Abstract
De sclera is een dicht bindweefsel dat bedekt en beschermt het oog. Het bestaat hoofdzakelijk uit dichte bundels collageen (type I, III, IV, V, VI en VII). Door de autofluorescentie, ondoorzichtigheid en dikte, maar het is geschikt gebleken voor confocale microscopie. Een alternatieve benadering voor de hier gepresenteerde, die met formaline gefixeerd in paraffine ingebed sclera voor immunohistochemie gebruikt, heeft technische problemen, vooral wanneer het voorverwarmen weefsel voor antigen herstel. Omdat de sclera relatief arm aan beide cellen en vaten, werd het gebruik van grotere weefselmonsters onderzocht om te voorkomen uitzicht cellen en hun lokalisatie en vaartuigen en andere anatomische locaties begrijpen. Met het oog op de analyse van grotere weefselmonsters onder de confocale microscoop, werd een lamineertechniek uitgevoerd om dunne lagen van de sclera te maken. Naar aanleiding van de analyse van de resultaten van CD31 bloedvaten en lymfevaten endotheliale hyaluRonan receptor 1 (LYVE1) positieve cellen, waarvoor goedkeuring voor wetenschappelijk onderzoek werd verkregen, de voordelen en beperkingen van deze methode worden besproken.
Introduction
De sclera is de stijve buitenste laag dat het oog, die is gemaakt van dicht bindweefsel omvat. Het helpt om intraoculaire structuren beschermen en om intraoculaire druk te handhaven. Dus de sclera is essentieel voor helder zicht. Het mist lymfevaten 1,2 en vormt daardoor een buitenste lymfatische-vrije grens tussen deze en de lymfatische-binnenmantel eye 3-7. Het biedt ook bevestiging plaatsen voor oculaire spieren, waardoor de anatomische gelijkenissen delen met pezen. Omdat de sclera bestaat voornamelijk uit dichte bundels van type I collageen en heeft kleinere aantallen collageen type III, IV, V, VI, VIII en 8,9 elastine 10,11, dit weefsel is niet makkelijk te gebruiken voor immunohistochemie.
Anatomisch kan de sclera worden gescheiden in drie lagen: (1) de oppervlakkige gevasculariseerde episclera, vond onder het bindvlies en Tenon capsule en naar de zijkanten en ee achterkant van het oog met uitzicht op de baan; (2) de sclerale stroma, het grootste deel van de sclera; en (3) de lamina fusca, die een dunne, gepigmenteerde laag direct boven de uvea. Onze anatomische kennis over de sclera komt vooral voort uit de eerste helft van de 20e eeuw. Op dat moment, bestudeerden de anatomie van bloedvaten voornamelijk met Indische inkt injecties 12 en vasculaire gieten 13-15. Later, werd onderzocht in angiografische studies 16-19.
Sinds die tijd zijn de oudere technieken verbeterd en nieuwe ontwikkeld die hebben ons als aanvulling op eerdere anatomische kennis. Zo is het slechts tien jaar geleden dat we deze betrouwbare lymfatische markers als lymfatisch vasculair endothelium specifieke hyaluronan receptor-1 (LYVE1) 20 of podoplanin 21 hebben. Confocale microscopie biedt nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de anatomische kenmerken van de verschillende tissues van het oog. Deze meerdere vlekken worden gebruikt voor het differentiëren van markers van cellen of voor de lokalisatie van cellen in verband met bloedvaten en andere anatomische structuren. Het geeft een overzicht wanneer het monster is van een groter formaat en stelt ons in staat om te scannen door middel van een steekproef bij het op zoek naar een specifiek type cel. Met Z-Stack-technologie, kan confocale microscopie worden gebruikt voor monsters tot 100-200 urn. De sclera verschilt in dikte van 0,3 mm achter de spier inserties en 1 mm in de achterpool 11. Omwille van zijn dikte en ondoorzichtigheid, de sclera is niet geschikt voor confocale microscopie met traditionele methoden.
Om dit te verhelpen, werden sclerale weefsels gelamineerd mogelijk te maken voor hun analyse met confocale microscopie. Deze techniek is nuttig voor een beter begrip van zowel fysiologische en pathologische situaties de menselijke sclera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van menselijke weefsels moeten worden beoordeeld en goedgekeurd door een institutionele review board of het equivalent goedgekeurd. Het werk dat hier beschreven werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie en had de goedkeuring van wetenschappelijk onderzoek. Dit werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. De menselijke sclerale monsters werden verkregen uit de ogen van de wereld donoren (maximum post-mortem tijd 24 uur) bij de Eye Bank van de afdeling Oogheelkunde, Universiteit van Keulen, Duitsland.
1. Experimentele Voorbereiding
- Bereid 96% ethanol en fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in verschillende buizen. Bereid de primaire antilichamen in de aanbevolen verdunning van PBS met 2% runderserumalbumine (BSA) en alle oplossingen op ijs bewaren. Bereid 100 ul per monster.
- Reinig alle instrumenten en scherpe scalpels. Na herhaalde snijden met dezelfde scalpel, verander de scalpel.
- Verkrijgen 1-2 colibri tang, recht micro ontleden schaar, een # 10 scalpelof oogheelkundige scalpel micro veer, en vier 26 G naalden.
- Wikkel aluminiumfolie rond een polystyreen plaat of gebruik maken van een kurk bord om het weefsel te brengen. Werken onder een binoculaire stereo microscoop. Werken onder een steriele laminaire luchtstroom indien nodig.
2. Bereid de Sclera
- Voorzichtig de lamp te houden en het uitvoeren van een perforeren trepanatie op de corneoscleral deel en draai de trepan. Draai de trepan voorzichtig en gelijkmatig op het oppervlak een even ronde geslepen uit te voeren. Gebruik een 15,5 mm formaat trepan. Snijd de resterende bijlagen met gebogen schaar. Verwijder de corneoscleral trepanation. Dit resulteert in een naar voren geopende lamp.
- Zet de sclera op een wattenstaafje met het open gedeelte naar boven. Verwijder de retina en uvea, gebruik Colibri tang beide lagen (retina en uvea) vanaf de sclera trekken. Heeft de gepigmenteerde uvea niet achter op de innerlijke sclera. Gebruik de gebogen schaar om de retina en uvea uit de papil te verwijderen. Verwijder de remaining bindvlies, oculaire spieren en Tenon capsule uit de oppervlakkige sclera.
- Verwijder de sclerale monster in de gewenste grootte door het gebruik van rechte-type schaar en de colibri tang. Neem ongeveer 2 cm 2 sized sclerale monsters van verschillende locaties. Vanwege de geringe omvang, houdt u de sclera voorzichtig en knip de gewenste grootte als vierkanten met behulp van de straight-type schaar. De corneoscleral trepanatie definieert de voorste rand van de sclerale monsters.
- Voorkom het grijpen met de tang het gebied waar het weefsel werd gegrepen is niet geschikt voor confocale microscopie analyse. Bereid het vereiste aantal monsters afhankelijk van het experiment (bijv ventraal vs. posterieur vergelijk figuur 1) en de hoeveelheid gebruikte antilichamen.
- Plaats de monsters in 1,5 ml buizen voor later gebruik. Bevestig de monsters in 1,5 ml 96% ethanol gedurende 15 min, en vervolgens wassen drie keer telkens 5 minin 1,5 ml PBS op de shaker. Als het werken met bevroren weefsel, voert u deze stap voor snap het vriespunt.
- Gebruik verse weefsel. Echter, als dit niet mogelijk is, snap bevriezen van de sclera in vloeibare stikstof en bewaar deze bij -20 ° C voor later gebruik. Als het werken met bevroren weefsel, ontdooien voor gebruik. Vermijd herhaaldelijk ontdooien en bevriezen cycli.
- Houd elk monster in PBS met 1,5 ml 5% BSA bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Deze stap leidt tot een zwelling van het monster dat is nuttig voor het lamineren en voorkomt ook niet-specifieke binding.
- Nadat de monsters zijn gezwollen, de voorbereiding van de sclerale pleinen voor het lamineren. Werken onder een microscoop, bijvoorbeeld een binoculaire stereomicroscoop. Bevestig het achterste sclerale monsters naar het polystyreen membraan gewikkeld in aluminiumfolie of kurkplaat met de 26 G naalden.
- Buig de randen van de naalden zodat ze niet interfereren met het gezichtsveld onder de microscoop.
- Laminaat de volledige dikte sclerale samples.
- Ten eerste, houd de voorste sclerale rand met behulp van colibri tang. Snijd voorzichtig een dunne laag van de oppervlakkige sclera met de # 10 scalpel, de oftalmische scalpel micro veer of een spatel. Houd de scalpel horizontaal en snijd de oppervlakkige laag zo dun mogelijk uit de onderliggende laag.
- Ontleden een dunne sclerale laag van de sclerale plein. Deze methode is vergelijkbaar met standaard chirurgische technieken om een flap te bereiden tijdens trabeculectomie en moet leiden tot 30-80 urn dikke lagen (vergelijk figuur 2).
- Voorkom drogen van de sclera door toevoeging van kleine hoeveelheden van PBS aan het weefsel, zoals 50 ul PBS met een pipet.
- Doe de cut lagen in 100 ul van PBS in de plaat met 96 putjes en label zowel de oriëntatie (richting extern en intern) en de laag (oppervlakkig en diep), bijvoorbeeld met een waterdichte kleur.
- Herhaal stap 2,7-2,9 totdat het weefsel volledig is gelamineerd. </ Li>
3. Voer Immunohistochemie
- Voeg 100 ul van de vereiste primaire antilichamen in de aanbevolen verdunning. Hier, bijvoorbeeld bij gebruik CD 31 (monoklonaal muis-anti humaan) en LYVE1 antilichaam (konijnen tegen humaan), zowel in een verdunning van 1: 100 in PBS (bevattende 2% BSA) en incuberen bij 4 ° C overnacht. Aan het medium in de putjes 96 te wijzigen, houdt de pipet aan de wand van de put en verwijder de vloeistof.
- De volgende dag, drie keer per wast de monsters 5 min bij 200-300 ul PBS op de shaker. Voeg 100 ul van de corresponderende secondaire antilichamen; Hier gebruiken geit antimuis fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) en geit anti konijn cyaninekleurstoffen 3 (Cy3) en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. Verdun de secundaire antilichamen 1: 300 in PBS met 2% geitenserum.
- Spoel de monsters opnieuw drie keer telkens 5 min in 200-300 ui PBS op de shaker.
- Voer kern kleuring, bv
- Breng de monsters op objectglaasjes, insluiten in 1-2 druppels fluorescerende fixeermiddel, voeg een dekglaasje, verzegelen door het bedekken van de randen met transparante lak, en bewaar bij 4 ° C voor later gebruik of dia's met de confocale rechtstreeks onderzocht microscoop.
- Gebruik een confocale microscoop (of equivalent) om de monsters te analyseren. Gebruik de gewenste vergroting, bijvoorbeeld 10-40X vergroting.
- De dikte van de monsters controleren meten confocale microscopie gebruikt Z-Stacks. De hoeveelheid mogelijke sclerale secties afhankelijk van de locatie van de sclera, de dikte equatoriaal en posterieur (vergelijk inleiding) verschilt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de representatieve experimenten uitgevoerd hier, voor aantoonbare voordelen die voortvloeien uit het gebruik van deze bijzondere lamineertechniek. Het eerste experiment illustreert de diverse netwerk van de episclerale bloedvaten plexus in drie representatieve beelden (figuur 3). De schepen zijn positief voor CD31.
Het tweede experiment toont immuuncellen, met name LYVE1 + cellen van de episclera en hun relatie met de CD31 positieve bloedvaten. Hier werd Z-Stack technologie bij 10x vergroting scannen door het weefsel te begrijpen driedimensionale relaties van bloedvaten en immuuncellen (figuur 4).
De sclera, en de bijgevoegde oculaire spieren, kunnen worden geanalyseerd op de aanwezigheid van bloedvaten of immuuncellen. Figuur 5 toontLYVE1 positieve cellen en CD31 positieve bloedvaten.
Figuur 1:.. Schematische Afbeelding van het menselijk oog Hier is een schema van de doorsnede van het menselijk oog Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Schematische Beeld van het lamineren Technique De sclera wordt zorgvuldig gevoerd met colibri pincet en gelamineerd in fijne lagen met behulp van een scalpel. Het herhalen van deze stap leidt tot dunne weefsel dia's die kunnen worden gebruikt voor de confocale microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze fi bekijkenguur.
Figuur 3:. Episclerale Bloedvat plexus, immunopositive voor CD31 A en B zijn afgeleid uit de voorste episclera, terwijl C is vanaf het achterste locatie. Schaal balk geeft 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. CD31 + bloedvaten en LYVE1 + cellen in een z-stack, tonen van de Anatomische betrekkingen tussen hen Kleine schepen en grotere kunnen elkaar overlappen. Schaal balk geeft 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Ingesloten in de Sclera zijn de oculaire spieren Ze bevatten een soortgelijke boete bloedvat netwerk en een aantal LYVE1 + cellen.. Schaal balk geeft 200 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lamineren van de humane sclera is een werkwijze voor het uitvoeren confocale microscopie op dit weefsel. Een kritische stap in dit proces is het gebruik van ethanol in plaats van formaline voor het aanbrengen van het weefsel. In onze ervaring, worden betere resultaten verkregen bij het gebruik van ethanol in plaats van formaline voor fixatie. Blunt scalpels verergeren de procedure en moet worden vermeden. Ook moet het opdrogen van de sclera worden vermeden, aangezien compliceert de procedure en vermindert de kwaliteit van de afbeeldingen.
Wat de immunohistochemische kleuring, kunnen andere antilichamen dan hier toegepast die worden gebruikt. In het algemeen collageen toont meer auto-fluorescentie en achtergrond in het groene kanaal, dus rood, blauw, en ver-rode kanalen vertonen betere resultaten met minder achtergrond.
Er zijn echter verscheidene beperkingen van de techniek. Het lamineren van de sclera vergt veel oefening, omdat het een microchirurgische procedure uitgevoerd onder een Microscope. Omdat deze techniek handmatig wordt uitgevoerd, de ene gelamineerde schijfjes niet exact even groot en verschillen in de dikte binnen een stukje weefsel. Weefsels van dezelfde grootte, kan trepanation alternatief, hoewel de dikte van de lagen nog steeds variëren. Om een exact gedefinieerde dikte van de sclerale secties bereiken, kan een geautomatiseerd microkeratoom een alternatief voor toekomstige experimenten. Als lamineren wordt uitgevoerd met lagen die te dik zijn, kan de cover slide ontwrichten, en het weefsel kan mogelijk uitdrogen. De exacte grenzen tussen episclera en stroma misschien moeilijk te onderscheiden wanneer de lamellen worden uitgevoerd.
Desondanks lamineren van de sclera heeft een aantal voordelen in het gebruik van immunohistochemie, zeker in vergelijking met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde immunohistochemie, de standaardmethode van de huidige klinische situatie. Lamineren van de sclera maakt confocale Microscopy te voeren, grotere formaat gebieden sclera te analyseren, verschillende lagen van de sclera te onderzoeken, en het screenen en scannen weefsel. Wanneer daarentegen werken met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde monsters, de sclera verandert consistente wijze een nutteloze tijdens voorverwarmen antigen herstel. Gedurende het opwarmen, de collageenvezels verschrompelen en het weefsel verliest het contact met de glijbaan. Eerder hebben het schip plexus in de episclera alleen toegankelijk is met behulp van angiografische technieken of in de ganse berg uitzicht, maar niet in doorsneden.
Naast de technische problemen, de sclera is relatief avasculaire en relatief arm aan immuuncellen in vergelijking met andere weefsels in het oog, zoals de retina. Derhalve bij gebruik met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde glijbanen, die gewoonlijk 4 urn dik, meerdere objectglaasjes nodig om positieve cellen te detecteren in de sclera. Kort werd aangegeven met dit laminaating techniek die het menselijk sclera is niet acellulair, maar bevat tal van LYVE1 + macrofagen ophopen rond de bloedvaten 1.
Samenvattend uitvoeren confocale microscopie op sclerale gelamineerde profielen is een veelbelovend hulpmiddel pathologische aandoeningen in de toekomst, zoals scleritis, uveitis of trauma onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26 G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5 mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24 mm x 24 mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a |
References
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
- Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
- Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
- Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
- Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
- Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
- Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
- Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
- Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. The sclera. , Springer. (2012).
- Kiss, F.
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
- Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
- Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
- Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
- Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
- Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
