Introduction
Pathogene Keime können 1 Biofilmen in vivo führt zu nicht akuten chronischen Infektionen bilden. Biofilm-assoziierte Infektion ist eine ernste Risikofaktor für medizinische Verfahren , die Implantation von Fremdkörpern (zB künstliche Knochenersatz, Brustimplantate) oder die Installation von Trachealtuben oder Urinkatheter 2 beinhalten. In diesen Zusammenhängen ist eine antiinfektive Therapie fast immer notwendig , als Biofilm-basierte Infektionen auf ihren eigenen selten gelöscht werden, selbst in immunkompetenten Individuen. Staphylococcus aureus eine der am häufigsten beobachteten Krankheitserreger in Biofilm-Komplikationen beteiligt ist , während der Verwendung auftreten , von invasive medizinische Geräte 3.
Sie mehr resistent gegen die Behandlung als planktonischen Zellen 1,4, und die Bewertung der vorhergesagten klinische Wirksamkeit Leider macht das Wesen von Biofilmen als Schutzbarriere ist ein wichtiger Bestandteil der beiden AnfangsArzneimittelentwicklung sowie Arzneimittelresistenzüberwachung. Es gibt immer mehr Anerkennung , dass Laborbedingungen auf planktonischen Kulturen konzentriert, kann nicht treu reale Krankheit 5 darstellen. Weiterhin das Problem Compoundierung, ist die Replikation von Biofilm - Phänotypen schwierig, und vorhandene Biofilm - Modelle sind langwierig und leiden unter hohen inter- und intra Assay Variabilität 6. viele Forscher, durch die Notwendigkeit, Standard zu planktonischen Zellassays von Medikamentenempfindlichkeit, wodurch möglicherweise ein wichtiger Aspekt der bakteriellen Virulenz zu vernachlässigen und Krankheit So.
Hier beschreiben wir das Protokoll für Bakterien Testen, insbesondere S. aureus, in pre-grown Biofilmen eine 96-Well - basierten Biofilm System 7,8 verwendet. Während das Protokoll für die Biofilmbildung und die Herausforderung im Wesentlichen die Empfehlungen des Herstellers folgt präsentieren wir eine alternative informationsreiche Methode, um die Lebensfähigkeit des bioF zur Quantifizierungilm nach Herausforderung. Kurz gesagt, sind Bakterien in der Stange Platte kultiviert, wo Biofilmen an der Platte des Deckels angebracht an den vorstehenden Zapfen bilden. Nach der Biofilmbildung sind die Zapfen in die Vertiefungen einer frischen Platte mit PBS gefüllt zu entfernen planktonischen Zellen vorsichtig getaucht. Der PEG-Deckel mit Biofilmen angebracht ist, wird auf eine neue Herausforderung Platte übertragen, verschiedene Konzentrationen der Antibiotika enthält, untersucht werden. Nach einer zweiten Inkubation werden Deckel wieder entfernt, gewaschen und in ein Rückgewinnungsplatte Resazurin Farbstoff enthält, überführt, wo sie einer abschließenden Inkubation unterzogen werden. Resazurin Umwandlung kann nach einer definierten Erholungszeit als Endpunkt Lesen kinetisch oder verbucht. Dieser Farbstoff-basierte Methode , um die Lebensfähigkeit von Biofilmen zu quantifizieren , unterscheidet sich erheblich von den langweiligen KBE (Kolonie bildende Einheiten) zählen basierte Methodik im ursprünglichen Protokoll 7 beschrieben. OD 600 Messungen der Droge Herausforderung Platte und Resazurin Umwandlungskinetik dienen als Lebensfähigkeit Leseouts von planktonischen und Biofilm-Zellen, die jeweils eine schnelle, zuverlässige, informationsreiche und technisch einfachen Test zur Biofilm Überleben anbietet.
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Protocol
1. Biofilm Initiation
- Wachsen einer Kultur des Biofilms produzierenden Organismus in einem nährstoffreichen Medium. Impfen Staphylococcus aureus - Stamm Newman in 10 ml Mueller-Hinton - Medium aus einem Glycerin Lager. Führen Sie alle Arbeiten , die mit der Handhabung von S. aureus mit Handschuhen und in einem Biosicherheitsschrank.
- bei 37 ° C für 16 Stunden inkubieren auf einem Rotationsschüttler (100-200 rpm).
- Bestimmen Sie OD 600 der Kultur eines Spektrometers und eine Standardküvette mit (Weglänge: 1cm).
- Berechne das Volumen (V) der Kultur benötigt 20 herzustellen ml des Inokulums mit OD 600 (Inokulum) von 0,1 in chelexed Roswell Park Memorial Institute Medium (cRPMI) 9 mit der Formel: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (Kultur )]
Hinweis: Referenz 9 enthält Einzelheiten über cRPMI Vorbereitung.- Die berechnete Kulturvolumen (von oben) in ein Zentrifugenröhrchen und Pelletzellen durch bei 10.000 x g für 1 min dreht. Um prepadas verbrauchte Nährmedium und resuspendieren Zellpellet in 20 ml cRPMI re Biofilm Inokulum absaugen.
- Gießen Inokulum in einen 25-ml-Reservoir.
- Entfernen Sie vorsichtig den Deckel aus einer sterilen 96-Well-Platte peg diese gerade nach oben ziehen.
Hinweis: Bitte achten Sie dürfen nicht die Heringe zu verunreinigen nach unten aus dem Deckel hängen. Der Deckel kann in einem Biosicherheitsschrank auf eine saubere Oberfläche den Kopf gestellt werden. - Verwendung eines 200 & mgr; l Mehrkanalpipette, fügen 125 ul Impfgut zu jeder Vertiefung der Reihen A bis G der Bodenplatte.
- Füllen Sie 125 ul sterile cRPMI Medium in jeder Vertiefung der Reihe H als Sterilitätskontrolle.
- Nehmen Sie die peg-Deckel und halten Sie ihn mit den Zapfen über dem Plattenboden nach unten. sorgfältig ausrichten, um die einzelnen Stifte mit ihren jeweiligen Brunnen. Vermeiden Sie Körperkontakt zwischen der Platte und den Zapfen. Nach der Ausrichtung senken vorsichtig nach unten den Deckel. Vermeiden Sie Fehlstellungen wie ausgeführt Nachjustierungen nach den Zapfen der Bodenplatte berührt haben cont kannaminate Sterilität Kontrollen in Reihe H.
- Verschließen Sie den Deckel auf die Platte mit Paraffin Filmverdampfung und in einen verschließbaren Plastikbeutel zu verhindern, Abdichtung fest. Halten Sie das Luftvolumen in der Tasche so gering wie möglich Verdunstung zu minimieren.
- Inkubieren ohne für 48 Stunden in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C schüttelnd.
Hinweis: 48 Stunden des Wachstums von S. optimal gewesen aureus, sondern wird auf den Organismus verwendet , variieren.
Hinweis: Obwohl statische Inkubation ein guter Ausgangspunkt ist der Test zu optimieren, sanft bei 150 Umdrehungen pro Minute auf einem Schüttler Schütteln ist eine mögliche Variante , die die Biofilmbildung von einigen S. verbessern kann aureus - Isolaten.
2. Herstellung der Biofilm Challenge-Platte
- Am Tag des Biofilms Herausforderung nehmen eine frische 96-Well-Platte und fügen 100 ul cRPMI, auf RT ins Gleichgewicht gebracht, in jede Vertiefung der Zeilen B bis H. inkonsistente Ergebnisse zu vermeiden, verwenden eine 96-Well-Platte, die 200 & mgr; l aufnehmen kanninnerhalb der Medien, wenn die Heringe, und verfügt über Vertiefungen mit Abmessungen identisch mit denen des Biofilms Einleitung Platte.
- Verdünne bis zu 4 Testverbindungen getrennt in 1,0 ml cRPMI die gewünschte Endkonzentration, um zu 2x für eine Endverdünnung in Schritt 2.7 zu berücksichtigen.
Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt ist 8-fach über die hemmende Konzentration von planktonischen Zellen. - In 200 ul der Verbindung 1 in den Vertiefungen A1 bis A3, die Verbindung 2 in Brunnen A4 bis A6, Verbindung 3 in Brunnen A7 bis A9 und Verbindung 4 in Brunnen A10 bis A12.
- Abwechselnd verdünnen die Testverbindungen mit einer Mehrkanalpipette mit und 100 & mgr; l aus Reihe A übertragen B und mischen zu rudern.
- Auf diese Weise weiterhin 100 ul Vertiefung zu Vertiefung zu übertragen. Mischen Sie nach jeder Übertragung und stoppen in der Reihe F.
- Nach dem Mischen vertreiben 100 & mgr; l aus Reihe F in einen Abfallbehälter. Verwenden Sie keine Flüssigkeit in Reihen G und H. übertragen
- 100 l cRPMI zu jeder Vertiefung der Platte mit einer Mehrkanalpipettebringen das Volumen auf 200 ul. Siehe Abbildung 1 für die endgültige Plattenlayout.
3. Biofilm Herausforderung
- Mit 200 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf eine frische sterile 96-Well-Platte, die Vertiefungen mit Abmessungen identisch mit denen des Biofilms Initiationsplatte verfügt.
- Entfernen Sie den Plastikbeutel und Paraffinfilm aus inkubiert Biofilm Initiationsplatte.
- Heben Sie den Deckel gerade nach oben. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen den Zapfen und dem Plattenboden, da dies den Biofilm beschädigen können. Halten Sie Unterteil für die nachfolgende OD 600 - Analyse (siehe 3.8).
- Wegspülen planktonischen Zellen durch den Stift-Deckel auf die Platte legen enthält PBS (aus Schritt 3.1). Versenken Pflöcke für 5 Sekunden, heben Sie aus PBS, und tauchen noch einmal, man aufpassen, nicht die Zapfen gegen die Seiten gut zu treffen.
- Setzen Sie den abgespült peg-Deckel in die Herausforderung Platte. Vermeiden Sie unnötigen Kontakt zwischen Zapfen und Bodenplatte, da dies der Biofilm führt zu Schäden aninkonsistente Ergebnisse.
- Die Dichtungsplatte mit Paraffinfilm und in einen verschließbaren Beutel aus Kunststoff, wie in Schritt 1.10 beschrieben.
- Inkubiere die Platte für 24 Stunden bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator ohne Schütteln.
- Nehmen Unterseite des Biofilms Initiationsplatte von 3,3. Resuspendieren der Bakterien in jeder Vertiefung einer Mehrkanalpipette mit und die OD 600 mit einem geeigneten Mikroplatten - Reader messen Wachstum zu bestätigen in allen Vertiefungen , aber die Sterilität Kontrollen in Reihe H. vorkommenden
4. Biofilm Bestimmung
- Verwenden Leser eine Platte mit einer Inkubationskabine ausgestattet und in der Lage nehmen kinetische Fluoreszenzmesswerte zur Erfassung von Resazurin Umwandlung. Legen Sie eine 24-Stunden-kinetische Fluoreszenzmessung unter Verwendung eines 530 nm Anregung und 590 nm Emission auf.
- Stellen Sie die Raumtemperatur auf 37 ° C und haben die Platte alle 20 Minuten lesen. Stellen Sie den Leser Platte von der Unterseite der Platte zu messen, nach Herstelleranweisunggen.
- Bereiten Waschplatte durch Zugabe von 200 ul PBS mit einer Mehrkanalpipette in eine sterile 96-Well-Platte.
- Bereiten Biofilm Wiederherstellungsmedium durch Zugabe von 400 & mgr; l von 0,8 mg / ml Stammlösung zu 20 ml cRPMI Medium auf eine Endkonzentration von 16 & mgr; g / ml Resazurin Resazurin.
Hinweis: Resazurin ist eine bekannte hautreizend. Verwenden Sie einen Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe bei der Handhabung. CRPMI als Biofilm Recovery-Medien wurde verwendet, da es den niedrigsten Hintergrundsignal liefert, aber es kann von Mueller-Hinton-Medien gegebenenfalls ersetzt werden. - In 150 ul Biofilm Recovery Medium mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer frischen 96-Well-Platte.
- Transfer Herausforderung Platte aus Inkubator in einem Biosicherheitsschrank und sorgfältig Plastiktüte und Siegelfolie entfernen.
- Entfernen Sie die peg-Deckel von der Herausforderung Platte und abzuspülen planktonischen Zellen in PBS, wie in 3.4 beschrieben. Halten Sie den Boden der Herausforderung Platte für nachfolgende OD 600 anaLyse (siehe 4.10).
- Nach dem Spülen, legen Sie den zapfen Deckel in den Plattenboden des Biofilms Recovery-Medium enthält.
- Wickeln Sie die Seite der Platte mit Paraffinfilm, wobei darauf geachtet, nicht den Boden der Umfang Brunnen zu behindern. Unmittelbar nach der Platte Verpackung, legen Sie sie auf dem Plattenleser und eine kinetische Lese über einen Zeitraum von 24 h beginnen, indem die bisherigen Resazurin kinetische Protokoll von Schritt 4.1 zu initiieren.
- Um das Wachstum von planktonischen Zellen zu quantifizieren , die während der Herausforderung auftreten, lesen Sie die OD 600 der gesamten Herausforderung Plattenboden kann oder auch nicht ein Mikroplattenleser. Folgen Sie die Anweisungen in Schritt 3.8.
Hinweis: vorsichtig resuspendieren den Inhalt jeder Vertiefung als Shedding Zellen aus den Biofilm neigen dazu, in Klumpen am Boden der Vertiefung zu wachsen. Alle Blasen innerhalb des Schachtes wird stark mit OD 600 Lesungen stören und müssen vor dem Lese vermieden oder entfernt werden.
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Representative Results
Der Resazurin-Assay ist empfindlich genug, um zuverlässig sehr wenige lebensfähige Zellen replizieren in drogenfreien Medium nach der Herausforderung der Lage zu erkennen. In dieser Methode definieren wir die minimale Biofilm auszurotten Konzentration als die niedrigste Konzentration, bei der keine Resazurin Umwandlung innerhalb von 24 h zu sehen ist. Der Resazurin-Assay beruht auf oxidativen Moleküle in metabolisch aktiven Zellen gefunden, die den Farbstoff Farbe von blau zu rosa konvertieren. Farbstoffumwandlung ist somit ein Indikator für das Zellwachstum und können unter Verwendung einer Fluoreszenzmikroplattenlesegerät quantifiziert werden. In diesem Papier Neocuproin und Cu-Neocuproin (Neocuproin mit Kupfer komplexiert) , wurden auf ihre Aktivität gegenüber Biofilm assoziierten S. getestet aureus Anwendung eines Layout , das auf Figur 1 basiert. Die Daten , die während der Ausführung des Protokolls erhalten werden , sind ein OD 600 Lesen der Biofilm Initiationsplatte, die als Qualitätskontrolle dient (Daten nicht gezeigt)Wurde eine OD 600 Lesen der Plattenboden nach dem Challenge (2A) abgeschlossen worden ist , und eine kinetische Aufzeichnung von Resazurin Umwandlung in seinen fluoreszierenden Metaboliten Resorufin der Erholung Platte (2B). Ferner kann ein Endpunkt Bild der Herausforderung Platte zur visuellen Inspektion von Resazurin Umwandlung (2C) , wenn eine ja / werden keine Auswertung von Resazurin Umwandlung zum Zwecke des Experiments ausreichend ist. Alternativ, wenn kinetische Aufnahme - Funktionen nicht verfügbar oder mehrere sind Platten parallel ausgeführt werden, Fluoreszenz kann nach 24 Stunden durch einen einzelnen Endpunkt Lese bestimmt werden. Wie in 2A, Lesungen aus der Herausforderung Platte OD gesehen zeigen , dass Neocuproin allein nicht das Wachstum von planktonischen Zellen hemmt; jedoch Cu-Neocuproin hemmt das Wachstum bei 1,3 & mgr; M, wie 10 erwartet. Ein ähnliches Muster ist aus der Resazurin Kinetik der Biofilm Platte beobachtet, was anzeigt,dass nur Cu-Neocuproin der Lage ist , metabolisch aktiven Biofilm-assoziierten Zellen (2B) zu beseitigen.
Neben Biofilm Eradikation Konzentrationen Bereitstellung stellt die kinetische Assay Informationen über den Stoffwechselzustand des Biofilms, der von der Anzahl der lebensfähigen Bakterien anzeigt. Wenn Biofilme , behandelt mit Gentamicin Vergleich bei Konzentrationen zu den unbehandelten Kontrollen erhöhen, können eine Verzögerung von Resazurin Umwandlung zu sehen (Abbildung 3). Für 2,5 ug / ml Gentamicin, gibt es eine 13 Stunden Verzögerung, bis die gut die gleiche Umwandlung von Resazurin als der unbehandelten Kontrolle erreicht. Diese Verzögerung kommt wahrscheinlich von einer reduzierten Anzahl von lebensfähigen Zellen in den behandelten Biofilms gegenüber dem unbehandelten.
Abbildung 1. Challenge - Plattenlayout. Example Layout Herausforderung Platte parallele Prüfung von vier Verbindungen in dreifacher Ausfertigung in sechs verschiedenen Konzentrationen aufnimmt. Unbehandelte und Sterilität Kontrollen sind ebenfalls enthalten. Das Layout-Design unterstützt bequem in Platten Herstellung von Verdünnungsreihen mit einer Mehrkanalpipette mit. Die Konzentrationen sind in uM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Bestimmung Mindest Biofilm - Eradikation Konzentration. Neocuproin und Cu-Neocuproin wurden für Biofilm - Eradikation Potential getestet. (A) Die OD 600 wurde aus der Herausforderung Platte nach dem Entfernen der PEG-lid genommen , das Wachstum von Biofilmen dissoziierten Zellen zu quantifizieren. (B) Resazurin Umwandlung wurde kinetisch in indivi überwachtDual-Brunnen über einen Zeitraum von 24 Std. Einzelne minigraphs zeigen Fluoreszenz (RFU) über die Zeit (24 h). Der Mangel an Resazurin Umwandlung zeigt die Abwesenheit von Überlebenden. Resazurin Umwandlung zeigt das Vorhandensein von lebenden Zellen des Biofilms und wächst in der Wiederherstellungsmedium zu vergießen. (C) Wenn ein kinetisches Auslesen nicht möglich ist oder nicht benötigt wird , dann eine einfache Ja / Nein - Antwort auf das Vorhandensein von lebenden Zellen visuell von der Farbumwandlung des blauen Resazurin zu seiner rosa, reduzierte Form bestimmt werden können. Bitte klicken Sie hier , um die sehen eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Kinetische Resazurin - Assay zeigt eine hemmende Wirkung auf Bakterien in einem Biofilm. Die Verbindungen können nicht vollständig Biofilm eingebetteten Zellen zu beseitigen, kann aber immer noch die Verringerungir Lebensfähigkeit. Dies kann gesehen werden, wenn die Verzögerung von Resazurin Umwandlung von Vertiefungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Gentamicin behandelt vergleicht. Wells, die eine Verzögerung in Resazurin Umwandlungs zeigen eine verringerte Anzahl von lebensfähigen Zellen sind. Schwarz (nur Medien), Orange (0 ug / ml), Grün (0,3 ug / ml), Blau (0,6 ug / ml), Lila (2,5 ug / ml) und Grau (5 ug / ml). At bezieht sich auf die Zeitdifferenz des exponentiellen Resazurin Umwandlung zwischen unbehandelten und Gentamicin behandelten Proben in der ungefähren Hälfte maximale Fluoreszenzwert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier haben wir ein abgewandeltes Biofilm - Assay zur Bestimmung der Aktivität der getesteten Inhibitoren auf S. beschrieben aureus Biofilm auf den Stoffwechselzustand von Biofilm assoziierten Zellen konzentriert. Während die beschriebene Biofilm Initiierung und Widerspruchsverfahren meist nachgeahmten Herstellerempfehlungen, die Verwendung von Resazurin Farbstoff Biofilm-assoziierte Zellen, die eine 24-Stunden-Inhibitor Herausforderung überleben dramatisch vereinfacht die empfohlene Verfahren der Zellgewinnung (über Wasserbad Sonifikation) und nachfolgende Aufzählung nachzuweisen und zu quantifizieren der lebensfähigen Zellen durch Zählen der CFUs. Dieser Hersteller empfohlenen Verfahren umfasst mindestens 5 zusätzliche Manipulationsschritte, von denen jeder fehleranfällig, arbeitsintensiv und unpraktisch zu automatisieren. Der Vorteil der Auslesevorgang des Zapfens Plattentest zu vereinfachen, erhöht seine Attraktivität für hohen Durchsatz Operationen und Anwendungen.
Obwohl ein langwieriger Protokoll nach der Anzahl der Schritte, dieses procedure ist eher konzeptionell einfach, mit wenigen kritischen Schritte. Die meisten entscheidend ist, die Fähigkeit, Biofilme von der gleichen Qualität zu immer wieder für den Erhalt reproduzierbarer Ergebnisse wesentlich wachsen. Darüber hinaus muss man Vorsicht walten lassen, wenn die peg-Deckel zu entfernen oder zu ersetzen. Kontakt an einer beliebigen Stelle mit einer Wand des Brunnens würde den Biofilm stören, Verkanten Ergebnisse. Um so mehr ist eine ausreichende Wasch entscheidend: Versagen entfernt messen jede Fähigkeit Biofilm-assoziierten Bakterien planktonischen Zellen an jedem beliebigen Punkt zu entfernen. Umgekehrt muss aber Waschen nicht zu streng sein; zusätzliche Waschschritte beginnen können Biofilm zu entfernen, inkonsistente Ergebnisse zu erzeugen.
Der Zapfen Platte Ansatz hat mehrere Verwendungen, abhängig von der gewünschten resultierenden Daten. Der Assay wird hier beschrieben als informationsreichen kinetische Messung der metabolischen Resazurin Umwandlung in ein Fluoreszenzfarbstoff 11. Diese Umwandlung wird mit einer Farbverschiebung von blau zugeordnet pink (2C), die in additiauf das Lese quantitative Fluoreszenz, ermöglicht eine einfache anfängliche qualitative Anzeige einfach durch die Umwandlung zu beobachten. Nach der Stange Deckel abnehmen, kann diese Umwandlung auch durch das Lesen der Absorption bei 600 nm quantifiziert werden Funktionen nicht zur Verfügung stehen Fluoreszenz sollte. Obwohl die Fluoreszenz schließlich auf maximale Farbstoffumwandlungs Plateaus in jeder Vertiefung (mit Überlebenden), könnte der Beginn der Farbstoffumwandlung verwendet werden , um die metabolisch aktive Überlebende Population relativ zur unbehandelten Kontrolle (Abbildung 3) abzuschätzen. In unseren Händen haben wir, dass jede ~ 100 min Verzögerung des Einsetzens von Resazurin Umwandlung 10-fache Abnahme in der Zahl metabolisch aktiver Zellen in dem Ausgangs Inokulum relativen entspricht etwa einem zur unbehandelten Kontrolle festgestellt (wie in planktonischen Zellkultur bestimmt seriell verdünnt, in 10-fachen Schritten Biofilm Rückgewinnungsmedium (Daten nicht gezeigt)).
Jenseits kinetische Ablesungen, obwohl der modifizierte peg PlatteVerfahren ist zugänglicher für Hochdurchsatz-Wirkstoff Bildschirm Projekte als das ursprüngliche Protokoll. Durch Messung Resazurin Umwandlung als Endpunkt statt eines kinetischen kann ein Benutzer eine binäre Analyse der Proben erzeugen einfache Aktivität der Verbindungen zu verfolgen (dh Farbstoffumwandlungs / no conversion), wodurch die Notwendigkeit für 24 hr in einem Fluoreszenzplattenlesegerät entfernt und ermöglicht herkömmliche Inkubationszeiten. Diese Methodik ermöglicht die minimale Biofilm Bestimmung ohne die Notwendigkeit der Sonifikation und Plattieren Ausmerzung Konzentration. Die kinetische Lese verfolgt auch die metabolischen Zustand des Biofilms auf dem Behandlungszustand und Inhibitor-Konzentration abhängig. Die reduzierte Anzahl der Manipulationsschritte, erhöhte Reproduzierbarkeit und quantitative Ausleseverfahren (wie jede Vertiefung einzeln 12 bis Plattieren gegen) ermöglicht es Benutzern , möglicherweise in einer einzigen Konzentration Bild pro Tag Tausende von Verbindungen zu screenen. In der Tat wurden Platten peg-Stil zuvor im Hochdurchsatz-dr verwendetug Bildschirme für Biofilm Dispergiermittel, obwohl Resazurin (wie hier verwendet) ist eine viel wirtschaftlichere Wahl als die proprietäre Luciferase - Reagenz 13 verwendet.
Während eine allgemeine Verbesserung gegenüber den bestehenden Hersteller Protokoll, featured der Test hier gewisse Einschränkungen hat muss man im Auge behalten. Inhärent, messen wir nur metabolische Fähigkeit von Biofilm-assoziierten Zellen. Dieser Test misst nicht Biofilmmasse oder auf andere Weise die Biofilm-Architektur oder Integrität schwächen. Diese Effekte würden nicht unbedingt nachgewiesen werden. Metabolisch inaktiv, aber noch lebensfähig, persister Zellen, die in Biofilmen 14,15 wird auch unerkannt sein existieren abgebildet wurden. Weitere Verbindungen, die quiescence induzieren, ohne tatsächlich ein Biofilm Sterilisieren fälschlicherweise als falsch positiv erscheinen könnte, je nach Länge des induzierten Zustand. Viability Indikatoren sind letztlich Surrogate für mehr eisengepanzerten Messmethoden wie Durchflusszytometrie oder CFUAufzählung, und der Endbenutzer muss bestimmen, welche Methode geeignet ist. Schließlich ist, wie die Resazurin Umwandlung auf endogene NADH beruht, Erschöpfung der intrazellulären Lagern könnte für Bakterien schädlich sein. Wir haben zwar nicht schädlichen Wirkungen gegen S. beobachtet aureus, andere Bakterienarten können unterschiedlich reagieren. Benutzer müssen empirisch zu testen und dieses Protokoll für Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit gegeben unterschiedlichen Organismen und Laborumgebungen zu validieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K.
