Ved hjelp av en Laminering teknikk for å utføre Konfokalmikroskopi av Human Sclera

Abstract

Senehinnen er en tett bindevev som dekker og beskytter øyet. Den består hovedsakelig av kollagen tette bunter (typene I, III, IV, V, VI og VII). På grunn av sin autofluorescens, ugjennomskinnelighet, og tykkelse, har det ikke blitt funnet å være egnet for konfokal mikroskopi. En alternativ tilnærming til den som presenteres her, som bruker formalinfiksert sklera innstøpt i parafin for immunhistokjemi, har tekniske utfordringer, spesielt når forvarming av vev for antigenet gjenfinning. Siden sclera er forholdsvis fattig på begge cellene og fartøyer, ble bruken av større vevsprøver utforsket for å forhindre over-celler og for å forstå deres lokalisering i forhold til skip og andre anatomiske steder. For å tillate analyse av større vevsprøver under konfokale mikroskop, ble en lamineringsteknikk utført for å skape tynne lag fra senehinnen. Etter analyse av resultater av CD31 blodkar og lymfekar endothelial hyaluRonan reseptor 1 (LYVE1) positive celler, som ble innhentet godkjenning for vitenskapelig undersøkelse, fordeler og begrensninger av denne metoden blir diskutert.

Introduction

Senehinnen er det stive ytre lag som dekker øyet, som er laget av tett bindevev. Det bidrar til å beskytte intraokulære strukturer og for å opprettholde intraokulært trykk. Således er det sclera avgjørende for klart syn. Det er blottet for lymfekar ^1,2 og derved danner en ytre lymfatisk fritt grensen mellom det og det lymfatiske frie indre øye ^3-7. Det gir også festeplasser for extraocular muskler, og dermed dele anatomiske likheter med sener. Fordi sclera hovedsakelig består av tette bunter av type I kollagen og har et mindre antall av kollagen type III, IV, V, VI, VIII ^8,9 og elastin ^10,11, er dette vev ikke er lett å bruke for immunhistokjemi.

Anatomisk, kan sclera deles inn i tre hoved lag: (1) den overfladiske vaskularisert episclera, som finnes på undersiden av konjunktiva og tappen s kapsel og mot sidene og the bakre del av øyet som vender mot banen; (2) den skleral stroma, hoveddelen av sclera; og (3) lamina fusca, som er en tynn, pigmentert lag som ligger direkte over uvea. Vår anatomisk kunnskap om sclera stammer hovedsakelig fra første halvdel av det ^20. århundre. På den tiden forskerne studert anatomi av blodkar i hovedsak ved hjelp av tusj injeksjoner ¹² og vaskulær støping ^13-15. Senere ble det forsket på angiografiske studier ^16-19.

Siden den gang har eldre teknikker blitt forbedret, og nye har blitt utviklet som har tillatt oss å supplere tidligere anatomisk kunnskap. For eksempel har det bare vært om ett tiår siden vi har hatt slike pålitelige lymfatiske markører som lymfatisk vaskulærendotelet bestemt hyaluronan reseptor-1 (LYVE1) ²⁰ eller podoplanin ^21. Konfokalmikroskopi gir nye muligheter for å studere anatomiske trekk ved de forskjellige tissues i øyet. Det gir mulighet for flere flekker som skal brukes for å differensiere markører for celler eller for lokalisering av celler i forhold til blodkar og andre anatomiske strukturer. Det gir en oversikt når prøven er av større størrelse og gir oss mulighet til å søke gjennom en prøve når på jakt etter en bestemt celletype. Med Z-Stack teknologi, kan konfokal mikroskopi brukes for prøver opp til 100-200 um. Sclera forskjellig i tykkelse mellom 0,3 mm bak muskel innsettinger og en mm på bakre pol ^11. Både på grunn av sin tykkelse og ugjennomskinnelighet, er sclera ikke egnet for konfokal mikroskopi ved hjelp av tradisjonelle metoder.

For å bøte på dette, ble scleral vev laminert for å tillate sin analyse med konfokalmikroskopi. Denne teknologien er nyttig for å få en bedre forståelse av både fysiologiske og patologiske tilstander i det menneskelige sclera.

Protocol

Bruken av menneskelig vev må gjennomgås og godkjennes av en institusjonell gjennomgang bord eller tilsvarende. Arbeidet er beskrevet her ble godkjent av lokale etikkutvalg og hadde godkjenning for vitenskapelig undersøkelse. Dette arbeidet ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen. De menneskelige scleral prøver ble innhentet fra øynene til kloden givere (maks post-mortem tid 24 timer) på Eye Bank of Department of Ophthalmology, Universitetet i Köln, Tyskland.

1. Eksperimentell Forberedelse

1. Fremstille 96% etanol, og fosfatbufret saltløsning (PBS) i forskjellige rør. Fremstille de primære antistoffer i den anbefalte fortynning av PBS inneholdende 2% bovint serumalbumin (BSA) og holde alle løsninger på is. Forbered 100 mL per prøve.
2. Rengjør alle instrumenter og bruk skarpe skalpeller. Etter gjentatte kutte med samme skalpell, endre skalpell.
3. Skaff 1-2 Colibri tang, rette mikro dissekere saks, en # 10 skalpelleller øyen skalpell micro fjær, og fire 26 G nåler.
4. Pakk aluminiumsfolie rundt en isopor plate eller bruke en kork plate å feste vev. Arbeid under en kikkert stereo mikroskop. Arbeid sterilt under en laminær luftstrøm hvis nødvendig.

2. Klargjør Sclera

1. Hold forsiktig pæren og utføre en perforering trepanasjon på corneoscleral del, roter deretter trepan. Roter trepan forsiktig og jevnt på overflaten for å utføre en like runde snitt. Bruk en 15,5 mm størrelse trepan. Skjær de resterende vedlegg med buede saks. Fjern corneoscleral trepanasjon. Dette vil resultere i en anteriort åpnet pære.
   1. Sett sclera på en bomullspinne med den åpne delen oppover. Fjern netthinnen og uvea, ved hjelp av colibri tang til å trekke av begge lag (netthinnen og uvea) fra sclera. Ikke la pigmentert uvea på den indre sclera. Bruk buet saks for å fjerne netthinnen og uvea fra papilla. Fjern reminnelukker conjunctiva, extraocular muskler, og tenon er kapselen fra overfladiske sclera.
2. Fjern skleral prøven i ønsket størrelse ved å bruke rett-type saks og Colibri tang. Ta ca 2 cm ² store scleral prøver fra forskjellige steder. På grunn av den lille størrelsen, hold sclera forsiktig og kutte ut den nødvendige størrelse som firkanter ved hjelp av rett-type saks. Den corneoscleral trepanasjon definerer fremre margin av scleral prøvene.
   1. Unngå gjentatt gripe med pinsett som det området hvor vevet ble fanget er ikke egnet for konfokal mikroskopi-analyser. Fremstille det nødvendige antall prøver, avhengig av forsøket type (f.eks anteriort vs. baktil, sammenlign figur 1), og mengden av antistoffer som brukes.
3. Sett prøvene i 1,5 ml rør for senere bruk. Fiks prøvene i 1,5 ml 96% etanol i 15 min, og deretter vaske dem tre ganger hver i 5 mini 1,5 ml PBS på shaker. Hvis du arbeider med frossent vev, utføre dette trinnet før snap frysing.
4. Bruk friske vevet. Imidlertid, hvis dette ikke er mulig, smekk fryse sclera i flytende nitrogen og oppbevares ved -20 ° C for senere bruk. Hvis du arbeider med frossent vev, tine før bruk. Unngå gjentatt tining og frysing sykluser.
5. Hold hver prøve i PBS inneholdende 1,5 ml 5% BSA ved romtemperatur i 2 timer. Dette trinnet induserer en hevelse av prøven som er nyttig for laminering og også forhindrer uspesifikk binding.
6. Etter at prøvene har svulmet, forberede scleral rutene for laminering. Arbeid under et mikroskop, for eksempel en kikkert stereo mikroskop. Fest de bakre scleral prøvene til polystyren membran innpakket i aluminiumsfolie eller korken platen ved hjelp av 26 g nåler.
7. Bøye kantene av nålene, slik at de ikke forstyrrer den visuelle feltet under mikroskopet.
8. Å laminere den full tykkelse skleral samples.
   1. Først holder fremre scleral kanten med Colibri tang. Deretter forsiktig kuttet et tynt lag av den overflatiske sclera ved bruk av # 10 skalpell, den oftalmiske skalpell mikro fjær, eller en spatel blad. Hold skalpell horisontalt og kutte den overflatiske lag så tynt som mulig fra det underliggende lag.
   2. Dissekere et tynt scleral lag fra scleral torget. Denne metoden er sammenlignbare med standard kirurgiske teknikker for å fremstille en klaff under trabeculectomy og bør resultere i 30-80 mikrometer tykke lag (sammenlign figur 2).
9. Hindre uttørking av sclera ved å tilsette små mengder av PBS til vevet, for eksempel 50 ul PBS ved hjelp av en pipette.
10. Sett de kutt sjikt inn i 100 pl av PBS i 96-brønners plate og merke både retning (mot extern og intern) og det lag (overfladisk og dyp) for eksempel med en vanntett farge.
11. Gjenta trinn 2,7-2,9 før vevet er fullt laminert. </ Li>

3. Utfør Immunohistokjemi

1. Tilsett 100 ul av de nødvendige primære antistoffer til den anbefalte fortynning. Her, for eksempel bruk CD 31 (monoklonalt muse anti-humant) og LYVE1 antistoff (kanin-anti-humant), begge i en fortynning på 1: 100 i PBS (inneholdende 2% BSA) og inkuber ved 4 ° C over natten. For å endre medium i 96-brønners plate ved å holde pipetten til veggen i brønnen, og fjerne væsken.
2. Den neste dag, vaskes prøvene tre ganger hver i 5 min med 200-300 pl PBS på shaker. Tilsett 100 ul av de tilsvarende sekundære antistoffer; her bruker geite-antimus fluoresceinisotiocyanat (FITC) og geite-anti kanin cyaninfargestoffer 3 (Cy3), og prøvene inkuberes ved værelsestemperatur i 1-2 timer. Fortynn de sekundære antistoffer 1: 300 i PBS inneholdende 2% geiteserum.
3. Skyll prøvene på nytt tre ganger hver i 5 min i 200-300 ul PBS på shaker.
4. Utfør kjernen flekker, f.eks
5. Overfør prøvene på objektglass, legge dem i 1-2 dråper fluorescerende montering medium, legge til et dekkglass, forsegle den ved å dekke kantene med gjennomsiktig lakk, og oppbevar ved 4 ° C for senere bruk eller direkte undersøke lysbildene med konfokal mikroskop.
6. Bruke et konfokalt mikroskop (eller tilsvarende) for å analysere prøvene. Bruk ønsket forstørrelse, f.eks 10-40X forstørrelse.
7. Hvis du vil kontrollere tykkelsen av prøvene, måle med konfokalmikroskopi hjelp Z-stabler. Mengden av mulige scleral seksjoner avhenger av plasseringen av senehinnen, som tykkelsen er forskjellig equatorially og baktil (sammenlign innledning).

Representative Results

I representative eksperimenter utført her, er det påviselige fordeler som stammer fra bruken av denne spesielle lamineringsteknikk. Det første eksperimentet illustrerer mangfoldig nettverk av episcleral blodkar plexus i tre representative bilder (figur 3). Fartøyene er positive for CD31.

Det andre eksperimentet viser immunceller, spesielt LYVE1 + celler av episclera og deres forhold til de CD31 positive blodkar. Her Z-Stack teknologien ble brukt på 10X forstørrelse til å skanne gjennom vevet og forstå tredimensjonale relasjoner blodårer og immunceller (figur 4).

Senehinnen, samt de vedlagte extraocular muskler, kan analyseres for tilstedeværelse av blodårer eller immunceller. Figur 5 viserLYVE1 positive celler og CD31 positive blodårer.

Figur 1:.. Skjematisk bilde av det menneskelige øyet Her er skjematisk tverrsnitt av det menneskelige øyet Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2:. Skjematisk Bilde av Lamineteknikk sklera er nøye holdt med colibri tang og laminert inn i fine lag ved hjelp av en skalpell. Gjenta dette trinnet fører til tynne vev lysbilder som kan brukes for konfokalmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av dette figur.

Fig. 3: Episcleral Blood Vessel Plexus, Immunopositive for CD31 A og B er utledet fra den fremre episclera, mens C er fra den bakre posisjon. Scale bar indikerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4:. CD31 + blodkar og LYVE1 + celler i en z-stack, Viser de anatomiske relasjoner mellom dem Små fartøy og større de kan overlappe. Scale bar indikerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Vedlagt i Sclera er extraocular Muskler De inneholder en lignende bot blodåre nettverk og noen LYVE1 + celler.. Scale bar indikerer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Laminering av det humane sclera er en fremgangsmåte for å utføre konfokal mikroskopi på dette vev. Et kritisk trinn i denne prosessen er anvendelse av ethanol i stedet for formalin for festing av vev. Vår erfaring er bedre resultater oppnås ved bruk av etanol i stedet for formalin for fiksering. Blunt skalp forverre prosedyren og bør unngås. Likeledes bør tørkingen opp av sclera unngås, fordi det kompliserer fremgangsmåten og reduserer kvaliteten av bildene.

Når det gjelder immunhistokjemisk farging, kan andre antistoffer enn de som er benyttet her anvendes. Generelt viser kollagen mer auto-fluorescens og bakgrunn i den grønne kanalen, derfor rød, blå, og langt-rød kanalene viser bedre resultater med mindre bakgrunn.

Imidlertid er det flere begrensninger i teknikken. Lamine sclera krever mye trening, så det er et mikrokirurgisk prosedyre utført under en mikroskopope. Fordi denne teknikken utføres manuelt, den enkle laminerte skivene er ikke nøyaktig den samme størrelse og har ulik tykkelse innenfor ett stykke vev. For å få vev av nøyaktig samme størrelse, kan trepanasjon være et alternativ, selv om tykkelsen av lagene vil fortsatt variere. For å oppnå en nøyaktig definert tykkelse for scleral seksjoner, kan en automatisert microkeratome være et alternativ for fremtidige eksperimenter. Ved laminering utføres med lag som er for tykk, kan dekslet lysbilde forrykke, og vevet potensielt kan tørke ut. De eksakte grensene mellom episclera og stroma kan være vanskelig å skille når lamineringene er utført.

Til tross for dette, å laminere sclera har flere fordeler i bruken av immunhistokjemi, særlig når sammenlignet med formalinfiksert parafin innleiret immunhistokjemi, som er standardmetoden i dagens kliniske situasjon. Lamine sclera tillater konfokal mikroskopiering som skal utføres, større størrelse områder av sclera som skal analyseres, forskjellige lag av senehinnen som skal undersøkes, samt screening og skanning av vev. I kontrast, når du arbeider med formalinfiksert parafin innebygd prøver, endrer sclera sin konsistens i en unhelpful måte under forvarming for antigen gjenfinning. Gjennom hele oppvarmingsprosessen, kollagen fibrene skrumpe og vevet mister kontakt med raset. Tidligere fartøyet plexus i episclera har bare vært synlig ved hjelp av angiografiske teknikker, eller i det hele Mount View, men ikke i tverrsnitt.

I tillegg til de tekniske problemer, er det forholdsvis sclera avaskulære og relativt dårlig i immunceller i forhold til andre vev i øyet, slik som netthinnen. Derfor, ved bruk av formalin-fikserte paraffin innleiret lysbilder, som vanligvis er 4 um tykke, flere lysbilder for å påvise positive celler i senehinnen. Nylig ble det vist ved hjelp av denne laminating teknikk at det menneskelige sklera er ikke acellulær, men inneholder rikelig med LYVE1 + makrofager til å samle seg rundt blodkar ^1.

For å oppsummere, utføre konfokalmikroskopi på laminert scleral seksjoner er et lovende verktøy for å undersøke patologiske forstyrrelser i fremtiden, slik som skleritt, uveitt, eller traumer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26 G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5 mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24 mm x 24 mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a