O tecido da esclera humana é principalmente colágeno; portanto, não é facilmente utilizável para imuno-histoquímica. Para atingir o objetivo de realizar imuno-histoquímica para microscopia confocal de tecido escleral, foi utilizada a técnica de laminação.
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Artigo de método
Usando uma técnica de estratificação para executar microscopia confocal da esclera humana
Neste artigo
Resumo
Resumo
A esclerótica é um tecido conjuntivo denso que cobre e protege o olho. Ela consiste principalmente de feixes de colágeno densas (tipos I, III, IV, V, VI e VII). Devido à sua autofluorescência, opacidade, e espessura, não foi considerado adequado para a microscopia confocal. Uma abordagem alternativa para o apresentado aqui, que utiliza esclera fixado com formalina embebido em parafina para imuno-histoquímica, tem desafios técnicos, especialmente quando o pré-aquecimento do tecido para a recuperação de antigénio. Desde a esclera é relativamente pobre em ambas as células e vasos, o uso de amostras de tecido maiores foi explorada para ajudar a evitar que as células com vista e para compreender a sua localização em relação aos navios e outros sítios anatômicos. Para permitir a análise de amostras de tecido maiores, sob o microscópio confocal, uma técnica de laminação foi efectuada para criar camadas finas da esclera. Após a análise dos resultados dos vasos sanguíneos CD31 e vasos linfáticos endotelial hyalureceptor Ronan 1 (LYVE1) células positivas, para o qual foi obtido uma autorização para exame científico, as vantagens e limitações deste método são discutidas.
Introdução
A esclerótica é a camada externa rígida que cobre o olho, o que é feito de tecido conjuntivo denso. Isso ajuda a proteger as estruturas intra-oculares e para manter a pressão intra-ocular. Assim, a esclerótica é essencial para a visão clara. É desprovida de vasos linfáticos 1,2 e, assim, forma uma borda livre-linfática exterior entre ele e o olho interior livre de linfático 3-7. Ele também fornece locais de ligação para os músculos extra-oculares, partilhando assim semelhanças anatômicas com tendões. Porque a esclera consiste principalmente de feixes densos de colágeno tipo I e tem um número menor de colágeno tipo III, IV, V, VI, ....
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Protocolo
O uso de tecidos humanos devem ser revistos e aprovados por um conselho de revisão institucional ou equivalente. O trabalho aqui descrito foi aprovado pelo comitê de ética local e teve a aprovação para análise científica. Este trabalho foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinki. Os espécimes esclerais humanos foram obtidos a partir dos olhos de doadores globo (máximo de post-mortem de tempo de 24 horas), no Banco de Olhos do Departamento de Oftalmologia da Universidade de Colônia, Alemanha.
1. Preparação Experimental
- Preparar 96% de etanol e salino tamponado com fosfato (PBS) em diferentes tubos. Prepare os anticorpos primários na diluiçã....
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Resultados
Nas experiências representativas realizadas aqui, há benefícios demonstráveis derivados da utilização desta técnica de laminação em particular. A primeira experiência ilustra a rede diversificada de plexo de vasos sanguíneos episcleral em três imagens representativas (Figura 3). Os vasos são positivas para CD31.
O segundo experimento mostra células do sistema imunológico, em particular de células LYVE1 + do .......
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Discussão
Laminar a esclerótica humana é um método para a realização de microscopia confocal sobre este tecido. Um passo essencial neste processo é a utilização de etanol em vez de formalina para a aposição do tecido. Em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos quando se utiliza etanol em vez de formol para fixação. bisturis Blunt agravar o processo e devem ser evitadas. Da mesma forma, a secagem da esclera deve ser evitado, uma vez que complica o processo e reduz a qualidade das imagens.
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Divulgações
Os autores declaram não haver divulgações financeiras. O conteúdo deste artigo é de responsabilidade exclusiva dos autores.
Agradecimentos
German Research Foundation (FOR2240 "Angiogênese (linfática) e imunidade celular em doenças inflamatórias do olho" para CC e LMH; HE 6743/2-1 e HE 7643/3-1 para LMH; CU47/6-1 para CC), German Cancer Aid (para LMH e CC), programa GEROK da Universidade de Colônia (para SLS e LMH) e EU COST BM1302 "Unindo Forças para a Regeneração da Córnea" (para CC).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 96% etanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Alemanha | P075.4 | |
| microscópio estéreo binocular | Motic, Hong Kong, China | n.a | |
| 26 G agulhas | Terumo, Leuven, Bélgica | 303800 | |
| 15.5 mm trepan | Geuder, Heidelberg, Alemanha | n.a no.10 | |
| bisturi; | Pena, pfm medical, Osaka, Japão | 2E+08 | |
| bisturi oftálmico micro pena | Feather, pfm medical, Osaka, Japão | no. 7657BR | |
| CD 31 anticorpo (camundongo monoclonal anti humano) | Dako, EUA | IR610 | |
| LYVE1 anticorpo (coelho policlonal anti humano) | Zytomed, Alemanha | RBK014-05 | |
| anticorpo FITC de cabra anti-rato | Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha | F0257 | |
| anticorpo Cy3 de cabra anti-coelho | Dianova, Alemanha | 111-165-003 | |
| Soro de cabra normal | Dako, Glostrup, Dinamarca | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha | 6335.1 | |
| microscópio slides | Engelbrecht, Edermü nde, Alemanha | WC7695002 | |
| Lamínulas 24 mm x 24 mm | Th. Gayer, Lohmar, Alemanha | 7695026 | |
| Meio de montagem fluorescente DAKO | DAKO, EUA | S3023 | |
| LSM Meta 510 microscopia confocal | Carl Zeiss AG, Jena, Alemanha | n.a |
Referências
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al.
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Reimpressões e permissões
