Abstract
sklera kapakları ve göz koruyan yoğun bağ dokusu olduğunu. Özellikle yoğun kolajen demetleri (tip I, III, IV, V, VI ve VII) oluşur. Nedeniyle otofloresansı, opaklık, ve kalınlık için, konfokal mikroskopi için uygun bulunmamıştır. Antijen alımı için doku ön ısıtma, özellikle, immünhistokimya için parafine gömüldü formalin ile fikse sklerasına kullanan teknik zorlukları vardır Burada sunulan birine alternatif bir yaklaşım. sklera hücreleri ve damarlar hem de göreceli olarak zayıf olduğu için, daha büyük doku örneklerinin kullanılması bakan hücreleri önlemek ve gemi ve diğer anatomik sitelere ilişkin kendi yerleşimini anlamada yardımcı olmak için araştırılmıştır. konfokal mikroskop altında daha büyük bir doku örneklerinin analizi için izin vermek için, bir laminasyon tekniği sklera ince tabakaları oluşturmak için gerçekleştirilmiştir. CD31 kan damarları ve lenfatik damar endotel hyalu sonuçlarının analizini takibenronan reseptör 1 (LYVE1) Bilimsel inceleme için onay elde edildiği için pozitif hücrelerin, bu yöntemin avantajları ve sınırlılıkları tartışılmıştır.
Introduction
sklera yoğun bağ dokusu yapılmış göz kapakları, sert dış tabakasıdır. Göz içi yapıları korumak için ve göz içi basıncı korumaya yardımcı olur. Böylece, sklera net görüş için gereklidir. Bu lenf damarlarının 1,2 yoksun ve böylece o ve lenfatik serbest gözün iç 3-7 arasında bir dış lenfatik serbest sınırını oluşturur. Aynı zamanda bu sayede tendonların anatomik benzerlik paylaşarak, göz dışı kaslarının için bağlanma siteleri sağlar. Sklera esas tip I kollajenin yoğun demetleri oluşur ve kolajen tip III, IV, V, VI, VIII, 8,9 ve elastin 10,11 daha az sayıda sahip olduğu için, bu doku immünohistokimya için kullanımı kolay değildir.
(1) yüzeysel vaskülarize episkleraya, konjonktiva ve tenon kapsülünün altında bulundu ve iki tarafın ve inci doğru: Anatomik olarak, sklera üç ana katmandan ayrılabiliryörüngeye bakan gözün e geri; (2) sklera stroma, sklera ana parçası; ve (3) ile doğrudan uvea üzerinde bulunan ince, pigmentli tabaka, tabakanın fusca. Sklera ile ilgili bizim anatomik bilgi 20. yüzyılın ilk yarısında kaynaklanmaktadır. O zaman, araştırmacılar başta Hindistan mürekkep enjeksiyonları 12 kullanılarak ve damar 13-15 döküm damarsal anatomisi okudu. Daha sonra, bu anjiografik çalışmalar 16-19 yılında araştırılmıştır.
O zamandan bu yana, eski teknikler geliştirildi ve yenileri bize önceki anatomik bilgiyi tamamlamak için izin olduğunu geliştirilmiştir. Bu lenfatik damar endotel spesifik hiyalüronan alıcısı-1 (LYVE1) 20 veya podoplanin 21 gibi, güvenilir lenf belirteçleri beri Örneğin, sadece on yıl olmuştur. Mikroskopisi farklı ti anatomik özelliklerini incelemek için yeni imkanlar sunuyorgöz ssues. Birden lekeler hücrelerin işaretleri ayırt etmek için ya da kan damarları ve diğer anatomik yapılara göre hücre lokalizasyonu için kullanılmak üzere bu sağlar. Numune daha büyük bir boyutta olduğunu ve ne zaman belirli bir hücre tipi arama bize örnek üzerinden tarama sağlar zaman bir bakış sağlar. Z yığın tekniği ile, konfokal mikroskopi 100-200 um kadar örnekler için kullanılabilir. Sklera kas eklemeleri arkasında 0.3 mm ve arka kutupta 11 1 mm arasındaki kalınlıklarda farklıdır. kalınlığı ve opaklık hem nedeniyle, sklera geleneksel yöntemlerle konfokal mikroskopi için uygun değildir.
Bu durumu düzeltmek için, skleral dokular konfokal mikroskobu ile analiz için izin lamine edilmiştir. Bu teknoloji, insan sklera hem de fizyolojik ve patolojik durumların daha iyi anlamaya için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
insan dokularının kullanılması gözden geçirilmiş ve bir kurumsal inceleme kurulu veya eşdeğeri tarafından onaylanmalıdır. Burada anlatılan çalışma yerel etik komitesi tarafından onaylanmış ve bilimsel inceleme için onay aldı. Bu çalışma Helsinki Bildirgesi göre yapıldı. İnsan skleral örnekleri Göz Hastalıkları Anabilim Dalı Göz Bankası, Köln Üniversitesi, Almanya'da (maksimum postmortem süresi 24 saat) küre vericilerden gözlerinden elde edilmiştir.
1. Deneysel hazırlanması
- % 96 etanol hazırlayın ve farklı tüplerde tamponlu tuz (PBS) fosfat. PBS,% 2 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden Tavsiye edilen seyreltme birincil antikorların hazırlanması ve buz üzerinde tüm çözümler tutun. örnek başına 100 ul hazırlayın.
- bütün aletleri temizleyin ve keskin neşter kullanın. Aynı neşter ile kesim tekrarlanır sonra neşteri değiştirin.
- 1-2 colibri forseps, düz mikro kesme makasları, bir 10. neşter eldeOftalmik neşter mikro tüy ve dört 26 G iğne veya.
- Bir polistiren plaka etrafında alüminyum folyo sarın veya doku sabitlemek için bir mantar plaka kullanın. binoküler stereo mikroskop altında çalışın. Gerekirse bir laminer hava akımı altında steril çalışın.
2. sklera hazırlayın
- Yavaşça ampul tutun ve korneoskleral parçası üzerinde delme öldüğünü keşfetmek gerçekleştirmek, sonra Trepan döndürün. eşit yuvarlak kesim gerçekleştirmek için yüzeye dikkatlice ve eşit Trepan döndürün. 15,5 mm büyüklüğünde Trepan kullanın. kavisli makas ile kalan ekleri kesin. korneoskleral öldüğünü keşfetmek çıkarın. Bu öne açılan ampul neden olacaktır.
- yukarı açık bölümü ile bir bez üzerinde sklerasına koyun. sklera her iki katmanları (retina ve uvea) koparmak için colibri forseps kullanarak, retinaya ve uvea çıkarın. İç sklera pigmente uvea bırakmayın. papilladan retina ve uvea kaldırmak için kavisli makas kullanın. rem kaldırTahliye konjonktiva, göz dışı kaslar ve yüzeysel skleradan Tenon kapsülü.
- düz tip makas ve colibri forseps kullanarak gerekli boyutta skleral örnek çıkarın. Yaklaşık 2 cm farklı yerlerden 2 boyutlu skleral örnekler alabilir. Çünkü küçük boyutu, nazikçe sklera tutun ve düz tip makas kullanarak kareler olarak gerekli boyut kesip. korneoskleral trepanasyon skleral numune ön kenar tanımlar.
- tekrarlanan yakaladı doku konfokal mikroskopi analiz için uygun değildir alanı olarak forseps ile kapma kaçının. Ve kullanılan antikorların miktarı (Şekil 1 karşılaştırmak, örneğin anterior vs posterior) deney türüne bağlı olarak numunelerin gerekli sayıda hazırlayın.
- daha sonra kullanmak için 1.5 ml tüpler örnekleri koyun. 15 dakika boyunca 1.5 ml% 96 etanol içerisinde örnekleri saptamak, ve daha sonra 5 dakika boyunca her üç kez yıkayınçalkalayıcı üzerinde 1.5 ml PBS içerisinde. Dondurulmuş doku ile çalışıyorsanız, ek donma önce bu adımı gerçekleştirin.
- Taze doku kullanın. Bu mümkün değil ise, ancak, ek sıvı azot içinde sklera dondurmak ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklayın. dondurulmuş doku kullanımdan önce çözülme ile çalışma durumunda. Tekrarlanan çözülme ve donma döngüleri kaçının.
- 2 saat boyunca oda sıcaklığında 1.5 ml 5% BSA ihtiva eden PBS içinde, her bir örnek tutun. Bu adım Lamine için yararlıdır örnek bir şişmesine neden ve aynı zamanda belirsiz bağlama engeller.
- Numuneler kabarmış sonra, laminasyon skleral kareler hazırlamak. Örneğin bir binoküler stereo mikroskop mikroskop altında çalışın. alüminyum folyo veya 26 G iğneler kullanılarak mantar plaka sarılı polistiren zarı arka skleral örnekleri yapıştırın.
- onlar mikroskop altında görme alanı karışmaz, böylece iğne kenarlarını bükün.
- tam kalınlıkta skleral samp Laminatles.
- İlk olarak, colibri forseps kullanılarak ön skleral kenarına tutun. Sonra dikkatlice 10. neşteri, oftalmik neşter mikro tüy veya spatula bıçak kullanarak yüzeysel sklera ince bir tabaka kesti. yatay neşter tutun ve alttaki katmanla itibaren ince mümkün olduğunca yüzeysel katmanı kesti.
- skleral meydanına ince bir skleral tabaka teşrih. Standart cerrahi teknikler trabekülektomiye sırasında kanat hazırlamak ve 30-80 um kalınlığında tabakalar (Şekil 2 ile karşılaştırınız) ile sonuçlanmalıdır Bu yöntem karşılaştırılabilir.
- Örneğin, 50 ul PBS bir pipet kullanılarak doku PBS küçük miktarlarda eklenmesi ile sklera kurumasını önler.
- Su geçirmez renk örn ve katman (yüzeysel ve derin) (extern ve stajyer doğru) 96 plaka PBS 100 ul halinde kesilmiş katmanları koyun ve yönünü hem de etiket.
- Doku tamamen lamine kadar tekrarlayın 2.7-2.9 adımları tekrarlayın. </ Li>
3. İmünohistokimya gerçekleştirin
- Tavsiye edilen seyreltme halinde gerekli birincil antikor 100 ul ekle. Burada, örneğin kullanımı CD 31 (monoklonal, fare anti-insan) ve LYVE1 antikor (tavşan anti insan), 1 seyreltme hem de: (% 2 BSA içeren) PBS içinde 100 ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 96 oyuklu bir plaka içerisinde orta değiştirmek üzere, iyi duvarına pipet tutun ve sıvıyı.
- Sonraki gün, bir karıştırıcı üzerinde 200-300 ul PBS ile 5 dakika için numuneler üç kez yıkayın. karşılık gelen sekonder antikor, 100 ul ilave et; Burada keçi anti fare floresein izotiosiyanat (FITC) ve keçi anti tavşan siyanin boyası 3 (Cy3) kullanın ve 1-2 saat için oda sıcaklığında örnekleri inkübe edin. İkincil antikorlar 1 seyreltilir: 300 PBS,% 2 keçi serumu ihtiva eden.
- çalkalayıcıda 200-300 ul PBS içinde 5 dakika boyunca tekrar üç kere, her numune durulayın.
- Çekirdek boyama gerçekleştirin, örneğin
- , Mikroskop lamı üzerine örnekleri aktarın embed onları floresan montaj orta 1-2 damla, bir lamel eklemek, şeffaf vernik ile kenarları kaplayarak mühür ve mağaza 4 ° C'de daha sonra kullanmak üzere veya doğrudan konfokal ile slaytlar incelemek mikroskop.
- örnekleri analiz etmek için bir konfokal mikroskop (veya eşdeğeri) kullanın. İstenilen büyütme, örneğin 10-40X büyütme kullanın.
- Örneklerin kalınlığı doğrulamak için, konfokal mikroskopi Z-Yığınlar kullanarak ölçün. kalınlık ekvatorial ve posterior (giriş karşılaştırın) farklıdır mümkün skleral bölümlerin miktarı, sklera konumuna bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada gerçekleştirilen temsili denemelerde, bu özel laminasyon tekniği kullanılarak elde edilen gösterilebilir faydaları vardır. İlk deneme üç temsilci resim (Şekil 3) episkleral damar pleksusun farklı ağını göstermektedir. gemiler CD31 pozitiftir.
İkinci deneme episkleraya ve CD31 pozitif kan damarları olan ilişkilerine özellikle LYVE1 + hücrelerde, bağışıklık hücrelerini gösterir. Burada Z-Yığın teknoloji dokusu ile tarama ve kan damarları ve bağışıklık hücreleri (Şekil 4) üç boyutlu ilişkileri anlamak için 10X büyütmede kullanıldı.
Sklera, hem de kapalı bir göz dışı kaslar, kan damarları ya da bağışıklık hücrelerinin varlığı açısından analiz edilebilir. Şekil 5 ŞekilLYVE1 pozitif hücreler ve CD31 pozitif kan damarları.
Şekil 1:.. İnsan Eye şematik resmi İşte insan gözünün kesitinin şematik olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Laminasyon Tekniği şematik resim sklera dikkatle colibri forseps ile düzenlenen ve bir neşter kullanılarak ince tabakalar halinde lamine edilir. Bu adımı tekrarlayarak konfokal mikroskopi için kullanılabilir ince doku slaytlar yol açar. Bu fi büyük halini görmek için tıklayınızşekil.
Şekil 3:. C arka yerden ise episkleral Kan Gemi Pleksus, CD31 A ve B için immünopozitif, ön episkleraya türetilmiştir. Ölçek çubuğu 100 mikron belirtir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Aralarındaki Anatomik İlişkileri gösteriliyor z-yığın CD31 + Kan damarları ve LYVE1 + Hücreler, Küçük gemiler ve daha büyük olanlar çakışabilir. Ölçek çubuğu 100 mikron belirtir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: scleraya Kapalı Ekstraoküler Kaslar vardır Onlar benzer ince kan damarı ağı ve bazı LYVE1 + hücreler içerir.. Ölçek çubuğu 200 mikron belirtir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan sklera Laminasyon Bu doku üzerinde eş odaklı mikroskopi gerçekleştirmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu süreçte kritik bir adım doku yapıştırılması için etanol kullanımı yerine formalin olduğunu. sabitleme için etanol yerine formalin kullanırken bizim deneyim, daha iyi sonuçlar elde edilmektedir. Blunt neşter prosedürü ağırlaştırmak ve kaçınılmalıdır. Benzer şekilde, sklera kuruması o prosedürü komplike ve görüntülerin kalitesini azaltır, kaçınılmalıdır.
İmmünohistokimyasal boyama ile ilgili olarak, burada uygulanan dışındaki antikorları kullanılabilir. Genel olarak, kollajen daha otomatik floresan ve yeşil kanalda arka plan, mavi, bu nedenle kırmızı ve uzak-kırmızı kanalları daha az arka plan ile daha iyi sonuçlar göstermektedir göstermektedir.
Ancak, tekniğin çeşitli sınırlamalar vardır. Bir Microsc altında gerçekleştirilen bir mikrocerrahi bir işlemdir olarak sklera lamine, pratik bir sürü gerektirirope. Bu teknik, elle gerçekleştirilir, çünkü tek tabakalı dilim tam olarak aynı boyutta değildir ve doku tek parça kalınlıkları farklıdır. tabakaların kalınlığı yine değişecektir, ancak tam olarak aynı boyutta dokuları sahip olmak için, trepanasyon, alternatif olabilir. skleral bölümler için tam olarak tanımlanmış kalınlığı elde etmek için, bir otomatik mikrokeratomdur gelecek deneyler için bir alternatif olabilir. laminasyon çok kalın tabakalar gerçekleştirilirse, kapak slayt yerinden edebilir, ve doku potansiyel kuruyabilir. episkleraya ve stromada arasında kesin sınırlar laminasyonlar yapılmaktadır kez ayırt etmek zor olabilir.
Buna rağmen, sklera lamine mevcut klinik durumda standart bir yöntemdir formalin ile fikse parafine gömülü immünhistokimya ile karşılaştırıldığında, özellikle immunohistokimyasal kullanımında birçok avantajı vardır. sklera lamine konfokal Microsc veriyoropyala, sklera büyük boyutlu alanlarda analiz edilmesi, yapılacak sklera farklı katmanlar olarak, tarama ve doku tarama incelenecek. formalinle sabitlenmiş parafine gömülü örnekleri çalışırken aksine, sklera antijen alımı için ön ısıtma sırasında yardımcı bir şekilde Yoğunluğu değiştirir. Isıtma süreci boyunca, kollajen lifleri shrivel ve doku slayt ile temas kaybeder. Daha önce, episkleraya damar pleksus, sadece değil ama çapraz kesitlerde, anjiyografik teknikleri veya bütün montaj görünümde olmuştur.
teknik zorluklar ek olarak, sklera nispeten avasküler ve retina gibi göz diğer dokularda karşılaştırıldığında bağışıklık hücrelerinde nispeten zayıftır. Genellikle 4 mikron kalınlığında, birden slaytlar formalin ile fikse parafine gömülü slaytlar, kullanırken nedenle, sklera olumlu hücreleri algılamak için gereklidir. Son zamanlarda, bu Laminat ile gösterilenİnsan sklera hücresel olmayan değil, kan damarları yaklaşık 1 birikmesine LYVE1 + makrofajlar bol bulunduğu tekniğiyle.
lamine skleral bölümlerde konfokal mikroskopi performans Özetlemek gerekirse, bu tür sklerit, üveit, ya da travma gibi gelecekte de patolojik bozukluklar, araştırmak için gelecek vaat eden bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26 G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5 mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24 mm x 24 mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a |
References
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
- Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
- Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
- Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
- Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
- Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
- Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
- Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
- Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. The sclera. , Springer. (2012).
- Kiss, F.
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
- Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
- Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
- Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
- Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
- Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
