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Immunology and Infection

Orientación de Biofilm Asociadas Published: May 5, 2016 doi: 10.3791/53925
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Introduction

Los microbios patógenos pueden formar biopelículas in vivo que conducen a infecciones crónicas no agudos 1. Infección por biofilm asociado es un factor de riesgo grave de procedimientos médicos que implican la implantación de cuerpos extraños (por ejemplo, substituciones de huesos artificiales, implantes de pecho) o la instalación de los tubos traqueales o catéteres urinarios 2. En estos contextos, la terapia anti-infecciosa es casi siempre necesario como infecciones basado en biopelícula rara vez se borran por su cuenta, incluso en individuos inmunocompetentes. Staphylococcus aureus es uno de los patógenos más frecuentemente observados implicados en las complicaciones relacionadas con la biopelícula que se producen durante el uso de dispositivos médicos invasivos 3.

Desafortunadamente, la naturaleza misma de biofilms como una barrera protectora hace más resistentes al tratamiento que las células planctónicas 1,4, y la evaluación de la eficacia clínica predicho es una parte crítica de tanto inicialel desarrollo de fármacos, así como vigilar la resistencia. Existe una creciente reconocimiento de que las condiciones de laboratorio, se centró en las culturas planctónicos, pueden no representar fielmente la enfermedad en el mundo real 5. Agravando aún más el problema, la replicación de los fenotipos de biopelícula es difícil, y los modelos de biopelículas existentes son tediosos y sufren de alta variabilidad inter e intra-ensayo 6. Por lo tanto, muchos investigadores, por necesidad, por defecto a ensayos de células planctónicas de susceptibilidad a los fármacos, lo que potencialmente descuidar un aspecto importante de la virulencia bacteriana y la enfermedad.

Aquí se describe el protocolo para el ensayo de bacterias, específicamente S. aureus, en los biofilms pre-crecido que utilizan un sistema de biopelícula 7,8 basadas en 96 pocillos. Mientras que el protocolo para la formación de biopelículas y el desafío sigue esencialmente la recomendación del fabricante, se presenta una metodología rica en información alternativa para cuantificar la viabilidad de la bioFILM después de la exposición. Brevemente, las bacterias se cultivan en la placa de clavija, donde las biopelículas se forman en las clavijas sobresalientes unidos a la tapa de la placa. Después de la formación de biopelículas, las clavijas se sumergen suavemente en pocillos de una placa fresca llena con PBS para eliminar las células planctónicas. El PEG-tapa, con biofilms adjuntos, se transfiere a una nueva placa de desafío, que contiene varias concentraciones de antibióticos a ensayar. Después de una segunda incubación, las tapas se retiran de nuevo, se lavaron y se transfirieron a una placa de recuperación que contiene resazurina tinte, donde se someten a una incubación final. conversión resazurina se puede grabar cinéticamente o toma como una lectura de punto final después de un período de recuperación definido. Este método basado en el colorante de la cuantificación de la viabilidad de biofilms difiere considerablemente de las CFU (unidades formadoras de colonias) tediosas metodología basada en contar se describe en el protocolo original 7. OD 600 mediciones de la placa desafío de las drogas y resazurina cinética de conversión sirven como lectura viabilidadouts de células planctónicas y biofilm, respectivamente, que ofrecen un ensayo rápido, fiable, rico en información y técnicamente simple para la supervivencia de biopelículas.

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Protocol

1. Iniciación de biopelículas

  1. Hacer crecer una cultura de producción de biofilm organismo en un medio rico en nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus cepa Newman en 10 ml de medio Mueller-Hinton de un stock de glicerol. Realizar todos los trabajos que impliquen la manipulación de S. aureus con guantes y dentro de una cabina de bioseguridad.
  2. Incubar durante 16 horas a 37 ° C en un agitador rotatorio (100 a 200 rpm).
  3. Determinar DO600 del cultivo usando un espectrofotómetro y una cubeta estándar (longitud de recorrido: 1 cm).
  4. Calcular el volumen (V) de la cultura necesaria para preparar 20 ml de inóculo con OD 600 (inóculo) de 0,1 en chelexed medios Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) 9 usando la fórmula: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (cultivo )]
    Nota: Referencia 9 proporciona detalles sobre la preparación cRPMI.
    1. Añadir el volumen de cultivo calculado (desde arriba) a un tubo de centrífuga y las células de pellets por centrifugación durante 1 min a 10.000 x g. para prepare inóculo biofilm, aspirar el pellet de células medio de cultivo y se resuspenden en 20 ml pasado cRPMI.
  5. Verter inóculo en un depósito de 25 ml.
  6. Retirar con cuidado la tapa de una placa de PEG de 96 pocillos estériles tirando de él hacia arriba.
    Nota: Se debe tener cuidado de no contaminar las clavijas que cuelgan por debajo de la tapa. La tapa se puede colocar boca abajo sobre una superficie limpia dentro de una cabina de bioseguridad.
  7. Usando una pipeta multicanal l 200, añadir 125 l de inóculo a cada pocillo de las filas A a G de la placa inferior.
  8. Llenar medio cRPMI 125 l estéril en cada pocillo de la fila H como un control de esterilidad.
  9. Tome la clavija-tapa y mantenerla por encima del fondo del plato con las clavijas hacia abajo. alinee con cuidado las clavijas individuales con sus respectivos pozos. Evitar el contacto físico entre la placa y las clavijas. Una vez alineado, baje la tapa con cuidado hacia abajo. Evitar desajustes como reajustes realizados después de las clavijas han tocado la placa inferior puede contcontroles de esterilidad aminar en la fila H.
  10. Sellar la tapa a la placa con película de parafina para evitar la evaporación y colocar en una bolsa de plástico con cierre, sellado herméticamente. Mantenga el volumen de aire en la bolsa lo más bajo posible para minimizar la evaporación.
  11. Se incuba sin agitación a 37 ° C durante 48 horas en un incubador de CO2 al 5%.
    Nota: 48 h de crecimiento ha sido óptima para S. aureus, pero variará basado en el organismo utilizado.
    Nota: Aunque la incubación estática es un buen punto de partida para optimizar el ensayo, agitando suavemente a 150 rpm en un agitador de microplacas es una posible variación que pueden mejorar la formación de biopelículas de algunos S. aureus aislados.

2. Preparación de la placa de biofilm Challenge

  1. En el día del desafío biopelícula tomar una placa de 96 pocillos fresca y añadir 100 l de cRPMI, se equilibraron a temperatura ambiente, a cada pocillo de las filas B a H. Para evitar inconsistencias en los resultados, utilizar una placa de 96 pocillos que tiene capacidad para 200 lde medios de comunicación cuando las clavijas están en el interior, y cuenta con pozos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación biofilm.
  2. Diluir hasta 4 compuestos de ensayo por separado en 1.0 ml de cRPMI a 2x la concentración final deseada, con el fin de dar cuenta de una dilución final en el paso 2.7.
    Nota: Un buen punto de partida es 8 veces por encima de la concentración inhibitoria de las células planctónicas.
  3. Añadir 200 l de compuesto 1 en los pocillos A1 a A3, compuesto 2: pocillos A4 a A6, el compuesto 3 en pozos A7 a A9 y el compuesto 4 en pocillos A10 a A12.
  4. Diluciones seriadas de los compuestos de ensayo utilizando una pipeta multicanal y la transferencia de 100 l de la fila A a la fila B y mezclar.
  5. De esa manera, continúe el traspaso de 100 l pozo en pozo. Mezclar después de cada traslado y la parada en la fila F.
  6. Después de mezclar, expulsar a 100 l de la fila F en un contenedor de residuos. No transfiera cualquier líquido a las filas G y H.
  7. Añadir 100 l de cRPMI a cada pocillo de la placa usando una pipeta multicanal allevar el volumen a 200 l. Ver Figura 1 para la disposición final de la placa.

3. El biofilm Challenge

  1. Añadir 200 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una placa de 96 pocillos estéril fresco que cuenta con pozos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación biofilm.
  2. Retire la bolsa de plástico y lámina de parafina de la placa se incubó la iniciación de biopelículas.
  3. Levante la tapa hacia arriba. Evitar el contacto entre las clavijas y el fondo del plato, ya que podría dañar la biopelícula. Mantenga la parte inferior para su posterior análisis OD 600 (véase la sección 3.8).
  4. Enjuague las células planctónicas mediante la colocación de la clavija-tapa sobre la placa que contenía PBS (del paso 3.1). Sumergir las clavijas durante 5 segundos, sacar de la PBS, y se sumerja de nuevo, teniendo cuidado de no golpear las clavijas contra los lados así.
  5. Coloque la clavija-tapa se enjuaga en la placa de desafío. Evitar el contacto innecesario entre las clavijas y la placa inferior, ya que dañará la biopelícula que lleva aresultados inconsistentes.
  6. La placa del sello con la película de parafina y colocar en una bolsa de plástico con cierre, como se describe en el paso 1.10.
  7. Se incuba la placa sin agitación durante 24 horas a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
  8. Tomar parte inferior de la placa de biofilm iniciación de 3,3. Volver a suspender las bacterias en cada pocillo usando una pipeta multicanal y medir el diámetro exterior 600 con un lector de microplacas adecuado para confirmar el crecimiento se produce en todos los pozos, pero los controles de esterilidad en la fila H.

4. Determinación de biopelículas

  1. Use un lector de placas equipado con una cámara de incubación y capaz de tomar lecturas de fluorescencia cinéticos para la detección de resazurina conversión. Configurar una medición de fluorescencia cinética de 24 horas usando una excitación de 530 nm y 590 nm de emisión.
  2. Ajuste la temperatura de la cámara a 37 ° C y tiene la placa de leer cada 20 minutos. Ajuste el lector de placas para medir desde la parte inferior de la placa de acuerdo con instrucciones del fabricanteciones.
  3. Preparar la placa de lavado mediante la adición de 200 l de PBS con una pipeta multicanal a una placa de 96 pocillo estéril.
  4. Preparar medio de recuperación de biopelícula mediante la adición de 400 l de 0,8 mg / ml de solución madre de resazurina a 20 ml de medio cRPMI a una concentración final de 16 mg de resazurina / ml.
    Nota: La resazurina es un irritante conocido piel. Use una bata de laboratorio, gafas protectoras contra salpicaduras y guantes durante la manipulación. CRPMI como el medio de recuperación de biopelícula se utilizó ya que proporciona la señal de fondo más baja, pero puede ser sustituido por medios de Mueller Hinton si es apropiado.
  5. Añadir 150 l de medio de recuperación de la biopelícula con una pipeta multicanal a cada pocillo de una placa de 96 pocillos fresca.
  6. Transferencia placa desafío de la incubadora en una cabina de bioseguridad y retirar con cuidado bolsa de plástico y lámina de cierre.
  7. Retire la clavija-tapa de la placa de desafío y enjuagar las células planctónicas en PBS como se describe en 3.4. Mantenga la parte inferior de la placa de desafío para la posterior OD 600 analisis (véase 4.10).
  8. Después de aclarar, coloque la clavija-tapa en la parte inferior placa que contiene el medio de recuperación de biopelícula.
  9. Envolver el lado de la placa con película de parafina, teniendo cuidado de no obstruir el fondo de los pocillos de perímetro. Inmediatamente después de concluir la placa, colocarla en el lector de placas y empezar una lectura cinética durante un período de 24 horas, iniciando el hecho previamente resazurina protocolo cinética desde el paso 4.1.
  10. Para cuantificar el crecimiento de las células planctónicas que pueden o no pueden ocurrir durante desafío, leer la OD 600 de toda la placa inferior desafío usando un lector de micro placa. Siga las instrucciones dadas en el paso 3.8.
    Nota: resuspender cuidadosamente el contenido de cada pocillo como células vertimiento de la biopelícula tienden a crecer en grupos en la parte inferior del pozo. Cualquier burbuja dentro del pozo serán fuertemente interferir con las lecturas de DO a 600 y deben ser evitadas o eliminadas antes de la lectura.

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Representative Results

El ensayo de la resazurina es suficientemente sensible para detectar con fiabilidad muy pocas células viables capaces de replicarse en medio libre de fármaco después de la exposición. En esta metodología, se define el biofilm erradicar la concentración mínima como la concentración más baja a la que no se observa una conversión de resazurina dentro de las 24 horas. El ensayo se basa en la resazurina moléculas oxidativas que se encuentran en las células metabólicamente activas que convierten el color del tinte de azul a rosa. conversión del tinte es, pues, un indicador de crecimiento celular, y se puede cuantificar usando un lector de placas de micro fluorescente. En este trabajo, neocuproína y Cu-neocuproína (neocuproína complejo con cobre) fueron probados por su actividad hacia la biopelícula asociada S. aureus aplicando una disposición que se basa en la Figura 1. Los datos obtenidos durante la ejecución del protocolo son una lectura OD 600 de la placa de iniciación biofilm, que sirve como un control de calidad (datos no mostrados), Una lectura OD 600 de la parte inferior de placa después de la exposición se ha completado (figura 2A), y una grabación cinética de la conversión de la resazurina en su fluorescente resorufina metabolito de la placa de recuperación (Figura 2B). Además, una imagen de punto final de la placa de desafío se puede utilizar para la inspección visual de la conversión de resazurina (Figura 2C) si un sí / no evaluación de conversión resazurina es suficiente para el propósito del experimento. Alternativamente, si la capacidad de grabación cinéticos no están disponibles o múltiple las placas se ejecutan en paralelo, la fluorescencia puede ser determinada después de 24 horas por una sola lectura de punto final. Como se ve en la Figura 2A, las lecturas de DO a partir de la placa de desafío indican que neocuproína sola no inhibe el crecimiento de células planctónicas; sin embargo, Cu-neocuproína inhibe el crecimiento a 1.3 M, como se esperaba 10. Un patrón similar se observa desde la cinética resazurina de la placa de biofilm, lo que indicaque sólo Cu-neocuproína es capaz de eliminar las células del biofilm asociada metabólicamente activas (Figura 2B).

Además de proporcionar concentraciones de erradicación de biofilm, el ensayo cinético proporciona información sobre el estado metabólico de la biopelícula lo que es indicativo del número de bacterias viables. Al comparar biofilms tratados con gentamicina a concentraciones crecientes de los controles no tratados, un retraso de la conversión de la resazurina se puede ver (Figura 3). Para 2,5 mg / ml de gentamicina, hay un retraso de 13 horas hasta que el pozo alcanza la misma conversión de resazurina como el control no tratado. Este retraso probablemente proviene de un número reducido de células viables presentes en el biofilm tratado en comparación con la no tratada.

Figura 1
Figura 1. Desafío disposición de la placa. Example diseño de la placa desafío acomodar las pruebas en paralelo de cuatro compuestos, por triplicado, a los seis concentraciones distintas. También se incluyen los controles no tratados y de esterilidad. El diseño de la disposición apoya conveniente preparar en la placa de diluciones en serie utilizando una pipeta multicanal. Las concentraciones están en M. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Determinación de la concentración mínima de erradicación de biopelícula. Neocuproína y Cu-neocuproína se probaron para el potencial de la erradicación de la biopelícula. (A) La OD 600 fue tomado de la placa de desafío después de la retirada de la clavija-tapa para cuantificar el crecimiento de las células del biofilm disociado. Conversión (B) La resazurina se controla cinéticamente en indivipozos duales durante un período de 24 horas. minigraphs individuales muestran fluorescencia (URF) con el tiempo (24 horas). La falta de conversión de resazurina indica la ausencia de supervivientes. conversión resazurina indica la presencia de células viables vertimiento de la biopelícula y crecen en el medio de recuperación. (C) Si una lectura cinética no es posible o no es necesario, a continuación, un simple sí / no hay respuesta para la presencia de células viables se pueden determinar visualmente a partir de la conversión del color de la resazurina azul a su rosa, forma reducida. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. ensayo de resazurina Kinetic revela efectos inhibidores sobre las bacterias en un biopelícula. Los compuestos no puede erradicar completamente las células del biofilm incorporado, pero aún así puede reducir elviabilidad ir. Esto se puede ver al comparar el retardo de resazurina conversión de los pocillos tratados con diferentes concentraciones de gentamicina. Wells que tienen un retardo en la conversión de resazurina indican un número reducido de células viables. Negro (sólo medios de comunicación), Orange (0 mg / ml), verde (0,3 g / ml), azul (0,6 mg / ml), púrpura (2,5 g / ml), y Gray (5 mg / ml). Dt se refiere a la diferencia de tiempo de la conversión resazurina exponencial entre las muestras no tratadas y tratadas con gentamicina al valor máximo de fluorescencia media aproximada. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, hemos descrito un ensayo de biopelícula modificado para determinar la actividad de los inhibidores de la prueba sobre S. biopelículas aureus que se centran en el estado metabólico de las células del biofilm asociado. Mientras que la iniciación de la biopelícula se describe y procedimientos reto recomendaciones del fabricante sobre todo imitaba, el uso de resazurina tinte para detectar y cuantificar las células del biofilm-asociado que sobreviven a un desafío inhibidor de 24 hr simplifica enormemente el procedimiento recomendado de recuperación de células (a través de sonificación baño de agua) y la posterior enumeración de células viables mediante recuento de UFC. Este procedimiento recomendado por el fabricante incluye al menos 5 pasos de manipulación adicionales, cada uno de ellos propenso a errores, mano de obra intensiva, y poco práctico de automatizar. La ventaja de simplificar el procedimiento de lectura del ensayo de placa de PEG aumenta su atractivo para las operaciones de alto rendimiento y aplicaciones.

A pesar de un largo protocolo por el número de pasos, este procedure es más bien conceptualmente simple, con pocos pasos críticos. Lo más crucial es la capacidad de crecer en repetidas ocasiones las biopelículas de la misma calidad es esencial para obtener resultados reproducibles. Por otra parte, hay que tener cuidado siempre de retirar o sustituir la clavija-tapa. Póngase en contacto en cualquier momento con la pared de un pozo pueda interrumpir el biofilm, sesgando los resultados. Más aún, un lavado adecuado es crucial: el fracaso para eliminar las células planctónicas en cualquier punto se elimina la capacidad de medir las bacterias biofilm asociado. A la inversa, sin embargo, el lavado no debe ser demasiado riguroso; pasos adicionales de lavado pueden comenzar a retirar la biopelícula, que produce resultados inconsistentes.

El enfoque de la placa de clavija tiene múltiples usos, dependiendo de los datos resultantes deseado. El ensayo se describe aquí como una medición cinética rico en información de la conversión metabólica resazurina en un colorante fluorescente 11. Esta conversión se asocia con un cambio de color de azul a rosa (Figura 2C), que, en additia la lectura de fluorescencia cuantitativa, permite una lectura cualitativa inicial fácil simplemente mediante la observación de la conversión. Después de retirar la tapa de clavija, esta conversión también se puede cuantificar mediante la lectura de la absorbancia a 600 nm debería fluorescencia capacidades no estar disponibles. Aunque la fluorescencia con el tiempo mesetas después de la conversión máxima de colorante en cada pocillo (con supervivientes), la aparición de conversión de colorante podría utilizarse para estimar la población superviviente metabólicamente activa en relación con el control sin tratar (Figura 3). En nuestras manos hemos encontrado que cada retardo min ~ 100 en el inicio de la conversión resazurina corresponde a aproximadamente una disminución de 10 veces en el número de células metabólicamente activas en el inóculo de partida en relación con el control sin tratar (como se determina en cultivo de células planctónicas en serie diluido en incrementos de 10 veces utilizando medio de recuperación de biofilm (datos no mostrados)).

Más allá de las lecturas cinéticas, sin embargo, la placa modificado con PEGmétodo es más susceptible a los proyectos de pantalla de drogas de alto rendimiento que el protocolo original. Mediante la medición de la resazurina conversión como un punto final en lugar de una cinética, un usuario puede generar un análisis binario de las muestras para rastrear la actividad sencilla de los compuestos (es decir, la conversión de colorante / sin conversión), que elimina la necesidad de 24 horas en un lector de placas de fluorescencia , permitiendo incubaciones convencionales. Esta metodología permite para la determinación del biofilm mínimo la erradicación de concentración sin la necesidad de tratamiento con ultrasonidos y de las planchas. La lectura cinética también realiza un seguimiento del estado metabólico de la biopelícula en función de la condición de tratamiento y la concentración de inhibidor. El número reducido de etapas de manipulación, aumento de la reproducibilidad, y el método de lectura cuantitativa (en oposición a chapado en cada pocillo individual 12) permite a los usuarios la pantalla miles de compuestos por día potencialmente en una sola pantalla la concentración. De hecho, las placas de estilo de PEG se han utilizado previamente en dr de alto rendimientopantallas ug de dispersantes biofilm, aunque resazurina (tal como se utiliza aquí) es una opción mucho más económico que el reactivo de luciferasa patentada utilizada 13.

Si bien una mejora general sobre el protocolo existente de un fabricante, el ensayo presentado aquí tiene ciertas limitaciones hay que tener en cuenta. En sí misma, sólo nos estamos midiendo la capacidad metabólica de las células del biofilm-asociado. Este ensayo no mide la masa del biofilm o de otra manera debilitar la arquitectura de las biopelículas o la integridad. no serían detectados necesariamente esos efectos. Metabólicamente inactivos, pero aún viable, persister células, que se han demostrado que existen en biofilms 14,15 también serán detectados. Además, los compuestos que inducen quiescencia sin tener que esterilizar una biopelícula podría aparecer erróneamente como falsos positivos, dependiendo de la duración del estado inducido. indicadores de viabilidad son en última instancia, sustitutos de los métodos de medición más férreas tales como citometría de flujo o CFUenumeración, y el usuario final debe determinar cuál es el método apropiado. Por último, como la conversión resazurina se basa en NADH endógeno, el agotamiento de las reservas intracelulares podría ser perjudicial para las bacterias. Si bien no hemos observado efectos nocivos contra S. aureus, otras especies bacterianas podría reaccionar de manera diferente. Los usuarios deben probar y validar empíricamente este protocolo para la fiabilidad y reproducibilidad señalados organismos diferentes y entornos de laboratorio.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Mueller-Hinton Medium Oxoid CM0405 Follow recommendations of manufacturer
RPMI-medium Corning  17-105-CV
CRPMI Ref 9 RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin Bio Rad 142-2822
MBEC-plates Innovotech 19111
Resazurin Sodium Salt Sigma R7017 800 µg/ml in DI water     Filter sterile
Micro Plate Shaking Platform  Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader Biotek
Gen5 software Biotek Recording and analysis of resazurin conversion
Neocuproine Sigma N1501  prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC
Copper sulfate Acros Organics 7758-99-8 prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC
Cu-Neocuproine Self-Made Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.
Gentamicin Sigma G3632-1G

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References

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Infección No. 111, Biopelícula resazurina la concentración mínima de erradicación de biopelícula el descubrimiento de fármacos neocuproína neocuproína complejo de cobre
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