Abstract
A esclerótica é um tecido conjuntivo denso que cobre e protege o olho. Ela consiste principalmente de feixes de colágeno densas (tipos I, III, IV, V, VI e VII). Devido à sua autofluorescência, opacidade, e espessura, não foi considerado adequado para a microscopia confocal. Uma abordagem alternativa para o apresentado aqui, que utiliza esclera fixado com formalina embebido em parafina para imuno-histoquímica, tem desafios técnicos, especialmente quando o pré-aquecimento do tecido para a recuperação de antigénio. Desde a esclera é relativamente pobre em ambas as células e vasos, o uso de amostras de tecido maiores foi explorada para ajudar a evitar que as células com vista e para compreender a sua localização em relação aos navios e outros sítios anatômicos. Para permitir a análise de amostras de tecido maiores, sob o microscópio confocal, uma técnica de laminação foi efectuada para criar camadas finas da esclera. Após a análise dos resultados dos vasos sanguíneos CD31 e vasos linfáticos endotelial hyalureceptor Ronan 1 (LYVE1) células positivas, para o qual foi obtido uma autorização para exame científico, as vantagens e limitações deste método são discutidas.
Introduction
A esclerótica é a camada externa rígida que cobre o olho, o que é feito de tecido conjuntivo denso. Isso ajuda a proteger as estruturas intra-oculares e para manter a pressão intra-ocular. Assim, a esclerótica é essencial para a visão clara. É desprovida de vasos linfáticos 1,2 e, assim, forma uma borda livre-linfática exterior entre ele e o olho interior livre de linfático 3-7. Ele também fornece locais de ligação para os músculos extra-oculares, partilhando assim semelhanças anatômicas com tendões. Porque a esclera consiste principalmente de feixes densos de colágeno tipo I e tem um número menor de colágeno tipo III, IV, V, VI, VIII 8,9 e elastina 10,11, este tecido não é fácil de usar para imuno-histoquímica.
Anatomicamente, a esclerótica podem ser separadas em três camadas principais: (1) o episclera vascularizado superficial, localizado por debaixo da conjuntiva e da cápsula de Tenon e para os lados e the parte de trás do olho de frente para a órbita; (2) o estroma escleral, a parte principal da esclera; e (3) o fusca lâmina, que é uma camada fina, pigmentada localizada directamente acima da úvea. Nosso conhecimento anatômico sobre a esclera decorre, principalmente, da primeira metade do século 20. Naquela época, os investigadores estudaram a anatomia da vasculatura principalmente usando Índia injeções de tinta 12 e vascular lançando 13-15. Mais tarde, foi pesquisado em estudos angiográficos 16-19.
Desde então, técnicas mais antigas foram melhoradas e novos foram desenvolvidos que nos permitiram completar conhecimento anatômico anterior. Por exemplo, tem sido apenas cerca de uma década desde que nós tivemos tais marcadores linfáticos confiáveis como endotélio vascular linfática hyaluronan específica receptor-1 (LYVE1) 20 ou podoplanina 21. A microscopia confocal oferece novas possibilidades para o estudo das características anatômicas dos diferentes tissues do olho. Ele permite várias manchas a ser utilizada para diferenciar os marcadores de células ou para a localização das células em relação aos vasos sanguíneos e outras estruturas anatómicas. Ele fornece uma visão geral, quando a amostra é de um tamanho maior e permite-nos verificar através de uma amostra, quando em busca de um tipo de célula específico. Com a tecnologia Z-Pilha, microscopia confocal pode ser utilizado para as amostras até 100-200 um. A esclerótica difere de espessura entre 0,3 mm por trás das inserções musculares e 1 mm no pólo posterior 11. Devido tanto a sua espessura e opacidade, a esclera não é adequado para microscopia confocal utilizando métodos tradicionais.
Para remediar esta situação, tecidos esclerais foram estratificados para permitir a sua análise com microscopia confocal. Esta tecnologia é útil para obter uma melhor compreensão de ambas as situações fisiológicas e patológicas na esclera humana.
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Protocol
O uso de tecidos humanos devem ser revistos e aprovados por um conselho de revisão institucional ou equivalente. O trabalho aqui descrito foi aprovado pelo comitê de ética local e teve a aprovação para análise científica. Este trabalho foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinki. Os espécimes esclerais humanos foram obtidos a partir dos olhos de doadores globo (máximo de post-mortem de tempo de 24 horas), no Banco de Olhos do Departamento de Oftalmologia da Universidade de Colônia, Alemanha.
1. Preparação Experimental
- Preparar 96% de etanol e salino tamponado com fosfato (PBS) em diferentes tubos. Prepare os anticorpos primários na diluição recomendada de PBS contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) e manter todas as soluções em gelo. Preparação de 100 ul por amostra.
- Limpe todos os instrumentos e usar bisturis afiados. Depois de repetido o mesmo corte com bisturi, alterar o bisturi.
- Obter 1-2 forceps Colibri, micro tesouras de dissecação em linha reta, um bisturi # 10ou bisturi oftálmico micro pena, e quatro 26 agulhas G.
- Enrole a folha de alumínio em torno de uma placa de poliestireno ou usar uma placa de cortiça para fixar o tecido. Trabalhar debaixo de um microscópio estéreo binocular. Trabalhar estéril debaixo de um fluxo de ar laminar, se necessário.
2. Prepare a esclera
- Pressione cuidadosamente a lâmpada e executar uma trepanação perfurante por parte córneo, e gire o trepan. Gire o trepan cuidadosamente e uniformemente sobre a superfície para realizar um corte igualmente rodada. Use um trepan tamanho 15,5 mm. Cortar os acessórios restantes com tesoura curva. Remova a trepanação córneo. Isto irá resultar em uma lâmpada anteriormente aberto.
- Coloque a esclera em um cotonete com a parte aberta para cima. Remova a retina e úvea, usando uma pinça colibri de retirar as duas camadas (retina e Uvea) da esclera. Não deixe a úvea pigmentada na esclera interior. Use tesoura curva para remover a retina e da úvea papila. Remover o REMaining conjuntiva, músculos extra-oculares, e da cápsula de Tenon da esclera superficial.
- Retirar a amostra escleral no tamanho necessário utilizando-tipo reto tesouras e fórceps Colibri. Tome cerca de 2 cm2 amostras esclerais porte de diferentes locais. Por causa do tamanho pequeno, segurar a esclera suavemente e cortar o tamanho exigido, quadrados usando os do tipo reta tesoura. A trepanação córneo define a margem anterior das amostras esclerais.
- Evitar repetido agarrando com a pinça como a área onde o tecido foi agarrado não é adequado para análise de microscopia confocal. Prepara-se o número necessário de amostras, dependendo do tipo de experiência (por exemplo, vs anteriormente posteriormente, comparar Figura 1) e a quantidade de anticorpos utilizada.
- Coloque as amostras em tubos de 1,5 ml para uso posterior. Fixar as amostras em 1,5 ml de etanol a 96% durante 15 minutos, e, em seguida, lavá-los três vezes cada durante 5 minem 1,5 ml de PBS no agitador. Se trabalhar com tecido congelado, execute essa etapa antes pressão congelamento.
- Use tecido fresco. No entanto, se isso não for possível, pressão congelar a esclera em azoto líquido e mantê-lo a -20 ° C para uso posterior. Se trabalhar com tecido congelado, descongelar antes de usar. Evite o descongelamento repetido e ciclos de congelamento.
- Manter cada amostra em PBS contendo 1,5 ml de BSA a 5% à temperatura ambiente durante 2 h. Este passo induz um aumento de volume da amostra, que é útil para a laminação e também previne a ligação inespecífica.
- Depois que as amostras têm aumentado, preparar as praças esclerais para laminação. Trabalhar sob um microscópio, por exemplo, um microscópio estéreo binocular. Apor as amostras esclerais posteriores à membrana de poliestireno embrulhados em papel alumínio ou a placa de cortiça utilizando os 26 g de agulhas.
- Dobrar as extremidades das agulhas, de forma que não interfiram com o campo visual sob o microscópio.
- Laminar o SAMP escleral de espessura totalles.
- Primeiro, mantenha a borda escleral anterior usando uma pinça Colibri. Em seguida, cuidadosamente cortar uma fina camada superficial da esclera usando o bisturi # 10, o bisturi oftálmica micro pena, ou uma lâmina de uma espátula. Segurar o bisturi horizontalmente e cortar a camada superficial tão fina quanto possível, a partir da camada subjacente.
- Dissecar uma camada fina escleral da praça escleral. Este método é semelhante às técnicas cirúrgicas convencionais para preparar uma aba durante trabeculectomia e deve resultar em camadas de espessura de 30-80 ^ m (comparar com a figura 2).
- Evitar a secagem da esclera pela adição de pequenas quantidades de PBS para o tecido, por exemplo, 50 ul de PBS utilizando uma pipeta.
- Coloque as camadas cortadas em 100 ul de PBS na placa de 96 poços e rotular tanto a orientação (no sentido externo e interno) e a camada (superficial e profunda), por exemplo com uma cor à prova de água.
- Repita os passos 2,7-2,9 até que o tecido está completamente laminado. </ Li>
3. Execute Imunohistoquímica
- Adicionar 100 ul de anticorpos primários necessários para a diluição recomendada. Aqui, por exemplo, utilização de CD 31 LYVE1 anticorpo (anti-humano de coelho) (monoclonal de ratinho anti-humano) e, tanto em uma diluição de 1: 100 em PBS (contendo 2% de BSA) e incubar a 4 ° C durante a noite. Para alterar a forma da placa de 96 poços, segurar a pipeta para a parede do poço e remover o fluido.
- No dia seguinte, as amostras de lavar três vezes cada durante 5 min com 200-300 ul de PBS no agitador. Adicionar 100 uL de anticorpos secundários correspondentes; aqui usar de cabra anti-rato fluoresceína isotiocianato (FITC) anti-coelho de cabra e corantes de cianina 3 (Cy3), e incuba-se as amostras à temperatura ambiente durante 1-2 horas. Dilui-se a anticorpos secundários 1: 300 em PBS contendo soro de cabra a 2%.
- Lavar as amostras novamente três vezes cada durante 5 minutos em 200-300 ul de PBS no agitador.
- Realização da coloração núcleo, por exemplo,
- Transferir as amostras em lâminas de microscópio, incorporá-los em 1-2 gotas de meio de montagem fluorescente, adicionar uma lamela, selá-lo, cobrindo as bordas com verniz transparente, e armazenar a 4 ° C para uso posterior ou examinar diretamente os slides com a confocal microscópio.
- Usar um microscópio confocal (ou equivalente) para analisar as amostras. Use a ampliação desejada, por exemplo 10-40X ampliação.
- Para verificar a espessura das amostras, medida com microscopia confocal usando Z-pilhas. A quantidade de possíveis secções esclerais depende da localização da esclerótica, tal como a espessura difere equatorial e posterior (comparar introdução).
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Representative Results
Nas experiências representativas realizadas aqui, há benefícios demonstráveis derivados da utilização desta técnica de laminação em particular. A primeira experiência ilustra a rede diversificada de plexo de vasos sanguíneos episcleral em três imagens representativas (Figura 3). Os vasos são positivas para CD31.
O segundo experimento mostra células do sistema imunológico, em particular de células LYVE1 + do episclera e sua relação com os vasos sanguíneos positiva CD31. Aqui tecnologia Z-Pilha foi utilizado a 10X de ampliação para digitalizar através do tecido e compreender as relações tridimensionais dos vasos sanguíneos e células do sistema imunológico (Figura 4).
A esclerótica, bem como os músculos extra-oculares anexas, pode ser analisada para a presença de vasos sanguíneos ou células do sistema imunológico. A Figura 5 mostracélulas positivas LYVE1 e vasos sanguíneos positiva CD31.
Figura 1:.. Imagem esquemático do olho humano Aqui está um esquema da secção transversal do olho humano Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Figura esquemática da técnica de laminação da esclera é realizada cuidadosamente com uma pinça Colibri e laminado em camadas finas utilizando um bisturi. Repetindo este passo leva a lâminas de tecidos finos que podem ser usados para microscopia confocal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Episclerais Veículo sangue do plexo, imunopositivas para CD31 A e B são derivados de episclera anterior, ao passo que C é a partir da localização posterior. Barra de escala indica 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Vasos CD31 + de sangue e LYVE1 + células em um z-stack, mostrando as relações anatômicas entre-lhes pequenas embarcações e os maiores podem se sobrepor. Barra de escala indica 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: fechado na esclera estão os músculos extra Eles contêm uma rede de vasos sanguíneos bem semelhante e alguns LYVE1 + células.. Barra de escala indica 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Laminar a esclerótica humana é um método para a realização de microscopia confocal sobre este tecido. Um passo essencial neste processo é a utilização de etanol em vez de formalina para a aposição do tecido. Em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos quando se utiliza etanol em vez de formol para fixação. bisturis Blunt agravar o processo e devem ser evitadas. Da mesma forma, a secagem da esclera deve ser evitado, uma vez que complica o processo e reduz a qualidade das imagens.
No que respeita à coloração imunohistoquímica, podem ser utilizados outros anticorpos do que as aplicadas aqui. Em geral, o colágeno mostra mais auto-fluorescência de fundo e no canal verde, portanto, vermelho, azul, e os canais de vermelho-extremo apresentam melhores resultados com menos de fundo.
No entanto, existem várias limitações da técnica. Laminar a esclera requer muita prática, uma vez que é um procedimento de microcirurgia realizada sob um microscope. Uma vez que esta técnica é realizada manualmente, as fatias individuais laminados não são exactamente o mesmo tamanho e diferem na sua espessura de dentro de uma peça de tecido. Para que os tecidos de exactamente o mesmo tamanho, trepanação pode ser uma alternativa, embora a espessura das camadas ainda irá variar. Para atingir uma espessura exactamente definido para as secções esclerais, um microquerotomia automatizado pode ser uma alternativa para experiências futuras. Se a laminação é realizada com camadas que são demasiado espessa, a corrediça de cobertura pode deslocar, e o tecido pode potencialmente secar. As fronteiras exatas entre episclera e estroma pode ser difícil de diferenciar uma vez que as lâminas são executadas.
Apesar disso, laminar a esclera tem várias vantagens na utilização de imuno-histoquímica, particularmente quando comparado com imuno-histoquímica embebido em parafina fixado em formalina, que é o método padrão da situação clínica corrente. Laminar a esclerótica permite Microsc confocalopy a ser executada, áreas de maiores dimensões da esclerótica para ser analisado, diferentes camadas da esclera a ser analisado, bem como o rastreio e a digitalização de tecido. Em contraste, quando se trabalha com amostras embebidas em parafina fixadas com formalina, a esclera muda a sua consistência de modo inúteis durante o pré-aquecimento para a recuperação de antigénio. Durante todo o processo de aquecimento, as fibras de colágeno murchar e o tecido perde contato com o slide. Anteriormente, o plexo navio no episclera ter sido visível apenas através de técnicas de angiografia ou em toda a visão de montagem, mas não em seções transversais.
Para além das dificuldades técnicas, a esclerótica é relativamente avascular e relativamente pobre em células imunes em relação a outros tecidos no olho, tais como a retina. Portanto, quando se utiliza lâminas embebidas em parafina fixadas com formalina, que são geralmente de 4 mm de espessura, são necessárias múltiplas lâminas para detectar células positivas na esclera. Recentemente, foi demonstrado usando este Laminatção técnica que a esclera humana não é acelular, mas contém uma abundância de macrófagos LYVE1 + a acumular-se em torno de vasos sanguíneos 1.
Para resumir, a realização de microscopia confocal de seções esclerais laminado é uma ferramenta promissora para investigar distúrbios patológicos no futuro, tais como esclerite, uveíte, ou trauma.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26 G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5 mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24 mm x 24 mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a |
References
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