Abstract
בלובן העין היא רקמת חיבור צפופה שמכסה ומגן על העין. זה מורכב בעיקר חבילות קולגן צפופות (סוגים אני, III, IV, V, VI, ו- VII). בשל autofluorescence, העמימות, והעובי שלה, זה לא נמצא מתאים מיקרוסקופיה confocal. גישה חלופית לזו שהוצגה כאן, אשר משתמשת בלובן העין קבוע בפורמלין מוטבע פרפין עבור אימונוהיסטוכימיה, יש אתגרים טכניים, במיוחד כאשר החימום המוקדם הרקמה לאחזור אנטיגן. מאז בלובן העין הוא דל יחסית בשני התאים וכלי, שימוש דגימות רקמה גדולות שנחקר כדי לסייע במניעת תאים המשקיפה ולהבין הלוקליזציה שלהם ביחס כלי ואתרי אנטומיים אחרים. כדי לאפשר הניתוח של דגימות רקמה גדולות תחת מיקרוסקופ confocal, טכניקת למינציה בוצעה ליצור שכבות דקיקות מן בלובן העין. בעקבות ניתוח התוצאות של כלי הדם CD31 ו hyalu אנדותל כלי הלימפהרונאן קולטן 1 (LYVE1) תאים חיוביים, לגביה אישור לבדיקה מדעית הושג, את היתרונות והמגבלות של שיטה זו הם דנו.
Introduction
בלובן העין היא השכבה החיצונית הנוקשה המכסה את העין, העשוי רקמת חיבור צפופה. זה עוזר להגן על מבנים תוך-עיני וכדי לשמור על לחץ תוך עיני. לפיכך, בלובן העין חיוני לראייה ברורה. זהו ללא כלי הלימפה 1,2 ובכך מהווה גבול חיצוני הלימפה ללא הבינה לבין העין הפנימית ללא הלימפה 3-7. הוא גם מספק אתרים מצורפים עבור שרירי extraocular וחולק דמיון אנטומי עם גידים. מכיוון בלובן העין מורכבת בעיקר צרורות צפופות של סוג אני קולגן יש מספרים קטנים של סוגי קולגן III, IV, V, VI, VIII 8,9 ואלסטין 10,11, רקמה זו אינה קלה לשימוש עבור אימונוהיסטוכימיה.
אנטומית, בלובן העין ניתן לחלק לשלוש שכבות עיקריות: (1) episclera vascularized השטחי, נמצאות מתחת הלחמית הקפסולה של שֶׁגֶם ולקראת הצדדים הבחזרה הדואר של העין מול מסלולו; (2) את stroma scleral, החלק העיקרי של בלובן העין; ו (3) את lamina fusca, המהווה שכבה דקה, פיגמנט ממוקם ישירות מעל עִנבִּיָה. הידע אנטומי שלנו על בלובן העין נובע בעיקר מן המחצית הראשונה של המאה ה -20. באותו זמן, חוקרים בדקו את האנטומיה של כלי דם בעיקר באמצעות זריקות דיו הודו 12 וכלי דם ליהוק 13-15. מאוחר יותר, זה נחקר במחקרים והאנגיוגרפית 16-19.
מאז אותה תקופה, שיטות ישנות שופרו חדשים פותח אפשרו לנו להשלים את הידע האנטומי קודם. לדוגמה, זה כבר רק יותר מעשור אחד מאז היו לנו סמנים הלימפה אמין כמו-1 קולטן hyaluronan ספציפי האנדותל של כלי הדם הלימפה (LYVE1) 20 או 21 podoplanin. מיקרוסקופיה Confocal מציעה אפשרויות חדשות ללימוד התכונות אנטומיות של ti השונהssues של העין. היא מאפשרת כתמים מרובים כדי לשמש להבחנת סמנים של תאים או עבור הלוקליזציה של תאים ביחס כלי דם מבנים אנטומיים אחרים. הוא מספק סקירה כאשר המדגם הוא בגודל גדול יותר ומאפשר לנו לסרוק באמצעות מדגם כאשר בחיפוש אחר סוג תא מסוים. בעזרת טכנולוגיה Z-Stack, מיקרוסקופיה confocal יכול לשמש דגימות עד 100-200 מיקרומטר. בלובן העין שונה בעובי בין 0.3 מ"מ מאחורי הוספות שרירים 1 מ"מ בקוטב האחורי 11. בשל הוא עובי השקיפות שלה, בלובן העין אינו מתאים מיקרוסקופיה confocal בשיטות מסורתיות.
כדי לתקן את זה, רקמות scleral היו למינציה כדי לאפשר ניתוח שלהם עם מיקרוסקופיה confocal. טכנולוגיה זו שימושית להשגת הבנה טובה יותר של שני מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים ב בלובן העין האנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש ברקמות אדם צריך להיות נבדקת ואושר על ידי עושה ועדות מוסדיות או שווה הערך. העבודה המתוארת כאן אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית והיה אישור לבדיקה מדעית. עבודה זו בוצעה על פי הצהרת הלסינקי. דגימות scleral אדם התקבלו מעיני תורמים הגלובוס (HR המקסימלי שלאחר המוות זמן 24) על עיניים בנק מחלקת עיניים, אוניברסיטת קלן, גרמניה.
1. הכנה ניסויית
- כן 96% אתנול וזרחתי בופר (PBS) צינורות שונים. הכן את נוגדנים ראשוניים עם הדילול המומלץ של PBS המכיל אלבומין 2% שור (BSA) ולשמור את כל פתרונות על קרח. כן 100 μl לדגימה.
- יש לנקות את כל המכשירים ולהשתמש אזמלים חדים. אחרי חזר חיתוך עם אותה הסכין, לשנות את האזמל.
- השג 1-2 מלקחיים COLIBRI, מספריים לנתח מיקרו ישר, אזמל # 10או נוצה מיקרו אזמל עיניים, וארבעה 26 מחטים G.
- עוטפים בנייר אלומיניום סביב צלחת קלקר או להשתמש צלחת הפקק כדי להדביק את הרקמה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ סטריאו משקף. עבודה סטרילית מתחת זרימת אוויר למינרית במידת הצורך.
2. מכינים את בלובן העין
- צמד בעדינות את הנורה ולבצע ניקור ניקוב מצד corneoscleral, ולאחר מכן סובב את לִקְדוֹחַ. סובב את לִקְדוֹחַ בזהירות ובאופן שווה על פני השטח כדי לבצע חתך עגול באותה מידה. השתמש לִקְדוֹחַ 15.5 מ"מ בגודל. חותך את המצורפים הנותרים עם מספריים מעוקלים. הסר את הניקור corneoscleral. זה יגרום נורה anteriorly נפתחה.
- שים את בלובן העין על מקלון עם החלק הפתוח כלפי מעלה. הסר את הרשתית עִנבִּיָה, באמצעות מלקחיים COLIBRI למשוך את שתי שכבות (הרשתית עִנבִּיָה) מן בלובן העין. אל תשאירו את עִנבִּיָה פיגמנט על בלובן העין הפנימית. השתמש במספריים מעוגלים כדי להסיר את הרשתית עִנבִּיָה מן הגבשושיות. הסר את remלחמית aining, שרירי extraocular, ו של הקפסולה שֶׁגֶם מן בלובן העין שטחית.
- הסר את מדגם scleral בגודל הנדרש באמצעות מספריים ישרים מסוג ואת מלקחי COLIBRI. קח על 2 ס"מ 2 דגימות scleral בגודל ממקומות שונים. בגלל גודלו הקטן, החזק את בלובן העין בעדינות לגזור לגודל המתאים כריבועים באמצעות מספריים ישר-סוג. ניקור corneoscleral מגדיר את השולים הקדמיים של דגימות scleral.
- הימנע חזר תופס עם מלקחי כאזור שבו רקמת התפס אינה מתאימה מיקרוסקופיה confocal מנתח. הכן את המספר הנדרש של דגימות בהתאם לסוג הניסוי (למשל קדמי לעומת בדיעבד, להשוות איור 1) ואת כמות הנוגדנים בשימוש.
- שים דגימות 1.5 מ"ל צינורות לשימוש מאוחר יותר. תקן דגימות 1.5 מ"ל 96% אתנול במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים בכל 5 דקותב 1.5 מ"ל PBS על שייקר. אם עובד עם רקמה קפוא, לבצע שלב זה לפני ההקפאה תוך שניות ספורות.
- השתמש רקמה טריה. עם זאת, אם הדבר אינו אפשרי, צמד להקפיא את בלובן העין בחנקן נוזלי ולשמור אותו ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. אם עובד עם רקמה קפוא, להפשיר לפני השימוש. הימנע פשרת מעגלים חוזרים ונשנים של הקפאה.
- שמור מדגם ב PBS המכיל BSA 1.5 מ"ל 5% בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. צעד זה גורם לנפיחות של המדגם כי הוא מועיל עבור למינציה וגם מונע מחייב נוקב.
- לאחר הדגימות תפחו, להכין את ריבועי scleral ללמינציה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ, למשל מיקרוסקופ סטריאו משקף. הצמד את דגימות scleral האחוריות הממברנה הקלקר עטוף בנייר אלומיניום או צלחת הפקק באמצעות 26 מחטי G.
- כופפו את הקצוות של מחטים כך שהם לא להפריע את שדה הראייה מתחת למיקרוסקופ.
- למינציה samp scleral בעובי מלאles.
- ראשית, החזק את קצה scleral הקדמי באמצעות מלקחיים COLIBRI. ואז לחתוך בזהירות שכבה דקה של בלובן העין שטחית באמצעות אזמל # 10, הנוצה מיקרו עיניים אזמל, או להב מרית. החזק את האזמל אופקי ולחתוך את השכבה השטחית בצורה רחבה ככל האפשר מן השכבה שמתחת.
- לנתח שכבת scleral דקה מכיכר scleral. שיטה זו ניתן להשוות טכניקות ניתוח סטנדרטיות להכין דש במהלך trabeculectomy וצריך לגרום שכבות עבות 30-80 מיקרומטר (השווה איור 2).
- למנוע התייבשות של בלובן העין על ידי הוספת כמויות קטנות של PBS לרקמה, PBS μl למשל 50 בעזרת פיפטה.
- שים את השכבות לחתוך לתוך 100 μl של PBS ב 96 את הצלחת היטב ולתייג פי הנטייה (לכיוון חצוני ומתמחה) ואת השכבה (שטחי ועמוק) למשל עם צבע עמיד למים.
- חזור על שלבי 2.7-2.9 עד רקמת למינציה מלאה. </ Li>
.3 בצע אימונוהיסטוכימיה
- הוספת 100 μl של הנוגדנים העיקריים הנדרשים לתוך הדילול המומלץ. הנה, למשל, השימוש CD 31 (אדם אנטי עכבר חד שבטי) נוגדני LYVE1 (אדם ארנב נגד), הוא דילול של 1: 100 ב PBS (המכיל 2% BSA) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לשנות את המדיום בצלחת 96 באר, להחזיק פיפטה אל הקיר של הבאר ולהסיר את הנוזל.
- למחרת, לשטוף את דגימות שלוש פעמים בכל 5 דקות עם 200-300 PBS μl על שייקר. הוספת 100 μl של נוגדנים משני המתאימים; כאן להשתמש isothiocyanate והעמסת העכבר עז נגד (FITC) וצבעים cyanine ארנב עז נגד 3 (Cy3), דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. לדלל את הנוגדנים משני 1: 300 ב PBS המכיל סרום עיזים 2%.
- שוטפים את דגימות שוב שלוש פעמים בכל 5 דקות ב 200-300 μl PBS על שייקר.
- בצע מכתים הגרעין, למשל
- העברת דגימות על גבי שקופיות מיקרוסקופ, להטביע אותם 1-2 טיפות של המדיום גובר פלורסנט, להוסיף coverslip, לאטום אותו על ידי כיסוי קצוות עם לכה שקופה, ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר או ישירות לבחון את השקופיות עם confocal מִיקרוֹסקוֹפּ.
- שימוש במיקרוסקופ confocal (או שווה ערך) כדי לנתח את הדגימות. השתמש ההגדלה הרצויה, הגדלה למשל 10-40X.
- כדי לאמת את העובי של הדגימות, למדוד עם מיקרוסקופ confocal באמצעות Z- ערימות. כמות חלקי scleral אפשרי תלויה במיקום של בלובן העין, כמו העובי שונה equatorially ו בדיעבד (השווה מבוא).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסויי הנציג בצעו כאן, ישנם יתרונות להדגמה נגזרים השימוש בטכניקת למינציה המסוימת הזה. הניסוי הראשון ממחיש את הרשת המגוונת של מקלעת כלי דם episcleral בשלוש תמונות נציג (איור 3). הכלי הן חיובי עבור CD31.
הניסוי השני מראה תאים חיסוניים, בפרט LYVE1 + תאים של episclera ויחסיהם אל כלי דם חיובי CD31. הנה טכנולוגיית Z-Stack שימש ב 10X ההגדלה לסרוק דרך רקמת ולהבין יחסי תלת ממדי של כלי הדם ותאי החיסון (איור 4).
בלובן העין, כמו גם את שרירי extraocular הסגורים, ניתן לנתח את קיומו של כלי דם או תאי מערכת חיסון. איור 5 מראהLYVE1 תאים חיוביים וכלי דם חיובי CD31.
איור 1:.. תמונה סכמטי של העין האנושית הנה סכמטי של חתך של העין האנושית אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. תמונה סכמטי של טכניקת למינציה בלובן העין מוחזקת בזהירות עם מלקחי COLIBRI עם למינציה לשכבות בסדר באמצעות אזמל. חוזר על שלב זה מוביל שקופיות רקמה דקות שיכול לשמש עבור מיקרוסקופיה confocal. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של fi זה איור.
איור 3:. מקלעת כלי דם Episcleral, immunopositive עבור CD31 A ו- B נגזרות episclera הקדמי, בעוד C הוא מהמיקום האחורי. בר סולם עולה 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. כלי CD31 + דם LYVE1 + תאים בתוך Z- מחסנית, מציג את יחסי האנטומי בין אותם כלי קטנים בגדולים עשויים לחפוף. בר סולם עולה 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
התחת = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> 
איור 5: מצ"ב בלובן העין הם השרירים extraocular הם מכילים רשת כלי דם בסדר דומה וכמה LYVE1 + תאים.. בר סולם עולה 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למינציה בלובן העין האנושית היא שיטה לביצוע במיקרוסקופ confocal על רקמה זו. שלב קריטי בתהליך זה הוא השימוש באתנול במקום פורמלין עבור הדבקת הרקמה. מניסיוננו, תוצאות טובות יותר מתקבלות כאשר באמצעות אתנול במקום פורמלין עבור קיבעון. אזמלים בלאנט להחמיר את ההליך וכן יש להימנע. באופן דומה, עד הייבוש של בלובן העין יש להימנע, כפי שהוא מסבך את ההליך ומקטין את איכות התמונות.
באשר מכתים immunohistochemical, נוגדנים אחרים מאלו מיושמים כאן ניתן להשתמש. באופן כללי, קולגן מראה יותר פלואורסצנציה אוטומטית ורקע בערוץ הירוק, ולכן אדום, כחול, וערוצי מרחיקות אדומות מראה תוצאות טובות יותר עם רקע פחות.
עם זאת, ישנם מספר מגבלות של הטכניקה. למינציה בלובן העין דורש הרבה תרגול, כפי שהוא הליך מיקרו מבוצע תחת microscאופ. בגלל הטכניקה הזו מתבצעת באופן ידני, את פרוסות למינציה היחידות אינן בדיוק באותו הגודל נבדלות העובי שלהם בתוך פיסת רקמה אחת. כדי לקבל רקמות של בדיוק באותו הגודל, ניקור עשוי להוות אלטרנטיבה, למרות עובי השכבות עדיין להשתנות. כדי להשיג עובי בדיוק שהוגדר עבור סעיפים scleral, גידול microkeratome אוטומטי עשוי להוות אלטרנטיבה ניסויים עתידיים. אם למינציה מבוצע עם שכבות כי הם עבים מדי, שקופית הכיסוי עלולה לנקוע, ואת הרקמה יכולה להתייבש באופן פוטנציאלי. הגבולות המדויקים בין episclera ו stroma עשוי להיות קשה להבדיל פעם laminations מבוצעות.
למרות זאת, למינציה בלובן העין יש מספר יתרונות השימוש אימונוהיסטוכימיה, במיוחד כשמשווים אימונוהיסטוכימיה מוטבע פרפין קבוע בפורמלין, המהווה את השיטה הסטנדרטית במצב הקליני הנוכחי. למינציה בלובן העין מאפשרת microsc confocalעתק להתבצע, באזורים גדולים יותר של בלובן העין להיות מנותח, שכבות שונות של בלובן העין להיבדק, כמו גם הקרנת וסריקה של רקמות. לעומת זאת, כאשר עובדים עם דגימות מוטבעות פרפין פורמלין-קבוע, בלובן העין משתנית העקביות שלה בצורה מועילה במהלך החימום מוקדם לאחזור אנטיגן. לאורך כל תהליך החימום, סיב קולגן להצטמק הרקמה מאבדת קשר עם השקופיות. בעבר, מקלעת הכלי ב episclera הייתה גלויה רק על ידי שימוש בטכניקות והאנגיוגרפית או בתצוגת ההר השלמה, אבל לא חתכים.
בנוסף הקשיים הטכניים, בלובן העין הוא avascular יחסית דל יחסית בתאי מערכת חיסוניים בהשוואה לרקמות אחרות בעיניים, כגון הרשתית. לכן, בעת שימוש שקופיות מוטבעות פרפין קבוע בפורמלין, שהן בדרך כלל 4 מיקרומטר שקופיות עבות מספר נדרשים כדי לזהות תאים חיוביים בלובן העין. לאחרונה, ניתן היה לראות באמצעות מפלסטיק למינציה זהing טכניקה בלובן העין האנושית אינה acellular, אך מכיל שפע של מקרופאגים LYVE1 + לצבור סביב כלי הדם 1.
לסיכום, ביצוע מיקרוסקופיה confocal על סעיפים למינציה scleral הוא כלי מבטיח לחקור הפרעות פתולוגיות בעתיד, כגון scleritis, אובאיטיס, או טראומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26 G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5 mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24 mm x 24 mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a |
References
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
- Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
- Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
- Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
- Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
- Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
- Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
- Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
- Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. The sclera. , Springer. (2012).
- Kiss, F.
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
- Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
- Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
- Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
- Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
- Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
