Ved hjælp af en Laminering teknik til at udføre Konfokal mikroskopi af det menneskelige Sclera

Abstract

Sclera er et tæt bindevæv, der dækker og beskytter øjet. Den består hovedsageligt af tætte kollagen bundter (type I, III, IV, V, VI, og VII). På grund af sin autofluorescens, uigennemsigtighed, og tykkelse, har det ikke vist sig egnet til konfokal mikroskopi. En alternativ fremgangsmåde til den, der præsenteres her, som bruger formalinfikseret sclera indlejret i paraffin for immunhistokemi, har tekniske udfordringer, især når forvarmning af væv til antigen-genvinding. Da sclera er relativt fattige i begge celler og fartøjer, blev brugen af ​​større vævsprøver undersøges for at hjælpe med at forhindre udsigt celler og til at forstå deres lokalisering i forhold til skibe og andre anatomiske steder. At muliggøre analyse af større vævsprøver under det konfokale mikroskop, blev en laminering teknik udføres for at skabe tynde lag fra sclera. Ifølge analysen af ​​resultaterne af CD31 blodkar og lymfekar endotel hyaluRonan receptor 1 (LYVE1) positive celler, hvor der blev opnået godkendelse til videnskabelig undersøgelse, fordele og begrænsninger ved denne metode diskuteres.

Introduction

Sclera er det stive ydre lag, der dækker øjet, som er lavet af tæt bindevæv. Det hjælper til at beskytte intraokulære strukturer og opretholde det intraokulære tryk. Således sclera er absolut nødvendige for klart udsyn. Det er blottet for lymfekar ^1,2 og derved danner en ydre lymfatisk-fri grænse mellem den og lymfe-fri indre øje ^3-7. Det giver også bindingssteder for ekstraokulære muskler og derved deler anatomiske ligheder med sener. Fordi sclera består hovedsageligt af tætte bundter af type I collagen og har et mindre antal kollagentyper III, IV, V, VI, VIII ^8,9 og elastin ^10,11, dette væv er ikke let at bruge for immunhistokemi.

Anatomisk, kan sclera opdeles i tre hovedlag: (1) den overfladiske vaskulariserede episclera, fundet under bindehinden og Tenons kapsel og mod siderne og the bagsiden af ​​øjet overfor kredsløb; (2) den sclerale stroma, den vigtigste del af sclera; og (3) lamina fusca, som er en tynd, pigmenteret lag placeret direkte over uvea. Vores anatomiske viden om sclera stammer hovedsageligt fra den første halvdel af det 20. ^århundrede. På det tidspunkt, forskerne studeret anatomi vaskulatur hovedsageligt ved hjælp af Indien blæk injektioner ¹² og vaskulær støbning ^13-15. Senere blev det undersøgt i angiografiske undersøgelser ^16-19.

Siden den tid har de ældre teknikker blevet forbedret og nye er blevet udviklet, som har givet os mulighed for at supplere tidligere anatomiske viden. For eksempel har det kun været omkring ti år siden vi har haft sådanne pålidelige lymfatiske markører som lymfatisk vaskulært endotel specifik hyaluronan receptor-1 (LYVE1) ²⁰ eller podoplanin ^21. Konfokal mikroskopi giver nye muligheder for at studere de anatomiske træk ved andet TIssues af øjet. Det giver mulighed for flere pletter, der skal anvendes til at differentiere markører af celler eller til lokalisering af celler i forhold til blodkar og andre anatomiske strukturer. Den giver et overblik, når prøven er af en større størrelse og giver os mulighed for at scanne gennem en prøve, når i jagten på en bestemt celletype. Med Z-Stack teknologi, kan konfokal mikroskopi anvendes til prøver op til 100-200 um. Sclera adskiller i tykkelse mellem 0,3 mm bag muskel indsætninger og 1 mm ved den bageste pol ^11. På grund af både dens tykkelse og uigennemsigtighed, sclera er ikke egnet til konfokal mikroskopi under anvendelse af traditionelle metoder.

For at afhjælpe dette, blev sclerale væv lamineret for at muliggøre deres analyse med konfokal mikroskopi. Denne teknologi er nyttig til at opnå en bedre forståelse af både fysiologiske og patologiske situationer i den menneskelige sclera.

Protocol

Brugen af ​​humane væv skal gennemgås og godkendes af en institutionel Review Board eller tilsvarende. Den her beskrevne arbejde blev godkendt af de lokale etiske komité og havde godkendelse til videnskabelig undersøgelse. Dette arbejde blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. De menneskelige sclerale prøver blev indhentet fra øjnene af kloden donorer (maksimal post mortem tid 24 timer) på Eye Bank of Department of Ophthalmology, universitetet i Köln, Tyskland.

1. Eksperimentel Forberedelse

1. Forbered 96% ethanol og phosphatbufret saltvand (PBS) i forskellige rør. Forbered de primære antistoffer i den anbefalede fortynding af PBS indeholdende 2% bovint serumalbumin (BSA) og holder alle løsninger på is. Forbered 100 pi per prøve.
2. Rengør alle instrumenter og bruge skarpe skalpeller. Efter gentagen skæring med samme skalpel, ændre skalpel.
3. Opnå 1-2 colibri pincet, lige mikro dissekere saks, en # 10 skalpeleller oftalmisk skalpel mikro fjer, og fire 26 g nåle.
4. Wrap aluminiumsfolie omkring en polystyren plade eller bruge en kork plade til at anbringe vævet. Arbejde under en kikkert stereo mikroskop. Arbejde sterile under en laminar luftstrøm, hvis nødvendigt.

2. Forbered Sclera

1. Hold forsigtigt pæren og udføre en perforering trepanation på corneoscleral del, drej trepan. Drej trepan forsigtigt og jævnt på overfladen til at udføre en lige så runde cut. Brug en 15,5 mm størrelse trepan. Skær de resterende vedhæftede filer med krum saks. Fjern corneoscleral trepanation. Dette vil resultere i en fortil åben pære.
   1. Sætte sclera på en vatpind med den åbne del opad. Fjern nethinden og uvea, ved hjælp af colibri pincet til at trække ud begge lag (nethinden og uvea) fra sclera. Lad ikke pigmenteret uvea på den indre sclera. Brug krum saks til at fjerne nethinden og uvea fra papilla. Fjern remaining conjunctiva, ekstraokulære muskler, og Tenons kapsel fra den overfladiske sclera.
2. Fjern skleral prøve i den ønskede størrelse ved hjælp af straight-type saks og Colibri pincet. Tage omkring 2 cm ² mellemstore sclerale prøver fra forskellige steder. På grund af den lille størrelse, holde senehinden blidt og skære den ønskede størrelse som firkanter ved hjælp af straight-type saks. Den corneoscleral trepanation definerer den forreste margin af de sclerale prøver.
   1. Undgå gentagen opsigtsvækkende med pincet som det område, hvor vævet blev greb er ikke egnet til konfokal mikroskopi analyser. Forbered krævede antal prøver afhængig af eksperimentet (f.eks anteriort vs. bagtil, sammenligne figur 1), og mængden af antistoffer anvendes.
3. Sætte prøverne i 1,5 ml rør til senere brug. Fix prøverne i 1,5 ml 96% ethanol i 15 minutter, og derefter vaske dem tre gange hver i 5 minutteri 1,5 ml PBS på rysteapparatet. Hvis du arbejder med frosne væv, udføre dette trin, før snap frysning.
4. Brug frisk væv. Men hvis dette ikke er muligt, snap fryse sclera i flydende nitrogen og opbevares ved -20 ° C til senere brug. Hvis du arbejder med frosne væv, tø før brug. Undgå gentagen optøning og frysning cyklusser.
5. Hold hver prøve i PBS indeholdende 1,5 ml 5% BSA ved stuetemperatur i 2 timer. Dette trin inducerer en hævelse af prøven, der er nyttige for laminering og forhindrer også uspecifik binding.
6. Efter prøverne har svulmede, forberede sclerale pladser til laminering. Arbejde under et mikroskop, fx en kikkert stereo mikroskop. Anbringe de bageste sclerale prøverne til polystyren membran indpakket i aluminiumsfolie eller kork plade ved hjælp af de 26 g nåle.
7. Bøj kanterne af nålene, så de ikke forstyrrer synsfeltet under mikroskopet.
8. Laminere fuld tykkelse sclerale Samples.
   1. Først holde den forreste sclera kanten med colibri pincet. Klip forsigtigt et tyndt lag af den overfladiske sclera med # 10 skalpel, den oftalmiske skalpel mikro fjer, eller en spatel klinge. Hold skalpel vandret og skære det overfladiske lag som tyndt som muligt fra det underliggende lag.
   2. Dissekere et tyndt scleral lag fra sclera torv. Denne metode kan sammenlignes med standard kirurgiske teknikker til fremstilling af en klap under trabekulektomi og bør resultere i 30-80 um tykke lag (sammenlign figur 2).
9. Forhindre udtørring af sclera ved tilsætning af små mængder af PBS til vævet, fx 50 pi PBS ved anvendelse af en pipette.
10. Sætte de afskårne lag i 100 pi PBS i 96 brønd pladen og mærke både orienteringen (mod extern og intern) og laget (overfladisk og dyb) fx med en vandtæt farve.
11. Gentag trin 2,7-2,9 indtil vævet er fuldt lamineret. </ Li>

3. Udfør Immunhistokemi

1. Tilsæt 100 pi af de påkrævede primære antistoffer i den anbefalede fortynding. Her, f.eks brug CD 31 (monoklonalt muse anti human) og LYVE1 antistof (kanin-anti human), både i en fortynding på 1: 100 i PBS (indeholdende 2% BSA) og inkuberes ved 4 ° C natten over. At ændre mediet i pladen med 96 brønde, holde pipetten til væggen af ​​borehullet og fjerne væsken.
2. Den næste dag, vaske prøverne tre gange hver i 5 minutter med 200-300 pi PBS på rysteapparatet. Tilsæt 100 pi af de tilsvarende sekundære antistoffer; her bruger gede anti mus fluoresceinisothiocyanat (FITC) og gede-anti kanin cyaninfarvestoffer 3 (Cy3), og inkuber prøverne ved stuetemperatur i 1-2 timer. Fortynd de sekundære antistoffer 1: 300 i PBS indeholdende 2% gedeserum.
3. Skyl prøverne igen tre gange hver i 5 minutter i 200-300 pi PBS på rysteapparatet.
4. Udfør nucleus farvning, f.eks
5. Overfør prøverne på objektglas, integrere dem i 1-2 dråber af fluorescerende montering medium, tilføje et dækglas, forsegle det ved at dække kanterne med gennemsigtig lak, og opbevares ved 4 ° C til senere brug eller direkte undersøge dias med konfokale mikroskop.
6. Brug et konfokalt mikroskop (eller tilsvarende) til at analysere prøverne. Brug den ønskede forstørrelse, f.eks 10-40X forstørrelse.
7. For at verificere tykkelsen af ​​prøverne, måle med konfokal mikroskopi hjælp Z-stakke. Mængden af ​​mulige sclerale sektioner afhænger af placeringen af ​​sclera, som tykkelsen afviger equatorially og bagtil (sammenlign indledning).

Representative Results

I de repræsentative forsøg udført her, er der påviselige fordele stammer fra anvendelsen af ​​denne særlige laminering teknik. Det første eksperiment illustrerer de forskellige netværk af episcleral blodkar plexus i tre repræsentative billeder (Figur 3). Skibene er positive for CD31.

Det andet eksperiment viser immunceller, især LYVE1 + celler i episclera og deres forhold til de CD31 positive blodkar. Her blev Z-Stack teknologi, der anvendes ved 10X forstørrelse til at scanne gennem vævet og forstå tredimensionale relationer blodkar og immunceller (figur 4).

Sclera, samt de vedlagte ekstraokulære muskler, kan analyseres for tilstedeværelsen af blodkar eller immunceller. Figur 5 viserLYVE1 positive celler og CD31 positive blodkar.

Figur 1:.. Skematisk Billede af det menneskelige øje Her er en skematisk af tværsnittet af det menneskelige øje Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2:. Skematisk billede af Laminering Teknik sclera er omhyggeligt holdt med Colibri pincet og lamineret til fine lag under anvendelse af en skalpel. Gentagelse dette trin fører til tynde væv dias, der kan bruges til konfokal mikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3:. Episcleral blodkar Plexus, immunpositive for CD31 A og B er afledt af den forreste episclera, mens C er fra den bageste placering. Scale bar indikerer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4:. CD31 + blodkar og LYVE1 + Celler i en z-stak, viser de anatomiske forbindelser mellem disse små fartøjer og større virksomheder kan overlappe hinanden. Scale bar indikerer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Indkapslet i sclera er de ekstraokulære Muskler De indeholder en tilsvarende fin blodkar netværk og nogle LYVE1 + -celler.. Scale bar indikerer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Laminering af menneskelige sclera er en fremgangsmåde til udførelse konfokal mikroskopi på dette væv. Et kritisk trin i denne proces er anvendelsen af ​​ethanol i stedet for formalin til fastgørelse af væv. Det er vores erfaring, opnås bedre resultater, når anvendelse af ethanol i stedet for formalin til fiksering. Blunt skalpeller forværre den procedure og bør undgås. Ligeledes bør undgås udtørring af sclera, som det komplicerer proceduren og forringer kvaliteten af ​​billederne.

Med hensyn til immunohistokemisk farvning, kan andre antistoffer end andelene i her. Generelt collagen viser mere autofluorescens og baggrund i den grønne kanal, derfor rød, blå og langt-rød kanaler viser bedre resultater med mindre baggrund.

Der er imidlertid flere begrænsninger af teknikken. Laminere sclera kræver megen øvelse, da det er en mikrokirurgisk procedure udført under en Microscope. Fordi denne teknik udføres manuelt, de samlede laminerede udsnit er ikke nøjagtig samme størrelse og adskiller sig i deres tykkelse inden for et stykke væv. At have væv af nøjagtig samme størrelse, kan trepanation være et alternativ, selvom tykkelsen af ​​lagene stadig vil variere. For at opnå en nøjagtigt defineret tykkelse for de sclerale sektioner, kan en automatiseret mikrokeratom være et alternativ for fremtidige eksperimenter. Hvis laminering udføres med lag, der er for tyk, kan dækslet slide forskyde, og vævet kan potentielt tørre ud. De præcise grænser mellem episclera og stroma kan være svært at skelne, når lamellerne udføres.

Trods dette laminere senehinden har adskillige fordele i brugen af ​​immunhistokemi, især sammenlignet med formalin-fikserede paraffin indlejret immunhistokemi, som er standardmetoden i den aktuelle kliniske situation. Laminere sclera tillader konfokal Microscopier skal udføres, større størrelse områder af sclera, der skal analyseres, forskellige lag af sclera, der skal undersøges, samt screening og scanning af væv. I modsætning hertil når der arbejdes med formalin-fikserede paraffin-indlejrede prøver, ændrer sclera dens sammenhæng i en lidet måde under forvarmning for antigen hentning. Hele opvarmningsprocessen, collagenfibrene visne og vævet mister kontakten med glideren. Tidligere har skibet plexus i episclera kun været synlig ved hjælp af angiografiske teknikker eller i hele mount visning, men ikke i tværsnit.

Ud over de tekniske vanskeligheder, sclera er relativt avaskulære og relativt fattig på immunceller i forhold til andre væv i øjet, såsom nethinden. Derfor, når anvendelse af formalin-fikserede paraffin indlejrede objektglas, der normalt 4 um tykke, flere dias er nødvendige for at detektere positive celler i sclera. For nylig blev det vist ved hjælp af denne laminating teknik, at den menneskelige sclera er ikke acellulær, men indeholder masser af LYVE1 + makrofager at akkumulere omkring blodkar ^1.

For at opsummere, udfører konfokal mikroskopi på laminerede sclerale sektioner er et lovende redskab til at undersøge patologiske lidelser i fremtiden, såsom scleritis, uveitis, eller traumer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26 G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5 mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24 mm x 24 mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a