려면, 공막 조직은 공 초점 현미경과의 분석을 할 수 있도록 적층 하였다. 이 기술은 인간 공막 모두 생리적 및 병리학 적 상황에서의 더 나은 이해를 얻는 데 유용하다.
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Protocol
인체 조직의 사용을 검토하고 제도적 검토 보드 또는 동등한 승인을 받아야한다. 여기에 설명 된 작업은 지역 윤리위원회의 승인 및 과학 시험 승인을 펼쳤습니다. 이 작품은 헬싱키 선언에 따라 수행 하였다. 인간의 공막 표본은 안과학과의 안구 은행, 쾰른 대학, 독일에서 (최대 사후 시간 24 시간) 세계 기증자의 눈에서 얻었다.
1. 실험 준비
- 96 % 에탄올을 준비하고 다른 튜브에 완충 식염수 (PBS)를 인산염. PBS 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)를 포함 권장 희석에 차 항체를 준비하고 얼음에 모든 솔루션을 유지. 샘플 당 100 μl를 준비합니다.
- 모든 악기를 청소하고 날카로운 메스를 사용합니다. 같은 메스로 절단 반복 한 후, 메스를 변경합니다.
- 1-2 콜리 브리 포셉, 바로 마이크로 해부 가위, A # 10 메스를 얻안과 메스 마이크로 깃털, 4 26 G 바늘이나.
- 폴리스티렌 플레이트 주위에 알루미늄 호일을 감싸거나 조직을 부착하는 코르크 판을 사용합니다. 양안 스테레오 현미경 아래에서 작업 할 수 있습니다. 필요한 경우 층류 아래 멸균 작업 할 수 있습니다.
2. 공막 준비
- 부드럽게 전구를 보유하고 공막 부분에 천공 공술 (Trepanation)를 수행 한 후 두개골을 잘라내는 톱을 돌립니다. 똑같이 라운드 컷을 수행하기 위해 표면에 신중하고 균일하게 책략가를 돌립니다. 15.5 mm 크기의 두개골을 잘라내는 톱을 사용합니다. 곡선 가위로 남아있는 첨부 파일을 잘라. 각막 공막 공술 (Trepanation)를 제거합니다. 이는 전방 개방 전구가 발생합니다.
- 위쪽으로 열려있는 부분 면봉에 공막을 넣습니다. 공막에서 두 층 (망막 포도막)를 해내 콜리 브리 집게를 사용하여 망막 포도막를 제거합니다. 내부 공막에 색소 포도막을 두지 마십시오. 유두에서 망막 포도막을 제거하기 위해 곡선 가위를 사용합니다. REM 수면을 제거aining 결막, 외안근, 그리고 피상적 인 공막에서 장부의 캡슐.
- 스트레이트 형 가위와 콜리 브리 집게를 사용하여 필요한 크기의 공막 샘플을 제거합니다. 약 2cm 서로 다른 위치에서 2 크기의 공막 샘플을 가져 가라. 때문에 작은 크기, 부드럽게 공막을 보유하고 스트레이트 형 가위를 사용하여 사각형으로 필요한 크기를 잘라. 각막 공막 공술 (Trepanation)은 공막 샘플의 전방 여백을 정의합니다.
- 반복 잡고 된 조직이 공 초점 현미경 분석에 적합하지 않은 곳은 집게로 잡는하지 마십시오. 및 사용 된 항체의 양 (도 1과 비교 예 전방 대 후방) 실험 종류에 따라 샘플의 필요한 수를 준비한다.
- 나중에 사용하기 위해 1.5 ml의 튜브 샘플을 넣습니다. 15 분 동안 1.5 ml의 96 % 에탄올에 샘플을 수정 한 다음 5 분 동안 그들에게 3 회 씻어진탕에 1.5 ml의 PBS있다. 냉동 조직 작업하는 경우, 스냅 동결하기 전에이 단계를 수행합니다.
- 신선한 조직을 사용합니다. 이 불가능하다 그러나, 스냅 액체 질소의 공막을 동결하고 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 보관하십시오. 냉동 조직, 사용하기 전에 해동 작업을하는 경우. 반복 해동과 냉동 사이클을 피하십시오.
- 실온에서 2 시간 동안 1.5 ml의 5 % BSA를 함유하는 PBS에서 각 샘플을 보관. 이 단계는 적층에 도움이되는 샘플의 팽창을 유도하고 또한 불특정 바인딩을 방지 할 수 있습니다.
- 샘플이 팽창 한 후, 적층의 공막 사각형을 준비합니다. 예를 들면 양안 스테레오 현미경 현미경 아래에서 작업 할 수 있습니다. 알루미늄 호일 또는 26 G 바늘을 사용하여 코르크 판에 싸여 폴리스티렌 막에 후방 공막 샘플을 부착합니다.
- 그들은 현미경 아래의 시야를 방해하지 않도록 바늘의 에지를 구부리고.
- 전체 두께 공막 SAMP를 적층레.
- 첫째, 콜리 브리 집게를 사용하여 전방 공막 가장자리를 잡으십시오. 조심스럽게 # 10 메스, 안과 용 메스 마이크로 깃털 또는 주걱 블레이드를 사용하여 표면 공막 얇게 잘랐다. 수평으로 메스를 잡고 기본 층에서 씬 가능한 표면층을 잘라.
- 공막 광장에서 얇은 공막 층을 해부하다. 표준 수술 기법이 섬유주 절제술 동안 플랩을 준비하고 30 ~ 80 μm의 두께 층 (그림 2 비교)가 발생한다이 방법은 유사합니다.
- 예 50 ㎕의 PBS에 피펫을 사용하여 조직을 PBS 소량 첨가함으로써 공막의 건조를 방지한다.
- 방수 색상 예와 레이어 (표면과 깊은) (통근 및 인턴으로) 96 웰 플레이트에 PBS 100 ㎕로 컷 레이어를 넣고 방향을 모두 레이블을 붙입니다.
- 조직이 완전히 적층 될 때까지 반복 2.7-2.9 단계를 반복합니다. </ 리>
3. 면역을 수행
- 권장 희석에 필요한 일차 항체의 100 μl를 추가합니다. 여기에, 예를 들어 사용 CD (31) (단클론 마우스 항 인간)과 LYVE1 항체 (토끼 항 인간), (1)의 희석에 둘 (2 % BSA를 포함) PBS 100과 밤새 4 ° C에서 품어. 96 웰 플레이트에서 매체를 변경하려면 우물의 벽에 피펫을 누른 상태에서 유체를 제거합니다.
- 다음 날, 진탕 기에서 200 ~ 300 ㎕의 PBS로 5 분간 시료를 3 회 씻는다. 해당 이차 항체의 100 μl를 추가; 여기 된 염소 항 마우스 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 및 염소 항 토끼 시아닌 염료 3 (Cy3에)를 사용하여 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 샘플을 배양한다. 이차 항체 희석 1 : 300를 PBS 2 % 염소 혈청을 함유한다.
- 셰이 커에 200 ~ 300 ㎕의 PBS에 5 분 동안 다시 3 회를 샘플을 씻어.
- 핵 염색을 수행, 예를 들어,
- , 현미경 슬라이드에 샘플을 전송 삽입을 형광등 설치 매체의 1 ~ 2 방울, 커버 슬립을 추가, 투명 광택과 가장자리를 커버하여 밀봉, 저장 4 ° C에서 나중에 사용하기 위해 직접 공 초점과 슬라이드를 검토 현미경.
- 샘플을 분석하기 위해 공 초점 현미경 (또는 동급)를 사용합니다. 원하는 배율, 예를 들어 10-40X 배율을 사용합니다.
- 샘플의 두께를 확인하기 위해 공 초점 현미경 Z-스택을 사용하여 측정한다. 두께는 적도에 그리고 후방 (도입과 비교)로 상이 가능 공막 부분의 양은 공막의 위치에 의존한다.
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Representative Results
여기에서 수행되는 대표적인 실험에서, 특정 코팅 기법의 사용으로부터 유도 명백한 이점이있다. 첫 번째 실험은 세 개의 대표 사진 (도 3)의 상공 막 혈관 총의 다양한 네트워크를 도시한다. 선박은 CD31 양성이다.
두 번째 실험은 episclera와 CD31 양성 혈관과의 관계의 특정 LYVE1 + 세포, 면역 세포를 보여줍니다. 여기서 Z 스택 기술은 조직을 통해 스캔 혈관 면역 세포 (도 4)의 3 차원의 관계를 이해하는 10X 배율로 사용 하였다.
공막뿐만 아니라 첨부 된 외안근은 혈관 또는 면역 세포의 존재에 대해 분석 할 수있다.도 5 도표LYVE1 양성 세포와 CD31 양성 혈관.
그림 1 :.. 인간의 눈의 도식 그림이 여기에 인간의 눈의 단면의 개략적 인 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 적층 기술의 도식 그림은 공막은 신중하게 콜리 브리 집게와 함께 개최 메스를 사용하여 미세한 층으로 적층된다. 이 단계를 반복하는 공 초점 현미경에 사용할 수있는 얇은 조직 슬라이드에 연결됩니다. 이 파이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오gure.
그림 3 :. C가 후방 위치에서있는 동안 상공 막 혈관 신경총은 CD31 A와 B에 대한 면역 양성은, 전방 episclera에서 파생됩니다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 그들 사이의 해부학 적 관계를 표시 a에서 z-스택의 CD31 + 혈관과 LYVE1 + 세포가, 소형 선박 큰 사람이 겹칠 수 있습니다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 공막에 동봉는 외안근의 근육이다 그들은 유사한 미세 혈관 네트워크와 일부 LYVE1 + 세포가 포함되어 있습니다.. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 공막을 적층하여이 조직에 공 초점 현미경 검사를 수행하는 방법이다. 이 과정에서 중요한 단계는 조직을 부착에 대한 에탄올의 사용 대신 포르말린이다. 고정 에탄올 대신 포르말린을 사용하는 경우 우리의 경험에서 더 나은 결과를 얻을 수있다. 블런트 메스는 절차를 악화 피해야한다. 마찬가지로, 공막의 고갈은이 절차를 복잡하게하고, 화상의 품질을 감소시키기 때문에 피해야한다.
면역 조직 화학적 염색과 관련하여, 여기에 적용되는 이외의 항체를 사용할 수있다. 일반적으로 콜라겐보다 자동 형광 및 녹색 채널의 배경은, 푸른, 따라서 빨간색과 원적외선 채널 덜 배경으로 더 나은 결과를 보여를 보여줍니다.
그러나, 기술의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그것은 microsc 하에서 수행되는 미세 수술 절차대로 공막을 적층하는 것은, 많은 연습이 필요빈 터. 이 방법은 수동으로 수행되기 때문에, 단일 적층 슬라이스 크기가 정확히 동일하지 않은 조직의 한 조각 내에서 두께가 다르다. 층의 두께가 여전히 달라질 수 있지만 정확히 같은 크기의 조직을 가지고, 공술 (Trepanation)는 대안이 될 수 있습니다. 공막 부분에 대한 정확한 정의 두께를 달성하기 위해, 자동 미세 각막 절삭기 미래 실험의 대안이 될 수 있습니다. 적층 너무 두꺼운 층으로 이루어지면, 덮개 슬라이드 탈구 있고, 상기 조직은 잠재적으로 건조 할 수있다. episclera과 기질 사이의 정확한 경계는 적층이 수행되면 구별하기 어려울 수 있습니다.
그럼에도 불구 공막을 적층하는 것은 현재의 임상 적 상황에서 표준 방법 포르말린 고정 파라핀 면역에 비해 특히, 면역 조직 화학 법의 사용에 여러 가지 이점을 갖는다. 공막을 적층하는 공 초점 microsc 수 있습니다opy이 공막의 더 큰 크기의 영역을 분석하기 위해, 수행 할 다른 공막 층뿐만 아니라 스크리닝하고 조직 검사를 검사한다. 포르말린 고정 파라핀 포함 된 샘플 작업을 할 때 대조적으로, 공막은 항원 검색을 위해 예열하는 동안 도움이되지 않는 방법으로 일관성을 변경합니다. 가열 과정에서 콜라겐 섬유 주름 및 조직 슬라이드와 접촉을 잃는다. 이전에는 episclera에서 선박 신경총 만 아니라 단면에있어서, 혈관의 기술을 사용하거나 전체 마운트 뷰에 표시되고있다.
기술적 어려움 외에도 공막 비교적 무혈성 및 망막과 같은 눈의 다른 조직에 비해 면역 세포에서 상대적으로 빈약하다. 보통 4 μm의 두께, 여러 슬라이드있다 포르말린 고정 파라핀 슬라이드를 사용할 때 따라서 공막의 양성 세포를 검출하기 위해 필요하다. 최근에는이 laminat를 사용하여 나타내었다인간의 공막이 무 세포가 아니라 혈관 1 주위에 축적 LYVE1 + 식세포 많이 들어 기법을 보내고.
적층 공막 부분에 공 초점 현미경 검사를 수행하여 이러한 요약 공막염, 포도막염, 또는 외상 앞으로 병적 장애를 조사하기 위해 유망한 도구이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26 G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5 mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24 mm x 24 mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a |
References
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