人間の強膜の共焦点顕微鏡法を実行するために積層技術を用いて、

Abstract

強膜はカバーし、目を保護する密な結合組織です。これは、主に高密度のコラーゲン束（タイプI、III、IV、V、VI、及びVII）からなります。 、その自己蛍光、不透明さ、及び厚さは、共焦点顕微鏡法のために適切であることが見出されていません。免疫組織化学のためにパラフィンに包埋ホルマリン固定強膜を使用して、ここに提示されている1つの代替アプローチは、抗原回復のための組織を予熱する場合は特に、技術的な課題があります。強膜は、細胞及び血管の両方において比較的悪いため、大きな組織サンプルを使用することは、望む細胞を防ぎ、血管および他の解剖学的部位に関連し、その局在化を理解するのに役立つように調べました。共焦点顕微鏡下でより大きな組織サンプルの分析を可能にするために、積層技術は、強膜の薄層を作成するために行きました。 CD31血管およびリンパ管の内皮hyaluの結果の分析を以下のローナン受容体1（LYVE1）科学的な審査の承認が得られたために陽性細胞は、この方法の利点と限界が議論されています。

Introduction

強膜は、密性結合組織で構成されている、目を覆う硬質の外側の層です。それは、眼内の構造を保護し、眼内圧を維持するのに役立ちます。このように、強膜は、明確なビジョンのために不可欠です。これは、リンパ管^1,2を欠いており、それによって、それとリンパのない眼の内部^3-7との間に、外リンパのない境界線を形成しています。また、それによって腱と解剖学的類似性を共有し、外眼筋のための結合部位を提供します。 強膜は、主にI型コラーゲンの密な束で構成され、コラーゲンタイプIII、IV、V、VI、VIII ^8,9及びエラスチン^10,11のより小さい数を有するため、この組織は、免疫組織化学のために使用することは容易ではありません。

（1）表在血管新生した上強膜、結膜およびテノン嚢の下に発見され、側面と目に向けて：解剖学的に、強膜は、3つの主要な層に分離することができます電子バック軌道に直面して、目の。 （2）強膜間質、強膜の主要部分を、 （3）直接ブドウ膜の上に位置する薄い着色層であるラミナフスカ、。強膜に関する当社の解剖学的知識は、20 ^世紀の前半から主茎。当時、研究者は、主にインドのインク注入¹²と血管キャスティング^13-15を使用して、血管系の解剖学を研究しました。その後、それは血管造影の研究^16-19で調査しました。

その時以来、古い技術が改善されていると新しいものは、私たちは前の解剖学的知識を補完することができましたが開発されています。我々はリンパ血管内皮特異的なヒアルロン酸受容体^{1（LYVE1）20}またはポドプラニン²¹のような信頼性のリンパマーカーを持っていたので、例えば、それは約10年となっています。共焦点顕微鏡は、異なるTIの解剖学的特徴を研究するための新たな可能性を提供しています目のssues。複数の汚れが細胞のマーカーを区別するための又は血管及び他の解剖学的構造に関連する細胞の局在のために使用されることが可能になります。サンプルはより大きなサイズのものであり、ときに特定の細胞型の検索では、私たちはサンプルをスキャンすることを可能にするとき、それは概要を説明します。 Zスタック技術を、共焦点顕微鏡は、100〜200マイクロメートルまでのサンプルのために使用することができます。強膜は、筋肉の挿入および後部磁極¹¹で1ミリメートルの背後に0.3ミリメートルの厚さが異なります。その厚さと不透明さの両方のために、強膜は、伝統的な方法を用いた共焦点顕微鏡観察には適していません。

これを解決するには、強膜組織は、共焦点顕微鏡との分析を可能にするために積層しました。この技術は、人間の強膜の両方の生理学的および病理学的状況のより良い理解を得るために有用です。

Protocol

ヒト組織の使用を見直し、施設内倫理委員会または同等の承認を得なければなりません。ここで説明する作業は、地元の倫理委員会によって承認され、科学的審査の承認を持っていました。この作品は、ヘルシンキ宣言に従って実施しました。人間の強膜標本は、眼科学科のアイバンク、ケルン大学、ドイツで（最大死後時間24時間）、地球ドナーの目から得ました。

1.実験の準備

1. 96％エタノールを調製し、別のチューブ中で緩衝化生理食塩水（PBS）をリン酸。 2％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSの推奨希釈率で一次抗体を調製し、氷上で全ての溶液を保持します。サンプルあたり100μlのを準備します。
2. すべての楽器をきれいにし、鋭いメスを使用しています。同じメスで切断を繰り返した後、メスを変更します。
3. 1-2コリブリ鉗子、ストレートマイクロ解剖ハサミ、＃10メスを取得または眼科用メスマイクロ羽、および4 26 G針。
4. ポリスチレン板の周りにアルミホイルを巻きまたは組織を固定するためにコルク板を使用しています。双眼実体顕微鏡の下に働きます。必要に応じて層流の下に滅菌作業。

2.強膜を準備

1. 静かに電球を保持し、強角膜部分に穿孔穿孔を行い、その後、トレパンを回転させます。均等にラウンドカットを実行するために表面に慎重かつ均等にトレパンを回転させます。 15.5ミリメートルサイズのトレパンを使用してください。湾曲したハサミで残りの添付ファイルをカットします。強角膜穿孔を削除します。これは、前方に開いた電球になります。
   1. 上向きに開口部を持つ綿棒に強膜を置きます。強膜からの両方の層（網膜およびブドウ膜）をやってのけるコリブリ鉗子を使用して、網膜およびブドウ膜を削除します。内側の強膜に色素性ブドウ膜を放置しないでください。乳頭から網膜およびブドウ膜を除去するために、湾曲したハサミを使用してください。レムを削除しますaining結膜、外眼筋、および表面的な強膜からのテノン嚢。
2. ストレート型はさみとコリブリ鉗子を使用して、必要なサイズの強膜サンプルを削除してください。約2cmに別の場所から²サイズ強膜サンプルを取ります。そのため、小さなサイズで、優しく強膜を保持し、ストレート型のはさみを使用して、正方形として必要なサイズを切り出します。強角膜穿孔は強膜サンプルの前縁を定義します。
   1. 繰り返しつかまれた組織は、共焦点顕微鏡分析のために適していない領域として鉗子でつかんでは避けてください。実験の種類に応じて、サンプルの必要な数を用意（ 例えば、前方対後方、 図1と比較）及び使用される抗体の量は。
3. 後で使用するために、1.5ミリリットルチューブにサンプルを置きます。 15分間1.5ミリリットル96％エタノール中のサンプルを修正し、その後、5分間、それらを各3回を洗いますシェーカー上で1.5ミリリットルのPBSインチ凍結組織で作業する場合は、スナップ凍結する前にこの手順を実行します。
4. 新鮮な組織を使用してください。これが不可能な場合には、液体窒素中で強膜を凍結し、後で使用するために-20℃でそれを維持スナップ。凍結組織で作業する場合は、使用前に解凍。解凍と凍結の繰り返し繰り返しは避けてください。
5. 2時間室温で1.5ミリリットルの5％BSAを含むPBS中で各サンプルを保管してください。このステップでは、積層するのに役立つサンプルの膨潤を誘発し、また、非特異的結合を防ぐことができます。
6. サンプルが膨潤した後、積層に強膜の正方形を準備します。 例えば 、双眼実体顕微鏡顕微鏡の下に働きます。 26 G針を使用して、アルミ箔やコルク板に包まれたポリスチレン膜に後部強膜のサンプルを貼り付けます。
7. 彼らは、顕微鏡下に視野を妨げることはありませんので、針の端を曲げます。
8. 全層強膜SAMPを積層レ。
   1. まず、コリブリ鉗子を使用して、前方の強膜のエッジを保持します。その後、慎重に＃10メス、眼科用メスマイクロ羽、またはへらの刃を用いて表面的な強膜の薄い層をカット。水平にメスを持ち、下地層からできるだけ薄く表層を切りました。
   2. 強膜広場から薄い強膜層を分析。この方法は、線維柱帯切除術の際にフラップを準備する標準的な外科技術に匹敵し、30-80μmの厚い層（ 図2を比較）をもたらすべきです。
9. 例えば 、50μlのPBSをピペットを用いて組織にPBSを少量添加することにより、強膜の乾燥を防ぎます。
10. 防水色で例えばと層（表面的で深遠な）（はexternとインターンの方に）96ウェルプレートに100μlのPBSにカット層を入れて、両方の向きにラベルを付けます。
11. 組織が完全に積層されて繰り返して、2.7から2.9を繰り返します。</李>

3.免疫組織化学を実行します

1. 推奨希釈に必要な一次抗体を100μlを追加します。ここでは、 例えば、使用CD 31（モノクローナルマウス抗ヒト）およびLYVE1抗体（ウサギ抗ヒト）、1の希釈の両方において（2％BSAを含む）PBS 100と一晩4℃でインキュベートします。 96ウェルプレート中の培地を変更するには、ウェルの壁にピペットを保持し、流体を除去。
2. 翌日、シェーカー上で200から300μlのPBSで5分間のサンプルを3回ずつ洗浄します。対応する二次抗体を100μlを追加します。ここでヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびヤギ抗ウサギシアニン染料3（Cy3の）を使用し、1-2時間室温でサンプルをインキュベートします。 2％ヤギ血清を含むPBS中で300：二次抗体1を希釈。
3. シェーカー上で200から300μlのPBS中で5分間、再び3回ずつサンプルをすすいでください。
4. 核染色を行い、 例えば
5. 、顕微鏡スライド上にサンプルを転送し、蛍光封入剤の1〜2滴でそれらを埋め込む、カバースリップを追加し、透明ニスでエッジを覆うことにより、それをシールし、4℃で保存し、後で使用するために、または直接共焦点でスライドを調べます顕微鏡。
6. サンプルを分析するために、共焦点顕微鏡（または同等）を使用します。所望の倍率、 例えば 10-40X倍率を使用してください。
7. サンプルの厚さを確認するには、Z-スタックを用いた共焦点顕微鏡で測定します。厚さは赤道と後方（導入を比較）異なるので可能な強膜の部分の量は、強膜の場所によって異なります。

Representative Results

ここで行う代表的な実験では、この特定の積層技術の使用に由来する明白な利点があります。最初の実験は、3つの代表的な写真（ 図3）内の強膜上の血管叢の多様なネットワークを示す図です。血管はCD31陽性です。

第二の実験は、特定のLYVE1 +上強膜の細胞とCD31陽性の血管との関係では、免疫細胞を示しています。ここで、Zスタック技術は、組織をスキャンし、血管及び免疫細胞（ 図4）の三次元関係を理解するために10倍の倍率で使用しました。

強膜、並びに囲まれた外眼筋は、血管または免疫細胞の存在について分析することができる。図5図LYVE1陽性細胞とCD31陽性の血管。

図1：人間の眼の模式画像がここで人間の目の断面の概略図である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：積層技術の概略画像強膜を慎重コリブリ鉗子で開催され、メスを用いて微細な層に積層されています。このステップを繰り返すこと、共焦点顕微鏡観察のために使用することができ、薄い組織スライドにつながる。 このFiのの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。グレ。

図3：Cは後方の位置からである間上強膜血管神経叢は、CD31 AとB のための免疫は 、前方上強膜に由来しています。スケールバーは100μmを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：CD31 +血管およびzスタックでLYVE1 +細胞、それらの間の解剖学的関係を示す小型船舶と大きいものが重なってもよいです。スケールバーは100μmを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5：強膜で囲まは、外眼の筋肉である彼らは、同様の微細な血管網といくつかのLYVE1 +細胞を含みます。スケールバーは200μmで示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

人間の強膜を積層することは、この組織の共焦点顕微鏡検査を行う方法です。このプロセスにおける重要なステップは、組織を固定するための代わりホルマリンエタノールの使用です。代わりに、固定のためにホルマリンのエタノールを使用する場合に我々の経験では、より良好な結果が得られます。ブラントメスは、プロシージャを悪化させるし、避けるべきです。同様に、強膜の乾燥まで、それは手順を複雑にし、画像の品質を低下させるように、避けるべきです。

免疫組織化学的染色に関しては、ここで適用されるもの以外の抗体を使用することができます。一般的に、コラーゲンは緑チャネルでより多くの自己蛍光およびバックグラウンドを示し、したがって、赤、青、遠赤チャンネルが少ない背景とのより良い結果を示しています。

しかし、技術のいくつかの制限があります。それはmicrosc下で行う顕微手順であるとして強膜を積層することは、たくさんの練習が必要ですOPE。この技術は手動で実行されるため、単一の積層スライスは正確に同じ大きさではなく、組織の一枚以内にその厚さが異なります。層の厚さは依然として異なりますが、まったく同じ大きさの組織を持っているために、穿孔は、代替可能性があります。強膜セクションの正確に規定された厚さを達成するために、自動化されたマイクロケラトームは、将来の実験のための代替可能性があります。ラミネーションが厚すぎる層で実行された場合、カバースライドを脱臼することができ、組織が潜在的に乾燥することができます。上強膜と間質との間の正確な境界はラミネーションが実行されると区別するのは難しいかもしれません。

これにもかかわらず、強膜を積層すると、現在の臨床状況における標準的な方法であるホルマリン固定パラフィン包埋、免疫組織化学、と比較場合は特に、免疫組織化学の使用にいくつかの利点があります。強膜を積層して、共焦点microscを可能にしますOPYは、強膜のより大きなサイズの領域を分析するために、実行される強膜の異なる層、並びに、スクリーニングおよび組織のスキャンを検査します。ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルで作業する場合は対照的に、強膜は、抗原回復のための予熱時に助けにならない方法で、その一貫性を変化させます。加熱プロセスを通して、コラーゲン線維がしなびおよび組織は、スライドとの接触を失います。以前は、上強膜における血管叢だけではなく、断面で、血管造影技術を使用して、または全体マウントビューに表示されています。

技術的な問題に加えて、強膜は、網膜のような目で他の組織に比べて免疫細胞中で比較的無血管や比較的貧弱です。通常、厚さ4μm、複数のスライドであるホルマリン固定パラフィン包埋スライドを使用した場合従って、強膜に陽性の細胞を検出するために必要とされます。最近では、このlaminatを使用して示されました人間の強膜が無細胞ではなく、血管^1の周囲^に蓄積するLYVE1 +マクロファージがたっぷり含まれている技術をる。

積層強膜切片上で、共焦点顕微鏡検査を行って、要約すると、このような強膜炎、ブドウ膜炎、または外傷などの将来の病理学的障害を調査するための有望なツールです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26 G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5 mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24 mm x 24 mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a