Summary
Her viser vi isolerte humane blodplater kan anvendes som en rullestol ex vivo modell for å studere metabolske tilpasninger som reaksjon på det komplekse I-inhibitor rotenon. Denne tilnærmingen benytter isotopisk sporing og relativ kvantifisering ved væske-kromatografi-massespektrometri og kan brukes på en rekke forskjellige studiedesign.
Introduction
Dysfunksjonell mitokondrielle metabolismen har vært implisert i en rekke sykdommer, inkludert nevrodegenerasjon, kreft, kardiovaskulær sykdom og 30. Som sådan har stor innsats er lagt vekt på å karakterisere metabolske defekter som bidrar til sykdom patogenesen. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) er regnet som gullstandarden for kvantifisering av analytter fra komplekse biologiske matriser og er ofte brukt for metabolske studier 8. Imidlertid, som det ofte er tilfelle med biomedisinske studier, å oppnå en tilgjengelig og godt definert modell som er relevante for human sykdom er en utfordring.
Mange studier ansetter transformert cellemodeller for undersøkelser av virkningen av xenobiotics eller genetiske avvik på cellenes stoffskifte 7,9. Den metabolske omprogrammering som oppstår i kreftceller kan innføre forstyrrende faktorer 21 og er derfor ikke ideelt. Disse problemene kan være circumvented med primære cellemodeller, selv om å skaffe tilstrekkelig biomasse til metabolske analyser kan være utfordrende. Videre er effekten av store mengder antibiotika som brukes i kulturen blitt markert som potensielt konfunderende mitokondrielle studier 16.
Humane blodplater, hvilket gir mulighet til å utnytte en primær celle modell med tilstrekkelig mitokondrie-innhold for metaboliske studier 5,22,27,32. Først kan blodplater være lett kjøpt gjennom blod trekker fra individuelle givere, eller i store volumer fra blodbanker, og derfor gi en modell hvor ytre faktorer kan lett kontrolleres. For det andre, på grunn av sin lille størrelse, blodplater kan lett isoleres fra andre blodkomponenter med minimal forberedende arbeid i og med minimalt utstyrte laboratorier 5. Av notatet, blodplater ikke inneholde kjerner og kan derfor brukes til å studere endringer i metabolismen uavhengig av transkripsjonsregulering. Her viser vi ati tillegg til relativ kvantifisering av acyl-koenzym A (CoA) tioestere, kan det isolerte blodplate-systemet bli brukt til å undersøke karbon metabolisme. Spesielt rapporterer vi bruk av metabolsk merking med stabile isotoper (ikke-radioaktive) merket [13 C 6] -glukose og [13 C 16] -palmitate å sondere inkorporering av [13 C] label inn den viktige metabolitten acetyl CoA via glykolyse eller fettsyre oksidasjon. Dette gir en kraftig, generaliseres, og allsidig plattform på grunn av den omfattende involvering av acyl-CoA arter i biokjemiske pathways 13,24 og tractability av dette systemet til å teste andre variabler, for eksempel hemming av komplekse jeg med rotenon 3,33. I tillegg til informasjon gitt i protokollen under kan en omfattende beskrivelse av metodene som brukes for isotop merking og for LC-MS-baserte analyser finnes i Basu og Blair 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle protokoller vedrørende behandling av humane prøver følge retningslinjene i The University of Pennsylvania menneskelige forskningsetisk komité.
1. Utarbeidelse av buffere og 100x Stock Solutions
- Forbered en L base Tyrode buffer. Kombiner 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO3, 0,466 g CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g KCl, og 0,095 g MgCl 2. Juster totale volumet til en L med DDH 2 O. Filter sterilisere basen Tyrode buffer.
- Fremstille 100X stamoppløsninger av glukose og palmitinsyre. For 100x stamløsninger glukose, oppløs 100 mg glukose eller [13C 6] -glukose i 1 ml DDH 2 O. For 100x palmitate løsninger, oppløse 2,56 mg palmitinsyre eller 2,72 mg [13 C 16] -palmitic syre i 1 ml etanol. Filter sterilisere 100x stamløsninger.
- Forbered Passende Beriket Tyrodes Buffere
- For glukose merking studier, tilsett 1 ml av 100 x [13 C 6] -glukose stamløsning og 1 ml av 100 x palmitinsyre stamoppløsning til 98 ml av en base Tyrodes buffer.
- For palmitinsyre merking av studiene, tilsett 1 ml av 100 x glukosestamløsning og 1 ml av [13C 16] -palmitic syre stamoppløsning til 98 ml av en base Tyrodes buffer.
- Forbered en 10 mM stamløsning av rotenon i dimetylsulfoksid (DMSO).
- For ikke-merking dose-responsstudier, fortsett til 1.4.3. For merking studier ved en enkelt dose, fortsett til 1.4.5.
- Utfør en seriell fortynning av 10 mM rotenon lager i DMSO å finne løsninger med rotenon konsentrasjoner fra 1 nM til 100 mikrometer. Dette er 100x lagers.
- Tilsett 50 mL av hver aksje til 5 ml av uedelt Tyrode buffer + glukose + palmitinsyre fra 1.3.1 til å forberede løsninger med rotenon konsentrasjoner fra 22:00 til 1 mikrometer. Alternativt, tilsett 50 ul DMSO for å tjene som en bærerkontroll. Fortsett til 2,1.
- Fortynn 10 mM stamløsning 1000 ganger i DMSO for å oppnå en 10 uM arbeidsløsning.
- Tilsett 50 ul av denne lager til 5 ml hver av basis Tyrodes buffer + [13 C 6] -glukose + palmitinsyre fra 1.3.2 og basis Tyrodes buffer + glukose + [13 C 16] -palmitic syre fra 1.3.3. Sluttkonsentrasjonen er 100 nM rotenon. Alternativt, tilsett 50 ul DMSO til hver buffer for å tjene som bærerkontroller.
2. Blodplate Isolation
Merk: Denne metoden er mottagelig for blodplater avledet fra enten fullblod eller fra plate poser. Eksempeldataene i denne publikasjonen ble forberedtved hjelp av blodplater avledet fra blodplate poser. Vennligst se Basu et al. 5 for mer informasjon om å bruke blodplater isolert fra fullblod.
- Blodplate Isolasjon fra Whole Blood
MERK: Hvis isolere blodplater fra en pose med blodplater, fortsett til 2.2.1.- Sentrifuger helt blod ved 175 x g i 15 min med ingen bremser.
- Overføre 1 ml av det øverste blodplaterike plasma (PRP) lag til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger PRP ved 400 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og fortsett til trinn 3.1 eller 3.2.
- Blodplate Isolasjon fra en blodplate Bag
- Overføre 1 ml av blodplatesuspensjonen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger suspensjonen ved 400 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og fortsett til trinn 3.1. eller 3,2.
3. Utføre et eksperiment
- For å bestemme effekten av xenobiotiskbehandling (f.eks rotenon) på nivåene av en metabolitt av interesse (f.eks acetyl-CoA), fortsett til 3.1.1. For å bestemme effekten av en xenobiotisk (f.eks., Rotenon) for innblanding av en metabolsk forløper inn i en nedstrøms metabolitt av interesse, fortsett til 3.2.1.
- Bruk av ikke mindre enn tre biologiske replikater for hver tilstand, resuspendere plate pellet fra trinn 2.1.4 eller 2.2.3 i 1 ml av hver løsning fra trinn 1.4.4.
- Inkuber resuspenderte blodplater i et med vannkappe CO2 inkubator innstilt på 95% fuktighet, 5% CO2 og 37 ° C i 1 time. Gå videre til trinn 4.1
Merk: Her beskriver vi en dose respons eksperiment. Alternativt kan et tidsforløp eksperiment utføres i hvilken dosen ble fiksert og lengden av inkubasjonen ble variert i stedet.
- For å bestemme effekten av behandling på xenobiotisk inkorporering av en metabolsk forløper inn i en nedstrøms metabolitt av interesse.
- Usynger ikke mindre enn tre biologiske replikater for hver tilstand, resuspendere plate pellet fra trinn 2.1.4 eller 2.2.3 i 1 ml av hver formulering av merket Tyrode buffer fra trinn 1.4.6.
- Inkuber resuspenderte blodplater i et med vannkappe CO2 inkubator innstilt på 95% fuktighet, 5% CO2 og 37 ° C i 1 time. Gå videre til trinn 4.1.
4. Quenching og CoA Extraction
- Pellet blodplater ved sentrifugering ved 3000 x g i 3 min.
- Aspirer supernatant.
- Resuspender blodplater i 750 ul iskald 10% trikloreddiksyre (w / v).
- Legg passende stabile isotop-merket intern standard. For eksempel, hvis målet er å sammenligne nivåene av CoA arter over prøvene, bruker 100 ul av en blanding av stabil-isotop merket CoA tioestere hentet fra gjær som beskrevet tidligere (SILEC teknikk) 29.
- Puls-sonicate hver prøve 30 ganger med 0,5 sek pulser.
- Sentrifuger prøvene ved 16 000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Fest C18 fast-fase ekstraksjon (SPE) kolonner til vakuum manifold.
- Tilstand kolonnene med en ml metanol.
- Stabilisere kolonnene med 1 ml DDH 2 O.
- Kjør sample-avledet supernatant (ca. 850 ul i dette tilfellet) gjennom kolonnene.
- Vask kolonnene med 1 ml vann.
- Last 10 ml glass-sentrifugerør inn i vakuummanifolden for å samle eluering fraksjon.
- Eluere kolonnene med 1 ml 25 mM ammoniumacetat i metanol.
- Tørr eluatet under nitrogengass.
- Resuspender inntørkede rester i 50 pl 5% (vekt / volum) 5-sulfosalisylsyre og overfør til HPLC-ampuller.
5. HPLC Setup
- Bruke kontroll programvare for HPLC-system, lage en metode med HPLC-betingelser optimalisert for de aktuelle analyttene og utnyttes kolonnen, som er oppført i tabell 1.
Merk: Kolonnen Temperature benyttet for generering av disse data var 25 ° C, men de spesifikke parametre vil variere etter instrument og med hensyn til forbindelsene av interesse. For acyl-CoA kvantifisering, har flere metoder for LC-MS analyse er rapportert, og validert for ulike analytter i ulike LC forhold 14,19,20. - La HPLC for å tilstrekkelig Stabil.
Merk: Dette skal omfatte både primingen av løsningsmidler før feste en søyle og ekvilibrering av kolonnen med løsningsmiddelutgangsbetingelser for fremgangsmåten. Likevekt volum må følge produsentens anvisninger, og resulterer avløp skal viderekobles til avfall.
Merk: Se Basu og Blair 5 for flere detaljer om HPLC innstillinger.
6. Mass Spectrometer Setup
- Ved hjelp av kontrollprogramvaren for massespektrometeret, oppretter en målrettet metode for påvisning av ioniserte former av forbindelsene av interesse. Parametere presenteresi tabell 2.
Merk: stabile isotoper analoger av disse forbindelser skal anvendes for å bestemme hvorvidt en positiv eller negativ modus gir overlegen sensitivitet og for å optimalisere kilden og optikk betingelse for deres deteksjon. Den totale tiden for deteksjon massespektrometer metoden bør tilsvare den tid komponenten av den tilhørende HPLC-metoden.
Merk: Som tidligere nevnt, har flere metoder for acyl-CoA-analyse er rapportert, inkludert positive 14 og negative ionisering 15 måter og anvendelse av en høy oppløsning massespektrometer 17 i stedet for en trippel kvadrupol instrument 28. - Rengjør og kalibrere instrumentet, etablere et stabilt spray inn i spektrometer, og gi tid for kalibreringsløsningen å tilstrekkelig spre fra kilden og optikk i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sett opp en sekvens for alle prøvene med massespektrometer kontroll programvare. inkluDe navnet eller numeriske identifikatorer og angi riktig injeksjonsvolum og instrument metode. Kjør en blank før den første prøven, og kjøre andre blanks og vasker mellom prøvene som er nødvendig for å redusere carry eller matrix effekter.
Merk: En behandlingsmetode for topp integrering av utvalgte analytter likvide kromatogrammene kan ofte bli satt i denne sekvensen eller senere brukes i databehandling. - Begynn sekvensen og overvåke massespektrometer og HPLC-systemet jevnlig for problemer, inkludert trykksvingninger eller systemsvikt og tap av signalintensitet under kjøringen.
Merk: Alvorlige problemer eller vedvarende kjøre feil kan kreve å stoppe kjøringen og sletting og re-likevekts HPLC system samt rengjøring og kalibrering av massespektrometer. Consult Basu og Blair 5 for flere detaljer om MS innstillinger og databehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere nytten av denne metodikken vi har gjengitt enes allmenn tidligere beskrevet kompenserende metabolske tilpasninger som følge av eksponering for rotenon. Dette funnet var tidligere identifisert i cellekultur modeller og denne undersøkelsen var rettet for å teste om dette metabolske forskyvning også forekommer i blodplater, som er anuclear og ikke er utsatt for de samme eksperimentelle gjenstander som cellekultur. Dette arbeidet ble utført med seks dager gamle blodplater fra Penn Trauma Center, som hadde vært ansett for gammel for menneskelig infusjon, selv om de beholdt sin metabolske aktivitet. Isoleringen ble utført som vist i figur 1. Det totale arbeidsflyten kan skaleres enkelt fra et begrenset antall kliniske prøver eller forsøksbetingelser til 96-brønns plate basert høyere gjennomstrømning med tilgjengeligheten av blodplater som ikke lenger er nyttige for infusjon i pasienter.
(figur 2). Spesielt har vi observert i SH-SY5Y-celler en doseavhengig reduksjon i succinyl-CoA (IC 50 = 25 nM) med en samtidig økning i β-hydroxybutyryl (HB) -CoA (ED 50 = 75 nM), mens acetyl-CoA-nivåene var uendret 1. Vår analyse av humane blodplater som ble behandlet med rotenon åpenbart svært konsistente resultater (figur 3). Dette tilveiebringer et unikt sett av eksperimentelle data i humane blodplater som peker til den mitokondrielle avhengighet av svaret på rotenon. Dette svaret kan ikke formidles gjennom konvensjonelle transkripsjonsmekanismer fordi blodplater mangler kjerner.
Relativ kvantifisering gir en dimensjon av metabolsk informasjon, menisotop merking gir uvurderlig utfyllende innblikk i aktiviteten av bestemte metabolske veier. Dette er kritisk i metaboliske studier fordi flere baner kan konvergere gjennom en enkelt mellomprodukt. For å demonstrere dette punkt, ble blodplater behandlet med enten 100 nM rotenon eller DMSO i nærvær av enten [13 C 6] -glukose eller [13 C 16] -palmitate i 1 time. Co-eluering av isotopologues av acyl-COA fra LC-kolonnen gir mulighet for endelig bestemmelse av isotopiske sammensetning av analytter (figur 4). Etter korreksjon for den naturlige overflod av tunge isotoper som beskrevet 11 denne tilnærmingen viste en signifikant reduksjon i glykolytisk fremstilling av acetyl-CoA i blodplatene, mens palmitat inkorporering ble øket signifikant (figur 5). Disse resultatene er lik de som ble observert tidligere i SH-SY5Y celle kulturmodell 33 og så gir ytterligere bevis tlue denne veien kan være viktig in vivo.
| Tid (min) | 0 | 0 | 1.5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| Total Flow (mL / min) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % A | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % B | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. Tabell 1. væskekromatografi Gradient løsemiddel A: 5 mM ammoniumacetat i vann, Solvent B: 5 mM ammoniumacetat i 95: 5 ACN / Vann Solvent C: 80:20 ACN / Vann 0,1% maursyre
| Parameter | Verdi |
| Spray Spenning (V) | 4000 |
| Fordamper Temperatur (° C) | 400 |
| Kappe gasstrykk | 35 |
| Hjelpegasstrykk | 10 |
| Capillary Temperatur (° C) | 350 |
| Tube Lens Offset (V) | 100 |
Tabell 2. massespektrometer Parametere.
Figur 1. Generalisert Arbeidsflyt for prøveopparbeidelse og analyse. Dette skjematisk viser arbeidsflyten for blodplate isolasjon og behandling for metabolske studier ved LC-MS / MS-analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Metabolsk Scheme av glukose og lipidmetabolisme og elektrontransportkjeden. Acetyl-CoA kan syntetiseres fra enten glukose eller palmitat. Rotenon hemmer riktig skyt av elektroner ved mitokondrie kompleks I.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kvantifisering av CoA-tioestere i Response til Rotenon. Rotenonbehandling påvirker ikke acetyl-CoA nivåer, men induserer en nedgang doseavhengig i succinyl-CoA (IC 50 = 4,1 nM) med en samtidig økning i βHB-CoA (ED 50 = 4,2 nM). Feilstolpene representerer standardfeil av middelverdien (SEM); n = 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Representant Kromatogrammer Viser Isotop merking fra Palmitatetil acetyl-CoA. Rotenonbehandling øker inkorporering av palmitat til acetyl-CoA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Relativ inkorporering av [13C 6] -glukose eller [13 C 16] -palmitate til acetyl-CoA. Rotenon behandling senker glukose inkorporering i acetyl-CoA og øker palmitat inkorporering. Feilfelt representerer SEM; n = 4. Stjernene betegne p <0,05 (Student uparet t-test). Klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi vist nytten av isolerte blodplater som en plattform for å studere opprørt mitokondrie metabolisme. Nærmere bestemt har vi karakterisert metabolsk tilpasning i respons til kompleks I hemming av rotenon.
Denne studien har forlenget tidligere rapporterte funnene på seg rollen som kompleks I hemming av rotenon i cellelinjer til humane blodplater. Viktigere, og dette viste at rotenon også hemmet blodplate-succinyl-CoA formasjon, stimuleres en økning i blodplate βHB-CoA, og hadde ingen effekt på blodplate nivåene av acetyl-CoA.
Stor forsiktighet må tas for å sikre gyldigheten og reproduserbarhet av alle analyser av denne typen. Når blodplater er for å bli isolert fra fullblod, må isolasjon fortsette nøyaktig som beskrevet ovenfor for å hindre forurensning lymfocytter og blodplateaktivering, med spesiell oppmerksomhet viet til å forlate buffy coat som inneholder lymfocytter Undisforstyrres. For at doseresponskurver for å være meningsfull, må seriefortynninger utføres presist, under blanding til homogenitet ved hvert trinn. Etter resuspensjon blodplater, kan inkuberingsbetingelser endres fra de som er beskrevet ovenfor, men de må være strengt normert på tvers av behandlingsgrupper for å tillate meningsfylte sammenligninger skal gjøres. Kanskje den viktigste trinnet i enhver kvantitativ LC / MS-basert analyse er bruk av stabil-isotopen merket interne standarder.
Bruk av interne standarder er avgjørende i denne innstillingen, fordi det beskytter mot potensielt konfunderende "batch effekter" som variable utvinning effektivitet og analyse stabilitet over prøvene. Tilsetning av den indre standard, (igjen, å blande til homogenitet) så tidlig som mulig i en forsøksprotokoll reduserer potensialet for gjenstander. Til slutt, som i en hvilken som helst eksperiment, ved bruk av multiple replikater for hver eksperimentell tilstand er viktig, og hvis mulig, Styrkeberegning basert på pilotforsøk kan være nyttig.
Blodplater kan raskt isolert fra individuelle eller sammenslåtte kilder 5,27,32, noe som gjør denne tilnærmingen mottagelig for et bredt spekter av applikasjoner. Det er viktig å bemerke at evnen til å utføre studier som involverer både relativ kvantifisering og isotopisk merking gjør det mulig for en mer omfattende karakterisering av et metabolske system. Foreløpig krever dette to separate analyser, noe som øker etterspørselen etter biomasse kreves for forsøket. Av denne grunn, blodplater, noe som lett kan fremstilles i stort antall, er mer effektive enn andre cellekulturmodeller.
Imidlertid, til tross for de mange fordeler som er tillagt ved bruk av blodplater, er det ulemper. For det første må man være forsiktig ved valg av humane donorer, fordi det er mange lidelser som påvirker blodplate fysiologi 25. I tillegg er blodplateaktivering i løpet av prøvenforberedelse og analyse er en potensiell forvirrende variabel i en hvilken som helst blodplate-baserte analysen. Av disse grunner, samtidig vurdering av markører for blodplateaktivering ved hjelp av ELISA 26, flowcytometri en eller assays slik som de lystransmisjon aggregometry (LTA) assay 34 kunne vise seg å være forsvarlig.
Selv om foreliggende studie har fokusert på analyse av acyl-CoA tioestere, kan denne tilnærmingen kan lett utvides til å omfatte et bredere spekter av analytter. Uønskede metabolomics tilnærminger leverer mekanistisk innsikt i en rekke sykdomstilstander 23. Bruk av slike uønskede tilnærminger til plate modeller vil trolig gi større innsikt i de underliggende biokjemiske mekanismene som er involvert i feilregulert cellenes stoffskifte.
Denne tilnærmingen kan lett utvides til å omfatte undersøkelser av andre miljø kjemikalier og legemidler kjent for å påvirke mitokondrie metabolisme 6,12,18,31, så vel som et system for å teste effekten av xenobiotika som potensielle modulatorer av metabolisme CoA-10. I tillegg kan den generelle metode bli anvendt for å studere metabolske defekter i genetiske sykdommer som Friedreichs ataksi 5,32. Videre er noen av de nevnte eksperimentelle design kan være kombinert med en funksjonell åndedrett assay for mer robuste karakterisere tilstanden til mitokondrier i hvert sammenheng 2. Således kobling av stabile isotoper og LC-MS-analyse med metabolske studier i isolerte blodplater er egnet til å gi nye muligheter for ytterligere å karakterisere avvik mitokondrie metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi erkjenner støtte fra NIH tilskudd P30ES013508 og T32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
