Summary
Здесь мы показываем , изолированные человеческие тромбоциты могут быть использованы в качестве доступной ех естественных условиях модель для изучения метаболических адаптации в ответ на комплекс I ингибитор ротенон. Этот подход использует изотопный отслеживанию и относительную количественную оценку с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии, и может быть применен к различным дизайнов исследований.
Introduction
Дисфункциональное митохондриальный метаболизм участвует в широком диапазоне заболеваний , в том числе нейродегенерации, рак и сердечно - сосудистые заболевания 30. Таким образом, большое усилие было помещено на характеризующие метаболические дефекты, которые вносят вклад в патогенез заболевания. Жидкостной хроматографии-тандемной масс - спектрометрии (LC-MS / MS) считается золотым стандартом для количественного определения аналитов из сложных биологических матриц и часто используется для метаболических исследований 8. Однако, как это часто бывает с медико-биологических исследований, достижения доступной и четко определенной модели, имеющей отношение к болезни человека является непростой задачей.
Во многих исследованиях на работу трансформировали клеточных моделей для исследования влияния ксенобиотиков или генетических аномалий на клеточный метаболизм 7,9. Метаболический перепрограммирование , что происходит в раковых клетках , можно ввести смешивающих факторов 21 и, следовательно , не идеальны. Эти вопросы могут быть circumvented с моделями первичных клеток, хотя получение достаточной биомассы для метаболических анализов может быть сложной задачей. Кроме того, воздействие высоких количеств антибиотиков , используемых в культуре был выделен как потенциально вмешивающихся митохондриальных исследований 16.
Тромбоциты человека получают возможность использовать модель первичной ячейки с достаточным содержанием митохондриальной для исследования метаболических 5,22,27,32. Во-первых, тромбоциты могут быть легко усваиваются, через кровь рисует от индивидуальных доноров, или в больших объемах из банков крови, и, следовательно, обеспечить модель, в которой внешние факторы, можно легко регулировать. Во- вторых, из - за их небольшого размера, тромбоциты могут быть легко изолированы от других компонентов крови с минимальной подготовительной работы в минимально даже оборудованных лабораториях 5. Следует отметить, что тромбоциты не содержат ядра и, следовательно, могут быть использованы для изучения изменений в обмене веществ независимо от транскрипционной регуляции. Здесь мы покажем, чтов дополнение к относительной квантификации ацил-коэнзим А (CoA) тиоэфиры, изолированная система тромбоцитов может быть использован для изучения метаболизма углерода. В частности, мы сообщили об использовании метаболического мечения с стабильного изотопа (нерадиоактивного) меченого [13 C 6] -глюкозы и [13] C 16 -пальмитат зонд инкорпорации [13 C] -label в важный метаболит ацетил- КоА с помощью гликолиза или окисления жирных кислот. Это обеспечивает мощный, обобщению и универсальную платформу в связи с широким вовлечением видов ацил-CoA в биохимических путей 13,24 и сговорчивости этой системы для тестирования других переменных, таких как ингибирование комплекса I с ротенону 3,33. В дополнение к информации , представленной ниже протокола, обширное описание методов , используемых для маркировки изотопов и для LC-MS на основе анализа можно найти в Басу и Блэр 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика Заявление: Все протоколы, касающиеся обращения образцов человека следовать рекомендациям Университета Пенсильвании комитета по этике человека.
1. Подготовка буферами и 100x маточные растворы
- Готовят 1 л буфера базового Тирода. Комбинат 8,123 г NaCl, 1,428 г NaHCO 3, 0,466 г CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 г KCl и 0,095 г MgCl 2. Отрегулируйте общий объем до 1 л с DDH 2 O. Фильтр стерилизовать буфера базового Тирода.
- Подготовка 100X исходные растворы глюкозы и пальмитиновой кислоты. Для 100x растворов глюкозы, растворяют 100 мг глюкозы или [13 C 6] -глюкозы в 1 мл DDH 2 O. Для 100x пальмитата растворов, растворяют 2,56 мг пальмитиновой кислоты или 2,72 мг [13] С 16 -palmitic кислоты в 1 мл этанола. Фильтр стерилизовать 100X растворы.
- Подготовьте Буферы соответствующие обогащается Тирода
- Для глюкозы исследований маркировки, добавить 1 мл 100х [13 C 6] -глюкозы исходного раствора и 1 мл 100x кислоты исходного раствора пальмитиновой до 98 мл буфера базового Тирода.
- Для исследований пальмитиновой кислоты маркировки, добавляют 1 мл 100x глюкозы маточного раствора и 1 мл [13] С 16 кислоты маточного раствора -palmitic до 98 мл буфера базовой Тирода.
- Готовят 10 мМ исходного раствора ротенону в диметилсульфоксиде (ДМСО).
- Для исследований доза-реакция без маркировки, переходите к 1.4.3. Для изучения маркировки в виде разовой дозы, переходите к 1.4.5.
- Произвести серийное разведение в 10 мМ ротеноном запаса в ДМСО, чтобы получить растворы с концентрацией Ротенон в пределах от 1 нМ до 100 мкМ. Это 100x запасs.
- Добавьте 50 мкл каждого запаса по 5 мл буфера базовой Тирода + глюкоза + пальмитиновой кислоты от версии 1.3.1 для приготовления растворов с концентрацией Ротенон в пределах от 10 пМ до 1 мкМ. В качестве альтернативы, добавить 50 мкл ДМСО, чтобы служить в качестве управления транспортным средством. Перейдите к разделу 2.1.
- Развести 10 мМ маточного раствора в 1000 раз в ДМСО с получением 10 мкМ рабочего раствора.
- Добавьте 50 мкл этого концентрата до 5 мл каждого из буфера базовой Тироде + [13 C 6] -глюкозы + пальмитиновую кислоту из 1.3.2 и базовый буфер Тирода + глюкоза + [13 C 16] -palmitic кислоты из 1.3.3. Конечная концентрация составляет 100 нМ ротенон. В качестве альтернативы, добавить 50 мкл ДМСО для каждого буфера, чтобы служить в качестве управления автомобилем.
2. Изоляция тромбоцитами
Примечание: Этот метод поддается тромбоцитов, полученных из любой цельной крови или из тромбоцитов мешков. Примерные данные, содержащиеся в настоящем документе был подготовлениспользуя тромбоциты, полученные из мешков тромбоцитов. Пожалуйста , смотрите Басу и др. 5 для получения более подробной информации об использовании функции тромбоцитов , выделенных из цельной крови.
- Тромбоциты Выделение из цельной крови
ПРИМЕЧАНИЕ: Если выделения тромбоцитов из мешка тромбоцитов, переходите к 2.2.1.- Центрифуга цельной крови при 175 х г в течение 15 мин без тормозов.
- Передача 1 мл верхней обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) слой в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
- Центрифуга PRP при 400 х г в течение 5 мин.
- Отберите супернатант и перейдите к шагу 3.1 или 3.2.
- Тромбоциты Изоляция от тромбоцитами Bag
- Передача 1 мл суспензии тромбоцитов в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
- Центрифуга суспензии при 400 мкг в течение 5 мин.
- Отберите супернатант и перейти к шагу 3.1. или 3.2.
3. Выполнение эксперимента
- Для определения влияния ксенобиотиковлечение (например, ротенон) на уровнях метаболита интерес (например, ацетил-КоА), переходите к 3.1.1. Для определения влияния ксенобиотика (например., Ротенон) на включение метаболического предшественника в нижней по потоку метаболита интерес, перейти к 3.2.1.
- используя не менее трех биологических повторяет для каждого состояния, ресуспендирования тромбоцитов осадок со стадии 2.1.4 или 2.2.3 в 1 мл каждого раствора со стадии 1.4.4.
- Инкубируйте ресуспендировали тромбоциты в водяной рубашкой СО 2 инкубатор на 95% влажности, 5% CO 2 и 37 ° С в течение 1 часа. Перейдите к шагу 4.1
Примечание: Здесь мы опишем эксперимент ответа от дозы. В качестве альтернативы, эксперимент конечно время может быть сделано, в котором доза была установлена и продолжительность инкубации варьировалось вместо.
- Для определения влияния ксенобиотиков лечения на введении метаболического предшественника в нижней по потоку метаболита интерес.
- Uпоют не менее трех биологических повторностях для каждого условия, ресуспендирования тромбоцитов осадок со стадии 2.1.4 или 2.2.3 в 1мл каждой композиции меченого буфера Тирода со стадии 1.4.6.
- Инкубируйте ресуспендировали тромбоциты в водяной рубашкой СО 2 инкубатор на 95% влажности, 5% CO 2 и 37 ° С в течение 1 часа. Перейдите к шагу 4.1.
4. Тушение и КоА Добыча
- Гранул тромбоциты центрифугированием при 3000 мкг в течение 3 мин.
- Отберите супернатант.
- Ресуспендируют тромбоциты в 750 мкл охлажденного на льду 10% -ной трихлоруксусной кислоты (вес / объем).
- Добавить соответствующий стабильный изотоп-меченых внутренний стандарт. Например, если цель состоит в том, чтобы сравнить уровни видов КоА -редуктазы по образцам, используют 100 мкл смеси стабильных изотопов , меченные CoA тиоэфиров , полученные из дрожжей , как описано ранее (техника Silec) 29.
- Пульс-гомогенат каждый образец в 30 раз с 0,5 сек импульсов.
- Центрифуга образцов при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Наклейте С18 твердофазная экстракция (SPE) столбцы вакуумного коллектора.
- Выдержать колонки с 1 мл метанола.
- Равновесие столбцы с 1 мл DDH 2 O.
- Запуск примера полученный из надосадочной жидкости (приблизительно 850 мкл в данном случае) через колонны.
- Вымойте колонки с 1 мл воды.
- Нагрузка 10 мл стеклянные центрифужные пробирки в вакуумный коллектор для сбора элюции фракции.
- Промывки колонки с 1 мл 25 мМ ацетата аммония в метаноле.
- Сухой элюата под газообразным азотом.
- Ресуспендируют высушенных остатков в 50 мкл 5% (вес / объем) 5-сульфосалициловой кислоты и переносят в ВЭЖХ-флаконах.
Настройка 5. ВЭЖХ
- С помощью программного обеспечения управления для системы ВЭЖХ, создать метод с ВЭЖХ - услови х, оптимизированных для целевых аналитов и используемой колонки, как указано в Таблице 1.
Примечание: В столбце TEMPERATЮр используется для генерации этих данных была 25 ° C, но конкретные параметры будут изменяться в зависимости от инструмента и в отношении соединений, представляющих интерес. Для ацил-СоА - количественному, было зарегистрировано несколько методов анализа LC-MS, и утверждена для различных аналитов в различных условиях LC 14,19,20. - Дайте ВЭЖХ Адекватно Равновесие.
Примечание: Это должно включать в себя как грунтование растворителей перед прикреплением колонку и уравновешивание колонки при исходным растворителем условий для применения метода. Объем уравновешивания должен следовать инструкциям производителя, и в результате чего сточные воды должны быть направлены в отходы.
Примечание: Обратитесь к Басу и Блэра 5 для более подробной информации о параметрах ВЭЖХ.
Установка 6. Масс-спектрометр
- С помощью программного обеспечения управления для масс-спектрометра, создать целевой метод обнаружения ионизированных форм соединений, представляющих интерес. Параметры представленыв таблице 2.
Примечание: Стабильные аналоги изотопов этих соединений следует использовать, чтобы определить, дает ли положительный или отрицательный режим высокую чувствительность и оптимизировать источник и состояние оптики для их обнаружения. Общее время обнаружения метода масс-спектрометр должен соответствовать времени компоненту соответствующего метода ВЭЖХ.
Примечание: Как упоминалось ранее, было зарегистрировано несколько методов анализа ацил-CoA -редуктазы , в том числе положительных 14 и отрицательной ионизации 15 режимов и использованием масс - спектрометра 17 с высокой разрешающей способностью, а не Тройной квадрупольный прибор 28. - Чистый и калибровки прибора, установить прочный аэрозоль в спектрометр, и дать время для калибровочного раствора, чтобы адекватно рассеивать от источника и оптики в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Установите последовательность для всех образцов с программным обеспечением управления масс-спектрометр. Incluде имя или числовые идентификаторы и указать соответствующий объем впрыска и инструмента метода. Запуск пробел перед первой выборки, а также запускать другие заготовки и промывные между образцами по мере необходимости для смягчения переходящие или матричные эффекты.
Примечание: Способ обработки для достижения максимальной интеграции жидких хроматограммах выбранных анализируемых веществ "часто может быть установлен в пределах этой последовательности или впоследствии применяются при обработке данных. - Начните последовательность и контролировать масс-спектрометра и ВЭЖХ системы периодически проблем, включая колебания давления или системных сбоев и потери интенсивности сигнала во время бега.
Примечание: Серьезные проблемы или постоянные сбои Запуск может потребовать остановки прогона и продувка и повторно уравновешивая систему ВЭЖХ, а также очистки и калибровки масс-спектрометра. Consult Басу и Блэр 5 для более подробной информации относительно настроек и обработки данных MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать полезность этой методики мы воспроизвели обобщаемость ранее описанного компенсаторной метаболической адаптации в результате воздействия ротенону. Этот вывод был ранее идентифицирован в моделях клеточных культур, и это исследование было направлено, чтобы проверить, если этот метаболический сдвиг происходит также в тромбоцитах, которые безьядерный и не склонны к тем же экспериментальных артефактов, как культуре клеток. Эта работа была выполнена с 6-дневных тромбоцитов из Пенсильванского Trauma Center, который был сочтен слишком стар для человека вливания, хотя они сохранили свою метаболическую активность. Изоляция была выполнена , как показано на рисунке 1. Общий рабочий процесс может быть легко масштабируется от ограниченного числа клинических образцов или экспериментальных условиях на базе 96-луночный планшет с более высокой пропускной способностью с наличием тромбоцитов, которые более не являются полезными для инфузии в пациентах.
(рисунок 2). В частности , мы наблюдали в SH-SY5Y клеток зависимым от дозы уменьшение сукцинил-КоА (IC 50 = 25 нМ) с одновременным увеличением бета-оксибутирил (HB) -КоА (ED 50 = 75 нМ), в то время как уровни ацетил-CoA остались без изменений 1. Наш анализ человеческих тромбоцитов , обработанных ротенону показали высокую стабильные результаты (рисунок 3). Это обеспечивает уникальный набор экспериментальных данных в человеческих тромбоцитов, указывающих на митохондриальную зависимости ответа на ротенону. Этот ответ не может быть опосредовано через обычные транскрипционные механизмы, поскольку тромбоциты не несут ядер.
Относительное количественное определение обеспечивает одно измерение метаболической информации, ноизотопное мечение оказывает неоценимую дополнительную представление о деятельности конкретных метаболических путей. Это очень важно в метаболических исследованиях, поскольку множественные пути могут сходиться через один промежуточный продукт. Чтобы продемонстрировать это, тромбоциты обрабатывали либо 100 нМ ротенону или ДМСО в присутствии либо [13 С 6] -глюкозы или [13 C 16] -пальмитат в течение 1 часа. Со-вымывание изотопологов ацил-КоА из колонки LC позволяет окончательного определения изотопного состава аналитов (рисунок 4). После поправки на естественный фон обилие тяжелых изотопов , как описано 11 этот подход показал значительное снижение гликолиза производства ацетил-КоА в тромбоцитах в то время как пальмитат инкорпорация была значительно увеличена (рисунок 5). Эти результаты аналогичны тем , которые наблюдались ранее в модели клеточной культуры SH-SY5Y 33 и таким образом , дают дополнительные данные Tшапка этот путь может иметь важное значение в естественных условиях.
| Время (мин) | 0 | 0 | 1.5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| Общий расход (мкл / мин) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % A | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % В | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. Таблица 1. жидкостная хроматография Градиент растворитель А: 5 мМ ацетатом аммония в воде, растворитель В: 5 мМ ацетатом аммония в соотношении 95: 5 ACN растворитель / вода C: 80:20 ACN / вода 0,1% муравьиной кислоты
| параметр | Стоимость |
| Спрей Напряжение (V) | 4000 |
| Испаритель Температура (° C) | 400 |
| Оболочка давление газа | 35 |
| Дополнительное давление газа | 10 |
| Капиллярная Температура (° C) | 350 |
| Труба объектива Смещение (V) | 100 |
Таблица 2. Параметры масс - спектрометре.
Рисунок 1. Обобщенная Workflow для Подготовка проб и анализа. Эта схема отображает рабочий процесс для выделения тромбоцитов и лечения метаболических исследований с помощью анализа LC-MS / MS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Метаболический Схема метаболизма глюкозы и липидов , и цепь электронного транспорта. Ацетил-КоА , могут быть синтезированы из любого глюкозы или пальмитат. Ротенон тормозит надлежащее челночного электронов митохондриального комплекса I.ТПС: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Количественное COA-тиоэфиров в ответ на лечение Ротенон. Ротенон не влияет на уровень ацетил-КоА , но вызывает дозозависимое снижение сукцинил-КоА (IC 50 = 4,1 нМ) с сопутствующим увеличением βHB-КоА (ED 50 = 4,2 нМ). Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего (SEM); п = 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель хроматограммы Показаны изотопной метки из пальмитатв Ацетил-КоА. Лечение Ротенон увеличивает включение пальмитат в ацетил-КоА. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Относительное включение [13 C 6] -глюкозы или [13 C 16] -пальмитат на лечение Ацетил-КоА. Ротенон уменьшает включение глюкозы в ацетил-КоА и увеличивает пальмитата включение. Усы представляют собой SEM; п = 4. Звездочки означают р <(непарный т-тест Стьюдента) 0.05. Пожалуйста , нажмите здесьдля просмотра увеличенной версии этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы показали полезность изолированных тромбоцитов в качестве платформы для изучения возмущенную митохондриальный метаболизм. В частности, мы охарактеризовали метаболические адаптации в ответ на комплексном I ингибирования ротенону.
Настоящее исследование продлила сообщалось ранее выводы о роли комплексного ингибирования I по ротенону в клеточных линий на тромбоцитах человека. Важно отметить, что это показало, что формирование ротенон также ингибирует тромбоцитов сукцинил-КоА, стимулировали увеличение тромбоцитов βHB-КоА и не оказывает влияния на уровень тромбоцитов ацетил-КоА.
Большое внимание должно быть принято, чтобы обеспечить достоверность и воспроизводимость любого анализа этого типа. Если тромбоциты должны быть изолированы от цельной крови, выделение следует действовать точно так, как описано выше, для того, чтобы предотвратить загрязнение лимфоцитов и активацию тромбоцитов, при этом особое внимание, посвященной оставляя поглощающее покрытие, содержащее лимфоциты ЮНДИСщенный. Для того чтобы кривые зависимости ответа от дозы, чтобы иметь смысл, серийные разведения должна быть выполнена точно, при перемешивании до гомогенного состояния на каждом шаге. После того, как тромбоцитарной ресуспензии, условия инкубации могут быть модифицированы с тем, подробно описано выше, но они должны быть строго стандартизированы по группам лечения, что позволит правильно проводить сравнения. Пожалуй, самым важным шагом в любом анализе / МС на основе количественной LC является использование стабильных изотопов, меченных внутренних стандартов.
Использование внутренних стандартов имеет решающее значение в этой ситуации, потому что она защищает от потенциально вмешивающихся "пакетных эффектов, таких как" переменной эффективности экстракции и стабильности аналита через образцов. Добавление внутреннего стандарта, (опять же, смешивание до гомогенности) как можно раньше в протоколе снижает вероятность артефактов. И, наконец, как и в любом эксперименте, использование нескольких реплицируется для каждого условия эксперимента имеет важное значение, и, если это возможно, Расчеты мощности на основе пилотных экспериментов могут быть полезны.
Тромбоциты могут быть быстро изолированы от отдельных или объединенных источников 5,27,32, что делает этот подход поддается широкому кругу приложений. Важно отметить, что возможность выполнения исследований с участием как относительной количественной оценки и изотопной метки позволяет более полной характеристики системы метаболической. В настоящее время, это требует двух отдельных анализов, что увеличивает спрос на биомассы, необходимой для эксперимента. По этой причине, тромбоциты, которые могут быть легко получены в больших количествах, являются более эффективными, чем другие модели клеточных культур.
Тем не менее, несмотря на многочисленные преимущества, даруемые использованием тромбоцитов, существуют недостатки. Во- первых, необходимо соблюдать осторожность при отборе людей - доноров , потому что есть много нарушений , которые влияют на физиологию тромбоцитов 25. Кроме того, активация тромбоцитов в процессе выборкиподготовка и анализ представляет собой потенциальные вмешивающиеся переменные в любой тромбоцитов на основе анализа. По этим причинам, сопутствующее оценка маркеров активации тромбоцитов методом ИФА 26, проточной цитометрии 1 или анализов , таких как анализ света 34 агрегометрия передачи (LTA) может оказаться благоразумным.
Хотя данное исследование было сосредоточено на анализе ацил-CoA тиоэфиров, этот подход может быть легко расширена за счет включения более широкий круг аналитов. Нецелевой подходы метаболомики обеспечивают механистической представление в массив болезненных состояний 23. Применяя такие нецелевые подходы к модели тромбоцитов, вероятно, обеспечит дополнительное понимание лежащих в основе биохимических механизмов, участвующих в дизрегуляции клеточного метаболизма.
Такой подход может быть легко расширена за счет включения в него расследования других экологических химических веществ и препаратов , известных препятствовать митохондриального метаболизма 6,12,18,31, а также система для проверки влияния ксенобиотиков как потенциальных модуляторов СоА метаболизма 10. Кроме того, общий подход может быть применен для изучения дефектов обмена веществ в генетических заболеваний , таких как атаксия Фридрейха 5,32. Кроме того, любой из вышеуказанных экспериментальных конструкций может быть в сочетании с функциональным анализом дыхания , с тем чтобы более надежно охарактеризовать состояние митохондрий в каждом контексте 2. Таким образом, сочетания стабильных изотопов и анализ LC-MS с метаболическими исследований в изолированных тромбоцитов, вероятно, предоставить новые возможности для дальнейшей характеристики аберрантную митохондриальную метаболизм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы признаем поддержку NIH грантов P30ES013508 и T32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
