Summary
여기에서 우리는 고립 된 인간의 혈소판 내가 로테를 억제제 복잡한에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 연구하는 생체 접근으로 모델을 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이 방법은 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 추적 동위 상대적 정량을 채용하고 연구 다양한 디자인을 적용 할 수있다.
Introduction
역기능 미토콘드리아 대사는 신경 변성, 암, 심혈관 질환 (30)을 포함하여 다양한 질환에 연루되어왔다. 따라서, 많은 노력이 질병의 발병에 기여하는 대사 결함을 특성화에 배치되었습니다. 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석 (LC-MS / MS)는 복잡한 생물학적 매트릭스에서 분석의 정량화를위한 황금 표준으로 간주되며 종종 대사 연구 8 사용된다. 종종 인간의 질병과 관련이 접근하고 잘 정의 된 모델을 달성 생물 의학 연구의 경우입니다 그러나, 도전이다.
많은 연구는 세포 대사 7,9에 생체 이물질 또는 유전 적 이상의 영향을 프로빙을위한 세포 모델을 변형 사용한다. 혼란을 도입 할 수 암 세포에서 발생하는 대사 재 프로그래밍 (21) 요인 때문에 적합하지 않습니다. 이러한 문제는 circumve 될 수 있습니다대사 분석에 충분한 미생물을 얻는 것은 어려울 수 있지만, 일차 전지 모델 nted. 또한, 문화에 사용되는 항생제의 많은 양의 영향은 잠재적으로 혼란 미토콘드리아 연구 (16)과 같이 강조하고있다.
인간 혈소판 대사 연구 5,22,27,32 충분한 미토콘드리아 콘텐츠 일차 전지 모델을 이용할 수있는 기회를 제공. 혈액 공여자 개별 또는 혈액 은행에서 대량 흡입되므로 외부 요인 용이하게 제어 할 수있는 모델을 제공 내지 제 혈소판 쉽게 얻을 수있다. 둘째, 그들의 작은 크기 혈소판 용이에도 최소한 갖춘 실험실 5 최소 준비 작업과 다른 혈액 성분으로부터 분리 될 수있다. 참고로, 혈소판 핵을 포함하지 않는 때문에, 독립적으로 전사 조절 대사 변화를 연구하는 데 이용 될 수있다. 여기에 우리가 보여아실 - 조효소 A (COA) 티오 상대 정량 이외에 혈소판 격리 시스템은 탄소 대사를 검토 할 수있다. 특히, 우리는 중요한 대사 물질 아세틸으로 [(13) C] -label의 설립을 조사하기 위해 안정 동위 원소 (비 방사성) 표지 [13 C 6] 글루코스와 [13 C 16] -palmitate과 신진 대사 라벨의 사용을보고 CoA를 해당 작용 또는 지방산 산화를 통한. 이는 생화학 적 경로 13,24에서 아실 CoA를 종의 광범위한 참여와 같은 로테 3,33 복잡한 I의 억제와 같은 다른 변수를 테스트에이 시스템의 취급 용이성에 강력한 일반화하고, 다양한 플랫폼을 제공합니다. 아래의 프로토콜에서 제공하는 정보에 더하여, 동위 원소 표지하고 상기 LC-MS 기반 분석에 사용되는 방법의 광범위한 설명 바수 블레어 4에서 찾아 볼 수있다.
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Protocol
윤리 정책 : 인간의 샘플의 처리에 관한 모든 프로토콜은 대학의 펜실베니아의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따르십시오.
버퍼의 1. 준비 및 100 배 스톡 솔루션
- 기본 타이로드의 버퍼 1 L를 준비합니다. 2 ∙ 2 H 2 O, 0.224 g의 KCl, 및 0.095 g의의 MgCl 2. DDH 2 O.과 1 L에 총 볼륨을 조정 8.123 g의 NaCl, 1.428 g의 수 NaHCO3, 0.466 g의 염화칼슘을 결합 필터는 기본 타이로드의 버퍼를 소독.
- 포도당과 팔 미트 산의 100 배 재고 솔루션을 준비합니다. 100 배 포도당 재고 솔루션의 경우, DDH 2 O 1 ㎖에서 100 mg의 포도당 또는 [13 C 6] 글루코스 공수를 용해 100 배 팔미 테이트 솔루션의 경우, 팔 미트 산의 2.56 mg을 에탄올 1 ㎖에서 [13 C 16] -palmitic 산 2.72 mg의 용해. 필터 100X 원액 살균.
- 적절한 농축 타이로드의 버퍼를 준비합니다
- 포도당 라벨 연구의 경우, 기본 타이로드의 버퍼의 98 ml의 100 배 팔 미트 산 원액 1 100 배 [13 C 6] 글루코스 공수 원액의 mL 및 1 ml에 추가 할 수 있습니다.
- 팔 미트 산 라벨 연구의 경우, 기본 타이로드의 버퍼의 98 ml를 1 ml의 [13 C 16] -palmitic 산 원액 ml의 포도당 원액 100 배의 1을 추가합니다.
- 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 로테의 10 mM 스톡 용액을 준비한다.
- 비 표시 용량 - 반응 시험의 경우, 1.4.3를 진행합니다. 단일 용량에서 라벨 연구의 경우, 1.4.5를 진행합니다.
- 1 nM 내지 100 μM까지 로테 농도와 솔루션을 얻기 위해 DMSO에 10 밀리미터 로테 주식의 일련의 희석을 수행합니다. 이들은 100 배 재고 있습니다에스.
- 오후 10시 1 μM까지 로테 농도와 솔루션을 준비 1.3.1에서 기본 타이로드의 버퍼 + 포도당 + 팔 미트 산 5 ml의 각 주식의 50 μl를 추가합니다. 또한, 차량 제어 역할을 DMSO의 50 μl를 추가합니다. 2.1로 진행합니다.
- 10 μM 작업 용액을 얻었다 DMSO에 10 mM의 스톡 용액을 1000 배로 희석.
- 5 ml의 기본 타이로드의 버퍼 + 각이 주식의 50 μl를 추가합니다 [13 C 6] 글루코스 공수 + 팔 미트 산을 1.3.2에서베이스 타이로드의 버퍼 + 포도당 + [(13) C (16)] 1.3.3에서 -palmitic 산. 최종 농도는 100 나노 로테이다. 또한, 차량 제어 역할을하는 각 버퍼에 DMSO의 50 μl를 추가합니다.
2. 혈소판 분리
참고 :이 방법은 하나 전혈이나 혈소판 가방에서 유래 혈소판 의무가 있습니다. 여기에 포함 된 예제 데이터를 제조 하였다혈소판 가방에서 파생 된 혈소판을 사용. 바수 등의 알을 참조하시기 바랍니다. (5) 전체 혈액에서 분리 된 혈소판을 사용에 대한 자세한 내용은.
- 전체 혈액에서 혈소판 분리
참고 : 혈소판의 가방에서 혈소판을 분리하는 경우, 2.2.1를 진행합니다.- 없이 브레이크와 15 분 동안 175 x g에서 원심 분리기 전혈.
- 전송 상부 혈소판 풍부 혈장 1 ㎖ (PRP)을 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 층을 포함한다.
- 5 분 동안 400 × g으로의 PRP를 원심 분리기.
- 기음 뜨는 및 3.1 또는 3.2 단계로 진행합니다.
- 혈소판 가방에서 혈소판 분리
- 전사 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 혈소판 현탁액 1 ㎖.
- 5 분 동안 400 XG에 현탁액을 원심 분리기.
- 기음 뜨는 및 3.1 단계로 진행합니다. 또는 3.2.
3. 실험 수행
- 생체이의 효과를 결정하기 위해치료 (예를 들어, 로테) 관심의 대사 산물의 수준에 (예를 들어, 아세틸 -CoA), 3.1.1를 진행합니다. 관심의 하류 대사 산물로 대사 전구 물질의 혼입에 생체이 물 (예., 로테)의 효과를 확인하려면 3.2.1를 진행합니다.
- 각 조건에 대해 셋 정도의 생물학적 복제를 사용하지 않고, 단계 1.4.4에서 각 솔루션 1 ml의 단계 2.1.4 또는 2.2.3에서 혈소판 펠렛을 재현 탁.
- 95 % 습도, 5 % CO 2, 1 시간 동안 37 ℃로 설정된 물 재킷 CO 2 인큐베이터에 재현 탁 혈소판 부화. 4.1 단계로 진행
참고 : 여기에 우리는 용량 반응 실험에 대해 설명합니다. 대안 적으로, 시간 경과 실험이 수행 될 수는있는 용량은 고정시키고 인큐베이션 길이 대신 변화시켰다.
- 관심 하류 대사 산물로의 대사 전구체의 혼입에 생체이 치료의 효과를 결정한다.
- 유각 조건에 대한 세 가지 생물학적 복제보다 적은 노래하지, 단계 1.4.6에서 표시 타이로드의 버퍼의 각 제제의 1ml의 단계 2.1.4 또는 2.2.3에서 혈소판 펠렛을 재현 탁.
- 95 % 습도, 5 % CO 2, 1 시간 동안 37 ℃로 설정된 물 재킷 CO 2 인큐베이터에 재현 탁 혈소판 부화. 4.1 단계로 진행합니다.
4. 담금질 및 CoA를 추출
- 3 분 동안 3,000 XG에 원심 분리하여 혈소판 펠렛.
- 기음 뜨는.
- 750 ㎕의 얼음 냉 10 % 트리클로로 아세트산에 재현 탁 혈소판 (W / V).
- 적절한 안정 동위 원소 표지 내부 표준을 추가합니다. 예를 들어, 목표는 샘플을 가로 질러 아실 CoA의 종 수준과 비교 안정 동위체 앞에서 설명한대로 효모에서 얻은 표지 된 CoA 티오 에스테르 (SILEC 기술) (29)의 혼합물 100 μl를 사용하는 것이다.
- 펄스 초음파 처리 각 시료를 0.5 초 펄스 30 번.
- 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 샘플.
- 진공 매니 폴드 C18 고체상 추출 (SPE)를 부착 기둥.
- 1 ml의 메탄올과 열을 조건입니다.
- 1 ML의 DDH 2 O.로 열 평형
- 열을 통해 샘플에서 파생 된 상층 액 (이 경우 약 850 μl를) 실행합니다.
- 1 ml의 물에 열을 씻으십시오.
- 진공 매니 폴드에로드 10 ㎖ 유리 원심 관이 용출 분획을 수집한다.
- 메탄올 중 25 mM의 아세트산 암모늄 1 mL로 컬럼을 용출.
- 질소 가스 하에서 건조 용출액.
- 50 μl의 5 % (w / v)의 5 술포 산에서 건조 잔류를 재현 탁하고 HPLC 바이알로 전송합니다.
5. HPLC 설치
- HPLC를위한 시스템 제어 소프트웨어를 사용하여 표 1에 나열된 바와 같이, 분석 대상 물질과 열 이용에 최적화 HPLC 조건을 생성하는 방법.
참고 : 열 temperat를이러한 데이터의 생성에 사용 URE 25 ℃로했지만, 특정 파라미터는 악기에서 관심의 화합물에 대해 다를 것이다. 아실 CoA를 정량 들면, LC-MS 분석의 여러 가지 방법이보고되어 있고, 서로 다른 LC 조건 14,19,20 다른 분석 물에 대한 검증. - HPLC를 적절하게 평형을 허용합니다.
참고 :이 방법의 시작 용매 조건에서 컬럼의 컬럼과 평형을 연결하기 전에 용매의 양 프라이밍을 포함해야한다. 평형 볼륨은 제조업체의 지시에 따라해야하고, 그 결과 유출 물 낭비 전환해야합니다.
참고 : HPLC 설정에 대한 자세한 내용은 바수와 블레어 (5)를 참조하십시오.
6. 질량 분석기 설치
- 질량 분석 장치에 대한 제어 소프트웨어를 사용하여 관심 화합물의 이온화 된 형태의 검출을위한 타겟을 만드는 방법. 매개 변수되게됩니다표 2인치
주 : 이들 화합물의 안정 동위체 유사체는 양 또는 음의 모드가 우수한 감도를 제공할지 여부를 결정하고 그 검출을위한 소스 및 광학 조건을 최적화하기 위해 사용되어야한다. 질량 분석계에있어서의 총 검출 시간 연관된 HPLC 방법의 시간 성분에 대응한다.
주 : 앞서 언급 된 바와 같이, 아실 CoA를 분석의 다수의 방법은 양극 (14)과 음극 (15)의 이온화 모드 오히려 삼중 사중 악기 (28)보다 고해상도 질량 분석기 (17)의 사용을 포함하여,보고되었다. - 깨끗하고, 악기를 교정 분광계로 안정적인 스프레이를 확립하고, 보정 용액이 적절 소스와 제조업체의 지침에 따라 광학에서 발산하는 시간을 허용합니다.
- 질량 분석기 제어 소프트웨어와 모든 샘플에 대한 순서를 설정합니다. 의 inclu이름이나 숫자 식별자를 해제하고 적절한 주입 볼륨과 악기 방법을 나타냅니다. 첫 번째 샘플 전에 빈을 실행하고 이월 또는 매트릭스 효과를 완화하기 위해 필요에 따라 샘플 사이에 다른 공백 및 세척을 실행합니다.
주 : 선택된 분석 '액체 크로마토 그램의 피크의 통합을위한 처리 방법들은이 시퀀스 내에서 설정되거나 후속 적 데이터 처리에 적용 할 수있다. - 순서를 시작하고 압력 변동 또는 시스템 장애 및 운전 중 신호 강도의 손실을 포함하여 문제를 주기적으로 질량 분석기 및 HPLC 시스템을 모니터링 할 수 있습니다.
주 : 심각한 문제 또는 영구 실행 실패 실행과 퍼지를 중지 요구 및 재 평형화 세척뿐만 아니라 HPLC 시스템 및 질량 분석을 교정 할 수있다. 단말기 설정 및 데이터 처리에 대한 자세한 내용은 바수와 블레어 (5)를 참조하십시오.
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Representative Results
우리가 노출 로테 논에 결과 이전에 설명한 보상 대사 적응의 일반화를 재현 한이 방법의 유용성을 입증합니다. 이 결과는 이전에 세포 배양 모델에서 발견되었으며,이 연구는이 대사 변화도 anuclear과 세포 배양과 같은 실험적 인공물 경향이없는 혈소판 발생하면 테스트하고자 하였다. 그들의 신진 대사 활동을 유지하지만,이 작품은, 인간의 주입을 위해 너무 오래된 것으로 간주되었던 펜 외상 센터, 6 일 된 혈소판을 시행 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이 아이솔레이션 하였다. 총 흐름이 더 이상 환자에게 투여하는 데 유용 혈소판 가용성 96- 웰 플레이트 기반 높은 처리량 임상 견본 또는 실험 조건의 한정된 수로부터 용이하게 확장 될 수있다.
(그림 2)의 억제 결과 가설되는 세포주에서 로테의 질문에 답변 아실 CoA를에 티오 에스테르의 상대 수준의 변화를보고했습니다. 구체적으로 우리는 β 하이드 록시에 동시 증가 SH-SY5Y 세포에서 석시 닐 -CoA (IC 50 = 25 ㎚)의 투여 량 의존성 감소를 관찰 (HB) -CoA (ED 50 = 75 ㎚), 아세틸 -CoA 레벨 동안에 한 변화가 없었다. 로테로 치료 인간의 혈소판 우리의 분석은 매우 일관된 결과 (그림 3) 밝혔다. 이것은 로테에 대한 응답의 미토콘드리아 의존성을 가리키는 인간 혈소판에서 실험 데이터의 고유 한 세트를 제공한다. 혈소판 핵이 부족하기 때문에이 반응은 통상 전사 메커니즘을 통해 중재 될 수 없다.
상대 정량, 대사 하나의 정보 차원을 제공하지만동위 원소 표지는 특정 대사 경로의 활동에 매우 중요한 보완적인 통찰력을 제공합니다. 다중 경로는 단일 중간 통해 수렴 수 있기 때문 대사 연구에서 중요하다. 이 점을 설명하기 위해, 혈소판은 1 시간 동안 하나 [13 C 6] 글루코스 또는 [(13) C (16)] -palmitate의 존재에서 100 나노 미터 로테 또는 DMSO 중 하나를 처리 하였다. 액정 열에서 아실 개의 CoA isotopologues의 공동 용출 분석의 동위 원소 조성 (그림 4)의 최종 결정이 가능합니다. 팔미 혼입 크게 (도 5)이 증가하면서 설명 11 무거운 동위 원소 자연 존재비에 대한 보정 다음이 방법은 혈소판에 아세틸 -CoA의 당분 생산에서 유의 한 감소를 보였다. 이러한 결과는 33 등은 추가적인 증거를 제공 t SH-SY5Y 세포 배양 모델에서 이전에 관찰 된 것과 유사한모자는이 경로는 생체 내에서 중요 할 수 있습니다.
| 시간 (분) | 0 | 0 | 1.5 | (5) | (12) | (17) | (18) | (23) | (25) | (30) |
| 전체 흐름 (μL / 분) | (200) | (200) | (200) | (200) | (200) | (250) | (200) | (200) | (200) | (200) |
| % | 98 | 98 | 98 | (80) | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| %의 B | 이 | 이 | 이 | (20) | (100) | (100) | 0 | 0 | 이 | 이 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | (100) | (100) | 0 | 0 |
. 표 1. 액체 크로마토 그래피 그라데이션 용매 A : 물에 5 mM의 암모늄 아세테이트, 용매 B : 5 ACN / 물 용매 C : 95에 5 mM의 암모늄 아세테이트 80:20 ACN / 물 0.1 % 포름 산
| 매개 변수 | 값 |
| 전압 (V)를 스프레이 | 4,000 |
| 기화기 온도 (° C) | (400) |
| 시스 가스 압력 | (35) |
| 보조 가스 압력 | (10) |
| 모세관 온도 (° C) | (350) |
| 오프셋 튜브 렌즈 (V) | (100) |
표 2. 질량 분광계 매개 변수.
샘플 준비 및 분석을위한 그림 1. 일반화 된 워크 플로우.이 회로도는 LC-MS / MS 분석에 의해 대사 연구를위한 혈소판 격리 및 치료를위한 워크 플로우를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
포도당의 대사도 2 방식 및 지질 대사 및 전자 수송 체인. 아세틸 -CoA 글루코스 팔미 테이트 또는 하나에서 합성 할 수있다. 로테 미토콘드리아 복잡한 I. 의한 전자의 적절한 셔틀 링을 억제TPS : //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
로테. 로테 치료에 대한 응답 그림 3. 정량 CoA를-티오 에스테르의은 (ED를 아세틸 -CoA 수준에 영향을 미칠하지만 βHB-CoA를의 동반 증가 석시 닐 -CoA (IC (50) = 4.1 nm의)에서 용량 의존적 감소를 유도하지 않습니다 50 = 4.2 nm의). 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)을 나타내고; N = 4 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
팔미 테이트에서 동위 원소 라벨보기 그림 4. 대표 크로마토 그램로테 치료 아세틸 -CoA로 팔미 테이트의 결합을 증가로 아세틸 -CoA.. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
아세틸 -CoA. 로테 치료에 [13 C 6] 글루코스 또는 [(13) C (16)] -palmitate 그림 5. 상대 설립은 아세틸 -CoA로 포도당 통합 감소 및 팔 미트 산의 결합을 증가시킨다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다; N = 4 별 P <0.05 (학생의 짝 t 테스트)를 나타낸다. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Discussion
여기에서 우리는 교란 미토콘드리아 대사 연구를위한 플랫폼으로 고립 된 혈소판의 유틸리티를 보여 주었다. 특히, 우리는 로테으로 복잡한 I 억제에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 특징으로하고있다.
본 연구는 인간의 혈소판에 세포 라인에서 로테 논에 의해 복잡한 I 억제의 역할 이전에보고 된 연구 결과를 확장했다. 중요한 것은,이 또한 억제 로테 혈소판 석시 닐 -CoA를 형성 혈소판 βHB 닐 -CoA의 증가를 자극하고 아세틸 -CoA의 혈소판 수준에 영향을 미치지 않는 것이 판명되었다.
큰 관심이 유형의 분석의 유효성 및 재현성을 보장하기 위해주의해야한다. 혈소판은 전혈로부터 분리 될 경우 림프구 오염 및 혈소판 활성화를 방지하기 위해, 전술 한 바와 같이, 상기 분리는 림프구 언 디스 포함 된 버피 코트를 떠나는 전념 특별한주의와 정확하게 진행해야turbed. 용량 반응 곡선은 의미가하기 위해서는, 연속 희석은 각 단계에서 균질 혼합하면서 정확히 수행되어야한다. 혈소판 부유 후, 배양 조건은 위에서 설명 된 것들로부터 변경 될 수 있지만, 엄격하게 될 의미있는 비교를 허용하는 처리 그룹에서 표준화되어야한다. 아마도 모든 정량적 LC / MS 기반 분석에서 가장 중요한 단계는 안정 동위체 표지 내부 표준을 사용하는 것이다.
그러한 변수를 추출 효율 및 샘플에서 분석 안정성 잠재적으로 혼란 "배치 효과"에 대해 보호하기 때문에 내부 표준의 사용은이 설정에 중요하다. 내부 표준 첨가 (다시 균질성에 혼합) 실험 프로토콜에 가능한 빨리하면 생성물의 가능성을 감소시킨다. 모든 실험 마지막으로, 복수의 사용은 각각의 실험 조건은 필수적 대한 복제 및 가능하다면파일럿 실험에 기초하여 전력 계산이 유용 할 수있다.
혈소판 빠르게 광범위한 애플리케이션 의무가이 방식을 개별 또는 풀링 5,27,32 소스로부터 분리 될 수있다. 상대적 정량 및 동위 원소 표지를 모두 포함하는 연구를 수행 할 수있는 기능은 대사 시스템에 대한 포괄적 인 특성을 허용하는 것이 중요하다. 현재,이 실험에 필요한 바이오 매스에 대한 수요를 증가 두 개의 개별 분석을 요구한다. 이 때문에, 용이하게 대량으로 얻을 수있다 혈소판은 다른 세포 배양 모델보다 더 효율적이다.
그러나, 혈소판의 사용에 의해 부여 된 많은 장점에도 불구하고, 문제점이있다. 혈소판 25 생리학에 영향을 미치는 많은 질환이 때문에 우선, 케어 인간 공여자의 선택에주의해야한다. 샘플의 과정 이외에, 혈소판 활성화준비와 분석은 혈소판 기반 분석에서 잠재적 인 교란 변수입니다. 이러한 이유로, ELISA (26) 혈소판 활성화 마커 수반 평가 신중한 증명할 수 등의 광 투과 aggregometry (LTA) 분석으로 34 일 계측법, 또는 유동 분석법.
본 연구는 아실 CoA를 티오 에스테르의 분석에 집중 하였지만,이 방법은 쉽게 분석 물질의 넓은 범위를 포함하도록 확장 될 수있다. 타겟이 불분명 한 대사 체학 접근 방식은 질병 상태 (23)의 배열에 기계적인 통찰력을 제공하고 있습니다. 이러한 타겟이 불분명 한 접근 방법을 적용하면 모델 가능성 조절 이상 세포 대사에 관여하는 기본 생화학 적 메커니즘에 추가 통찰력을 제공 할 것입니다 혈소판합니다.
이 방법은 용이하게 미토콘드리아 대사를 방해하는 것으로 알려진 기타 환경 및 화학 약품의 조사를 포함하도록 확장 될 수 6,12,18,3일뿐만 아니라, 시스템은 CoA를 대사 (10)의 전위 조절제로서 생체 이물질의 영향을 시험한다. 또한, 일반적인 접근은 이러한 프리드리히 실조증 5,32 유전 질환, 대사 결함을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 또한, 상기 실험 디자인의 어떤 더 견고 각 문맥이 미토콘드리아의 상태를 특성화하기 위해 기능적 호흡 분석과 결합 될 수있다. 따라서, 고립 된 혈소판의 대사 연구와 안정 동위 원소 및 LC-MS 분석을 결합하는 것은 더 비정상적인 미토콘드리아 대사의 특성을 새로운 기회를 줄 가능성이있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 NIH 보조금 P30ES013508 및 T32ES019851의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
