Summary
Burada izole edilmiş insan trombosit Ben rotenone inhibitör kompleksi cevaben metabolik uyarlamalar incelemek için ex vivo olarak erişilebilir bir şekilde modeli kullanılabilir göstermektedir. Bu yaklaşım, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile izotopik izleme ve nispi miktarını kullanır ve çalışma düzeni, çeşitli uygulanabilir.
Introduction
Fonksiyonel mitokondriyal metabolizma nörodejenerasyonu, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar 30 dahil olmak üzere hastalıkların geniş bir implike edilmiştir. Bu nedenle, büyük çaba hastalık patogenezinde katkıda metabolik kusurları karakterize konulmuş. Sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) kompleks biyolojik matrisler analitlerin miktar altın standart olarak kabul edilir ve genellikle metabolik çalışmalar 8 için kullanılmaktadır. Genellikle insan hastalığı ile ilgili erişilebilir ve iyi tanımlanmış bir model elde biyomedikal çalışmalarda durumda, Ancak, bir meydan okumadır.
Birçok çalışma hücre metabolizması 7,9 tarihinde ksenobiyotikler veya genetik anormalliklerin etkisini sondalama için hücresel modeller dönüştürdü çalıştırırız. Kafa karıştırıcı tanıtabilirsiniz kanser hücrelerinde meydana metabolik yeniden programlama 21 faktörleri ve bu nedenle ideal değildir. Bu sorunlar, circumve olabilirMetabolik analizler için yeterli biyokütle elde zor olabilir, ancak birincil hücre modelleri ile nted. Dahası, kültürde kullanılan antibiyotiklere yüksek miktarda etkisi potansiyel karıştırıcı mitokondriyal çalışmalar 16 olarak vurgulanmıştır.
İnsan trombosit metabolik çalışmalar 5,22,27,32 için yeterli mitokondriyal içeriğe sahip bir birincil hücre modeli kullanmak için fırsat tanıyacaktır. Kan bireysel donörden ya da kan bankalarından büyük hacimlerde çizer ve bu nedenle dış etkenler kolayca kontrol edilebileceği bir model üzerinden ilk, trombositler kolayca elde edilebilir. İkincisi, nedeniyle küçük boyutu, trombositler bile kolayca minimal donanımlı laboratuvarlarda 5 minimal hazırlık çalışmaları ile diğer kan bileşenleri izole edilebilir. Unutmayın ki, trombositler çekirdekleri içermez ve bu nedenle bağımsız transkripsiyonel düzenleme metabolizması değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Burada olduğunu göstermektedirasil-koenzim A (CoA) tiyoesterleri rölatif ölçümü ek olarak, izole edilmiş trombosit sistemi karbon metabolizması incelemek için kullanılabilir. Özellikle, önemli metaboliti asetil- içine [13 C] -Label birleşmesini prob kararlı izotop (radyoaktif olmayan) etiketli [13 C 6] -glükoz ve [13 ° C 16] -palmitat içerebilir ile metabolik etiketleme kullandığını rapor KoA glikoliz veya yağ asidi oksidasyonu yoluyla. Bu durum biyokimyasal yollar 13,24 asil-KoA türlerinin yaygın tutulumu ve bu rotenone 3,33 karmaşık I inhibisyonu gibi diğer değişkenler, test için bu sistemin tractability bir, güçlü genellenebilir ve çok yönlü bir platform sağlar. Aşağıdaki Protokolde verilen bilgilere ek olarak, izotop etiketleme ve LC-MS-tabanlı analizler için kullanılan yöntemlerin geniş bir açıklama Basu ve Blair 4 bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: İnsan örneklerin tedavisi ile ilgili tüm protokoller Üniversitesi'nin Pennsylvania insan araştırma etik komitesinin yönergeleri izleyin.
Tamponlar 1. Hazırlık ve 100x Stok Çözümleri
- Baz Tyrode tampon 1 L hazırlayın. 2 ∙ 2 H 2 O, 0.224 gr KCl ve 0.095 gr MgCl 2. GKD 2 O. ile 1 L toplam ses seviyesini ayarlayın 8,123 gr NaCl, 1,428 gr NaHCO 3, 0.466 gr CaCl birleştirin Filtre tabanı Tyrode tampon sterilize edin.
- Glukoz ve palmitik asit 100x stok çözelti hazırlayın. 100x glukoz stok çözeltileri için, GKD 2 O 1 ml 100 mg glikoz veya [13 C sıcaklıkta 6] -glükoz çözülür 100 x palmitat çözeltiler için, palmitik asit, 2.56 mg veya etanol içinde 1 ml [13 C 16] -palmitic asit 2.72 mg çözülür. Filtre 100x stok çözümleri sterilize edin.
- Uygun Zenginleştirilmiş Tyrode Tamponlar hazırlayın
- Glukoz markalama çalışmaları için, nokta Tyrode tamponu 98 ml 100x palmitik asit stok çözeltisi 1 100x [13C 6] -glükoz stok çözeltisi ve 1 ml ilave edin.
- Palmitik asit etiketleme çalışmaları için, baz Tyrode tampon 98 ml 1 ml [13 C 16] -palmitic asit stok solüsyonu glikoz stok solüsyonu 100x ve 1 ekleyin.
- dimetil sülfoksit (DMSO) içinde rotenone bir 10 mM stok çözelti hazırlayın.
- olmayan etiketleme doz-yanıt çalışmaları için, 1.4.3'ün geçin. tek bir dozda, markalama çalışmaları için, 1.4.5 geçin.
- 1 nM ila 100 uM arasında değişen rotenon konsantrasyonlarına sahip çözeltiler elde etmek için, DMSO içinde 10 mM rotenon stokunun seri seyreltme gerçekleştirin. Bunlar 100x stok vardırs.
- 10 pM 1 uM arasında değişen rotenon konsantrasyonlarına sahip çözeltiler hazırlamak için 1.3.1 baz Tyrode tampon + glikoz + palmitik asit, 5 ml her stokunun 50 ul ekle. Seçenek olarak ise, bir taşıt kontrol olarak hizmet etmek üzere, DMSO, 50 ul ekle. 2.1 geçin.
- 10 uM çalışma çözelti elde etmek için, DMSO içinde 10 mM stok çözeltisi, 1000 kat seyreltilir.
- 5 ml baz Tyrode tampon + her birine bu stokunun 50 ul ekleyin [13 C 6] -glükoz + palmitik asit 1.3.2 den ve baz Tyrode tampon + glikoz + [13 C 16] 1.3.3 den -palmitic asittir. nihai konsantrasyon 100 nM rotenon olup. Seçenek olarak ise, aracın kontrol olarak hizmet etmek için her bir tampon DMSO 50 ul ekle.
2. Trombosit İzolasyon
Not: Bu yöntem, ya tam kan ya da trombosit torbalar elde edilen trombosit ile uyumludur. Burada yer alan Örnek veriler elde edilmiştirtrombosit torba türetilen tabakalar kullanılarak. Basu ve ark bakın. 5 tam kandan izole edilen tabakalar kullanılarak ilgili daha ayrıntılı bilgi için.
- Tüm Kandan Trombosit İzolasyon
NOT: trombositlerin bir çanta plateletler izole ise, 2.2.1 geçin.- Resim frenli 15 dakika boyunca 175 x g'de santrifüje tam kan.
- Aktarım, üst platelet bakımından zengin plazmanın 1 mi (PRP), 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne tabaka.
- 5 dakika boyunca 400 x g PRP santrifüjleyin.
- Süpernatant aspire ve 3.1 veya 3.2 adıma geçin.
- Bir Trombosit Çanta Trombosit İzolasyon
- Aktarım 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne trombosit süspansiyonu 1 mi.
- 5 dakika boyunca 400 x g'de süspansiyon santrifüj.
- Süpernatant aspire ve 3.1 adıma geçin. veya 3.2.
3. Deneme Sahne
- ksenobiyotik etkisini belirlemek içinTedavi (örneğin, rotenone) ilgi metaboliti düzeyleri (örneğin, asetil-CoA), 3.1.1 geçin. Ilgi aşağı metaboliti içine metabolik habercisi katılması üzerine bir ksenobiyotik (örn., Rotenone) etkisini belirlemek için, 3.2.1 geçin.
- Her bir durum için en az üç biyolojik çoğaltır kullanılarak, Aşama 1.4.4 her solüsyonun 1 ml Aşama 2.1.4 ya 2.2.3 arasında trombosit topağı yeniden süspanse edin.
- % 95 nem,% 5 CO2 ve 1 saat 37 ° C'de ayarlanmış bir su ceketli CO2 inkübatör içinde yeniden süspansiyon haline trombositler inkübe edin. 4.1 adıma geçin
Not: Burada bir doz tepki deneyi açıklar. Seçenek olarak ise, zamana yayılmış bir deneyi yapılabilir olan doz tespit edildi ve inkübasyon süresi yerine, farklı.
- ilgi aşağı metaboliti içine metabolik habercisi katılması üzerine ksenobiyotik tedavinin etkisini belirlemek amacıyla.
- UHer bir durum için, üç biyolojik çoğaltır daha az şarkı, Aşama 1.4.6 etiketli Tyrode tamponu Her formülasyon 1 ml Aşama 2.1.4 ya 2.2.3 arasında trombosit topağı yeniden süspanse edin.
- % 95 nem,% 5 CO2 ve 1 saat 37 ° C'de ayarlanmış bir su ceketli CO2 inkübatör içinde yeniden süspansiyon haline trombositler inkübe edin. 4.1 adıma geçin.
4. Söndürme ve CoA Ekstraksiyon
- 3 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüjleme ile trombositleri peletleştirmek.
- Süpernatant aspire.
- 750 ul buz gibi soğuk% 10 trikloroasetik asit içinde yeniden süspanse plakalar (a / h).
- Uygun kararlı izotop etiketli dahili standart ekleyin. Örneğin, bir hedef, örnekleri arasında CoA türlerinin düzeylerinin karşılaştırılması kararlı izotop, daha önce tarif edildiği gibi, mayadan elde edilen etiketli CoA tiyoesterler (SILEC tekniği) 29 içeren bir karışım, 100 ul kullanmaktır.
- Darbe sonikasyon her bir numune 0.5 sn darbeleri ile 30 kat.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüj örnekleri.
- Vakum manifolduna C18 katı faz ekstraksiyon (SPE) sütunları yapıştırın.
- 1 ml metanol ile sütun hale getirin.
- 1 ml GKD 2 O. ile sütun dengelenmesi
- kolonları boyunca Örnek türetilmiş süpernatan (bu durumda, yaklaşık 850 ul) çalıştırın.
- 1 ml su ile sütun yıkayın.
- Vakum manifoldu içine yük 10 ml'lik cam santrifüj tüplerine elüsyon fraksiyonu toplamak için.
- metanol içinde 25 mM amonyum asetat, 1 ml sütun yıkayın.
- azot gazı altında kuru eluat.
- 50 ul% 5 (a / h) 5-sülfosalisilik asit kurutulmuştur artıkları yeniden süspanse edin ve HPLC şişelere aktarılır.
5. HPLC Kurulumu
- HPLC sistemi için kontrol yazılımı kullanarak, Tablo 1 'de gösterildiği gibi, hedef analitleri ve kullanılan sütun için optimize HPLC koşulları ile bir yöntem oluşturur.
Not: Sütun temperatBu verilerin üretilmesi için kullanılan ure 25 ° C idi ancak belirli parametreler cihaz tarafından ve ilgi bileşiklerle ilgili olarak değişecektir. Asil-CoA nicelendirilmesi için, LC-MS analizi birden çok yöntem rapor edilmiştir ve farklı LC koşulları 14,19,20 farklı analitler için doğrulandı. - HPLC Yeterli dengelenmesi için izin verin.
Not: Bu yöntem için başlangıç çözücü koşullarda sütunun bir sütun ve dengeleme takmadan önce çözücülerin hem hazırlanmasını içermelidir. dengeleme hacmi üreticinin yönergeleri takip etmeli ve ortaya çıkan atık atık aktarılmalıdır.
Not: HPLC ayarları ile ilgili daha fazla bilgi için Basu ve Blair 5 danışın.
6. Kütle Spektrometre Kurulumu
- kütle spektrometresi için kontrol yazılımı kullanarak, ilgi konusu bileşiklerin iyonlaştınlmış formlan saptanması için bir hedef bir yöntem oluşturur. Parametreler sunulmaktadırTablo 2'de.
Not: Bu bileşiklerin izotop analogları, pozitif veya negatif mod, üstün hassasiyet olup olmadığını belirlemektir ve algılama için kaynak ve optik durumunu optimize etmek için kullanılır. Kütle spektrometresi yöntemi toplam algılama zaman bağlantılı HPLC yöntemi zaman bileşenine karşılık gelmelidir.
Not: Daha önce belirtildiği gibi, asil-CoA analiz birden çok yöntem pozitif 14 ve negatif iyonizasyon 15 modları ve yerine bir üçlü dört alet 28 daha yüksek çözünürlük kütle spektrometresi 17 kullanımı dahil olmak üzere, bildirilmiştir. - Temiz ve, enstrüman kalibre spektrometre içine istikrarlı bir sprey kurmak ve kalibrasyon çözüm yeterli kaynak ve üreticinin talimatlarına göre optik den dağıtmak için zaman tanıyın.
- kütle spektrometre kontrol yazılımı ile tüm örnekler için bir dizi ayarlayın. incluadını veya sayısal tanımlayıcılar de ve uygun enjeksiyon hacmi ve enstrüman yöntemini gösterir. İlk örnek önce boş çalıştırın ve taşınmasını veya matris etkilerini azaltmak için gerektiği gibi örnekler arasında diğer boşlukları ve yıkar çalıştırın.
Not: Seçilen analitlerin likit kromatogram tepe entegrasyonu için bir işleme yöntemi, genellikle bu sekans içinde yer alan ya da daha sonra veri işleme uygulanabilir. - dizisi başlatır ve basınç dalgalanmaları veya sistem arızaları ve çalışma sırasında sinyal yoğunluğu kaybı gibi sorunlara yönelik periyodik kütle spektrometresi ve HPLC sistemi izlemek.
Not: Şiddetli sorunlar ya da kalıcı çalışma hataları çalıştırmak ve tasfiye durdurma gerektirmeyen ve yeniden dengeleme temizlik yanı sıra HPLC sistemi ve kütle spektrometresi kalibre edilebilir. MS ayarları ve veri işleme konusunda daha fazla bilgi için Basu ve Blair 5 danışın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz maruz kalma rotenone elde edilen daha önce açıklanan telafi metabolik adaptasyon genellenebilirliğini yeniden var bu metodolojinin yararını gösteren. Bu bulgu, daha önce hücre kültürü modelleri tespit edilmiştir ve bu soruşturmanın bu metabolik vardiya da nukleussuz ve hücre kültürü aynı deneysel eserler eğilimli değildir trombositler oluşursa test etmek amaçlanmıştır. onların metabolik aktiviteyi muhafaza rağmen bu eser, insan infüzyon için çok eski sayılır olmuştu Penn Travma Merkezi, 6 gün eski trombositler ile gerçekleştirildi. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, yalıtım yapıldı. Toplam iş akışı artık hastalara enfüzyonu için yararlı olan platelet durumu ile 96 oyuklu plaka bazlı daha yüksek verim klinik numune veya deneysel koşullar, sınırlı sayıda kolayca ölçeklendirilebilir.
(Şekil 2) inhibisyonu kaynaklandığı varsayılmaktadır hücre hatlarında rotenone yanıt olarak asil-CoA tiyoesterleri göreli düzeylerindeki değişiklikleri rapor etmiştir. Özellikle Bu β-hidroksibutiril eşzamanlı bir artışla, SH-SY5Y hücrelerindeki süksinil-CoA (IC50 = 25 nM) ve doza bağlı bir azalmayı gözlemledik (HB) -CoA (ED50 = 75 nM), asetil-CoA seviyesinde ise 1 değişmemiştir. Rotenone ile muamele edilmiş insan trombosit Yaptığımız analizde son derece tutarlı sonuçlar (Şekil 3) saptandı. Bu rotenone cevabın mitokondriyal bağımlılığı işaret insan trombositler deneysel verilerin benzersiz bir kümesi sağlar. Trombositler çekirdekleri eksikliği için bu yanıtı, geleneksel kopyalama mekanizmalar yoluyla aracılık edilemez.
Bağıl miktar, metabolik bilgilerin bir boyutunu sağlar, ancakizotop etiketleme özel metabolik yolların faaliyet içine değerli tamamlayıcı bilgiler sağlar. Birden çok yollar tek bir ara ile birleşir, çünkü bu metabolik çalışmalar önemlidir. Bu noktayı göstermek için, trombositler, 1 saat boyunca da [13C 6] -glükoz veya [13 C 16] -palmitat içerebilir varlığında 100 nM rotenone veya DMSO ile işlemden geçirildi. LC sütunundan asil-CoAlar bölgesinin izotopologlarının eş elüsyon analitlerin izotopik kompozisyonu (Şekil 4) kesin belirlenmesine izin verir. Palmitat kuruluş anlamlı (Şekil 5) artış gözlenirken açıklanan 11 gibi ağır izotopların doğal bolluğu için aşağıdaki düzeltmeler bu yaklaşım trombositlerin asetil-CoA glikolitik üretiminde önemli bir düşüş gösterdi. Bu bulgular, 33 ve bu nedenle ek bir kanıt t sağlamak SH-SY5Y hücre kültür modelinde, daha önce gözlenen benzerşapka bu yolun in vivo önemli olabilir.
| Süresi (dak) | 0 | 0 | 1.5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| Toplam Akışı (ul / dak) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % A | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % B | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % Cı | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. Tablo 1. Sıvı Kromatografi Gradyan Çözücü A: Su içinde 5 mM amonyum asetat, Çözücü B: 5 ACN / su çözücü: C: 95 5 mM amonyum asetat 80:20 ACN / su% 0.1 formik asit
| Parametre | değer |
| Gerilim (V) Sprey | 4.000 |
| Buharlaştırıcı Sıcaklık (° C) | 400 |
| Kılıf Gaz Basınç | 35 |
| Yardımcı Gaz Basıncı | 10 |
| Kılcal Sıcaklık (° C) | 350 |
| Ofset Tüp Lens (V) | 100 |
Tablo 2. Kütle Spektrometre Parametreleri.
Numune Hazırlama ve Analiz Şekil 1. Genelleştirilmiş İş Akışı. Bu şematik LC-MS / MS analizi ile metabolik çalışmalar için trombosit izolasyon ve tedavi için iş akışını göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Glukoz Şekil 2. Metabolik Şema ve Lipid Metabolizması ve elektron taşıma zinciri. Asetil-CoA glukoz veya palmitat ya sentezlenebilir. Rotenone mitokondriyal kompleks I tarafından elektronların doğru mekik inhibetps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Rotenone. Rotenone tedaviye yanıt olarak Şekil 3. kantitasyonu CoA tiyoesterlere (ED asetil-CoA seviyelerini etkileyen ancak βHB-CoA eşlik eden bir artış ile süksinil-CoA (IC50 = 4.1 nM) bir doza bağlı azalmayı indükler etmez 50 = 4.2 nM) kullanılmıştır. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder; n = 4 , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Palmitate gelen İzotop Etiketleme gösteren Şekil 4. Temsilcisi KromatogramlarRotenon tedavi asetil-CoA içine palmitat katılmasını artırır içine Asetil-CoA.. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Asetil-CoA. Rotenon tedaviye [13 C 6] -glükoz veya [13 ° C 16] -palmitat içerebilir Şekil 5. Bağıl Ortaklığın asetil-CoA içine glikoz birleşmesini azaltır ve palmitat birleşme artırır. Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir; n = 4 Yıldız p <0.05 (Öğrenci eşleştirilmemiş t-testi) ifade etmektedir. tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tedirgin mitokondriyal metabolizmayı incelemek için bir platform olarak izole trombosit yarar göstermiştir. Özellikle, rotenone kompleks I inhibisyonu cevaben metabolik adaptasyon özelliği var.
Bu çalışmada, insan trombositleri hücre hatlarında rotenone karmaşık bir önlenmesindeki rolünü daha önce bildirilen bulgular genişletmiştir. Daha da önemlisi, bu rotenon da inhibe trombosit süksinil-CoA oluşumu, trombosit βHB-CoA bir artışını ve asetil-CoA'nın trombosit seviyeleri üzerinde hiçbir etkiye sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır.
Büyük bir dikkatle bu tip herhangi bir analizin geçerliliği ve tekrarlanabilirlik sağlamak için alınmalıdır. Trombositler tam kandan izole edilmesi için ise lenfosit kontaminasyonu ve trombosit aktivasyonunu önlemek amacıyla yukarıda açıklandığı gibi, izolasyon lenfositler undis içeren buffy coat bırakarak ayrılmış özel dikkat, tam devam etmelidirbozulmuştur. Doz tepki eğrileri, anlamlı olması için, seri seyreltileri, her adımda homojen karıştırma ile, tam olarak gerçekleştirilmelidir. trombosit yeniden süspansiyon işleminden sonra, inkübasyon koşulları yukarıda ayrıntılı olarak modifiye edilebilir, ancak sıkı yapılabilir anlamlı karşılaştırmalar için izin vermek için, tedavi grupları arasında standardize edilmelidir. Belki de herhangi bir nicel LC / MS tabanlı analizinde en önemli adım kararlı izotop etiketli dahili standartların kullanılmasıdır.
Böyle değişken ekstraksiyon verimleri ve örnekler arasında analit istikrar gibi potansiyel karıştırıcı "toplu etkilerine" karşı korur çünkü iç standartların kullanımı bu ortamda önemlidir. iç standart eklenmesi (tekrar, homojen olana kadar karıştırma), bir deney protokolünde mümkün olduğu kadar erken eserler potansiyelini azaltır. herhangi bir deneyde olduğu gibi, son olarak, birden fazla kullanımı, her deney durumu için temeldir çoğaltır, ve mümkünsePilot deneyler dayalı güç hesaplamaları yararlı olabilir.
Trombositler hızlı geniş bir uygulama aralığı için müsait bu yaklaşımı hale tek tek ya da bir araya getirilmiş kaynaklardan 5,27,32 izole edilebilir. Göreceli miktarının ve izotopik etiketleme hem ilgili çalışmalar yapmak yetenek metabolik sistemin daha kapsamlı karakterizasyonu için izin verdiğini dikkat etmek önemlidir. Şu anda, bu deney için gerekli olan biyokütle talebi artırır iki ayrı deneyleri, talep eder. Bu nedenle, hali hazırda büyük sayıda elde edilebilir trombositler, diğer hücre kültürü modelleri daha verimlidir.
Bununla birlikte, trombositlerin kullanımı ile sağlanan bir çok avantajlara rağmen, dezavantajları vardır. Trombosit fizyolojisini 25 etkileyen birçok bozukluklar vardır çünkü Birincisi, bakım, insan donör seçiminde dikkate alınmalıdır. Numunenin sırasında ek olarak, trombosit etkinleştirmehazırlanması ve analiz bir trombosit bazlı bir deneyde, bir potansiyel şaşırtıcı bir değişkendir. Bu nedenlerden dolayı, ELISA 26 ile trombosit aktivasyonu belirteçlerinin birlikte değerlendirilmesi, ihtiyatlı olabilecek bu tür ışık geçirgenliği aggregometri (LTA) tahlil 34 olarak sitometri 1 ya da deneyleri akış.
Bu çalışmada açil-KoA tiyoesterlere analizi odaklanmış olsa da, bu yaklaşım kolayca analit daha geniş bir yelpazede yer alıyor şekilde genişletilebilir. Hedefsiz metabolomik yaklaşımları hastalık hallerinin 23 bir diziye mekanik fikir sağlıyor. Böyle hedefsiz yaklaşımları uygulamak modelleri muhtemelen düzensiz hücre metabolizmasında rol altta yatan biyokimyasal mekanizmaların içine ilave fikir verecektir Platelet için.
Bu yaklaşım kolayca mitokondriyal metabolizması ile müdahale ettiği bilinen diğer çevresel kimyasallar ve ilaç araştırmaları kapsayacak şekilde genişletilebilir 6,12,18,31 hem de bir sistem CoA metabolizma 10 potansiyel modülatörleri olarak ksenobiyotiklerin etkisini test etmek. Buna ek olarak, genel yaklaşım, Friedreich ataksi 5,32 olarak genetik hastalıklar metabolik kusurları incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, söz konusu deney tasarımları daha fazla sağlam her bağlamda 2 mitokondri durumunu karakterize etmek için işlevsel bir solunum testi ile bağlanabilir. Bu nedenle izole edilmiş parçacıklar metabolik çalışmalar kararlı izotoplar ve LC-MS analizleri bağlanması daha olarak anormal mitokondriyal metabolizma karakterize etmek için yeni fırsatlar elde muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim.
Acknowledgments
Biz NIH hibe P30ES013508 ve T32ES019851 desteğini kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
