Summary
Ici , nous montrons les plaquettes humaines isolées peuvent être utilisées comme accessibles modèle ex vivo pour étudier les adaptations métaboliques en réponse au complexe I inhibiteur de la roténone. Cette approche utilise le traçage isotopique et la quantification relative par spectrométrie de masse Chromatographie en phase liquide, et peut être appliquée à une variété de modèles d'étude.
Introduction
Le métabolisme mitochondrial dysfonctionnelle a été impliquée dans un large éventail de maladies , y compris la neurodégénérescence, le cancer et les maladies cardiovasculaires 30. En tant que tel, un grand effort a été mis sur la caractérisation des défauts métaboliques qui contribuent à la pathogenèse de la maladie. Chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS / MS) est considéré comme l'étalon-or pour la quantification des analytes de matrices biologiques complexes et est souvent utilisé pour les études métaboliques 8. Cependant, comme cela est souvent le cas avec des études biomédicales, la réalisation d'un modèle accessible et bien défini pertinents à la maladie humaine est un défi.
De nombreuses études emploient des modèles cellulaires transformées pour sonder l'impact des xénobiotiques ou des anomalies génétiques sur le métabolisme cellulaire 7,9. La reprogrammation métabolique qui se produit dans les cellules cancéreuses peuvent introduire des facteurs de confusion 21 et ne sont donc pas idéales. Ces questions peuvent être circumvented avec des modèles de cellules primaires, bien que l'obtention d'une biomasse suffisante pour les analyses métaboliques peut être difficile. En outre, l'impact de grandes quantités d'antibiotiques utilisés dans la culture a été mis en évidence que des études mitochondriales potentiellement confondants 16.
Des plaquettes humaines offrent la possibilité d'utiliser un modèle de cellules primaires avec un contenu mitochondrial suffisante pour les études métaboliques 5,22,27,32. Tout d'abord, les plaquettes peuvent être facilement acquis, par le sang attire de donateurs individuels, ou dans de grands volumes de banques de sang, et donc fournir un modèle dans lequel les facteurs externes peuvent être facilement contrôlés. Deuxièmement, en raison de leur petite taille, les plaquettes peuvent être facilement isolés des autres composants du sang avec le travail préparatoire minimale dans les laboratoires même peu équipés 5. Il faut noter que les plaquettes ne contiennent pas de noyaux et peuvent donc être utilisés pour étudier les altérations du métabolisme indépendamment de la régulation de la transcription. Ici, nous montrons queen plus de la quantification relative de l'acyl-coenzyme A (CoA-thioesters), le système plaquettaire isolé peut être utilisé pour étudier le métabolisme du carbone. Plus précisément, nous rapportons l'utilisation de marquage métabolique avec des isotopes stables (non radioactif) marqué [13 C 6] Glucose et [13 C 16] palmitate pour sonder l' incorporation de la [13 C] -label dans l'importante acétyl métabolite CoA par l'intermédiaire de la glycolyse ou l'oxydation des acides gras. Ceci fournit une plate - forme puissante, généralisable, et polyvalent en raison de la forte implication des espèces acyl-CoA dans les voies biochimiques 13,24 et la traçabilité de ce système à l' essai d' autres variables, telles que l' inhibition de I complexe avec roténone 3,33. En plus des informations fournies dans le protocole ci - dessous, une description détaillée des méthodes utilisées pour le marquage isotopique et pour les analyses basées sur LC-MS peut être trouvée dans Basu et Blair 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Déclaration éthique: Tous les protocoles concernant le traitement des échantillons humains suivent les directives de l'Université de Pennsylvanie comité d'éthique de la recherche humaine.
1. Préparation de Tampons et 100x Stock Solutions
- Préparer 1 L de tampon de base de Tyrode. Combinez 8.123 g NaCl, 1,428 g de NaHCO 3, 0,466 g CaCl2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g de KCl, et 0,095 g MgCl 2. Régler le volume total à 1 L avec ddH 2 O. Filtre stériliser le tampon de base de Tyrode.
- Préparer des solutions de 100x de glucose et de l'acide palmitique. Pour 100x solutions mères de glucose, on dissout 100 mg de glucose ou de [13 C 6] -glucose dans 1 ml de ddH 2 O. Pour les solutions palmitate 100x, on dissout 2,56 mg d'acide palmitique ou 2,72 mg de [13 C 16] acide -palmitic dans 1 ml d'éthanol. Filtre stériliser 100x solutions mères.
- Préparer Tampons de Enriched appropriée Tyrode
- Pour les études d'étiquetage glucose, ajouter 1 ml de 100x [6 13 C] solution mère -glucose et 1 ml de 100x palmitique solution stock d' acide à 98 ml de tampon de base de Tyrode.
- Pour des études de marquage d'acide palmitique, ajouter 1 ml de solution mère 100x glucose et 1 ml de [13 C 16] -palmitic solution mère d' acide à 98 ml de tampon de base de Tyrode.
- Préparer une solution mère 10 mM de roténone dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Pour les études de dose-réponse non-étiquetage, passez à 1.4.3. Pour les études d'étiquetage à une seule dose, passez à 1.4.5.
- Effectuer une dilution en série de 10 mM roténone dans du DMSO pour obtenir des solutions avec des concentrations de roténone allant de 1 nM à 100 uM. Ce sont 100x actionss.
- Ajouter 50 ul de chaque stock à 5 ml de tampon de base de Tyrode + glucose + acide palmitique de 1.3.1 pour préparer des solutions avec des concentrations de roténone allant de 10 pM à 1 pM. En variante, ajouter 50 ul de DMSO pour servir de contrôle du véhicule. Passez à 2.1.
- Diluer la solution mère 10 mM 1000 fois dans du DMSO pour obtenir une solution de travail de 10 uM.
- Ajouter 50 pi de ce stock à 5 ml chacun de tampon de base de Tyrode + [13 C 6] -glucose + acide palmitique de 1.3.2 et de la base tampon Tyrode + glucose + [13 C 16] d'acide -palmitic de 1.3.3. La concentration finale est de 100 nM roténone. En variante, ajouter 50 ul de DMSO à chaque tampon pour servir de contrôle du véhicule.
2. Platelet Isolation
Note: Cette méthode se prête à des plaquettes dérivées de sang total ou à partir de sacs de plaquettes. Les données d'exemple dans le présent document a été préparéen utilisant les plaquettes dérivées de sacs de plaquettes. S'il vous plaît voir Basu et al. 5 pour plus de détails concernant l' utilisation de plaquettes isolées à partir du sang total.
- Isolement Platelet de sang total
NOTE: Si l'isolement des plaquettes d'un sac de plaquettes, passez à 2.2.1.- Toute Centrifugeuse de sang à 175 x g pendant 15 min sans freins.
- Transfert 1 ml de plasma riche en plaquettes supérieur (PRP) couche à un tube de 1,5 ml.
- Centrifuger le PRP à 400 x g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et passez à l'étape 3.1 ou 3.2.
- Isolation Platelet à partir d'un sac Platelet
- Transfert 1 ml de la suspension de plaquettes à un tube de 1,5 ml.
- Centrifuger la suspension à 400 g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et passez à l'étape 3.1. ou 3.2.
3. Réalisation d'une expérience
- Pour déterminer l'effet de xénobiotiquestraitement (par exemple, la roténone) sur les niveaux d'un métabolite d'intérêt (par exemple, l' acétyl-CoA), passez à 3.1.1. Pour déterminer l'effet d'un xénobiotiques (par exemple., Roténone) sur l'incorporation d'un précurseur métabolique en un métabolite aval d'intérêt, passez à 3.2.1.
- En utilisant pas moins de trois répétitions biologiques pour chaque état, remettre en suspension plaquettaire culot de l'étape 2.1.4 ou 2.2.3 dans 1 ml de chaque solution de l'étape 1.4.4.
- Incuber plaquettes remises en suspension dans un incubateur à CO2 chemisé d'eau fixé à 95% d' humidité, 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 1 heure. Passez à l'étape 4.1
Note: Nous décrivons ici une expérience de dose-réponse. En variante, une expérience au cours du temps pourrait être fait dans lequel la dose a été fixée et la durée d'incubation, on fait varier la place.
- Pour déterminer l'effet du traitement des xénobiotiques sur l'incorporation d'un précurseur métabolique en un métabolite aval d'intérêt.
- Uchante pas moins de trois répétitions biologiques pour chaque état, remettre en suspension plaquettaire culot de l'étape 2.1.4 ou 2.2.3 dans 1 ml de chaque formulation de tampon Tyrode marqué de l'étape 1.4.6.
- Incuber plaquettes remises en suspension dans un incubateur à CO2 chemisé d'eau fixé à 95% d' humidité, 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 1 heure. Passez à l'étape 4.1.
4. Trempe et CoA Extraction
- Pellet plaquettes par centrifugation à 3000 xg pendant 3 min.
- surnageant Aspirer.
- Remettre en suspension les plaquettes à 750 froide d'acide trichloroacétique à 10% pi de glace (p / v).
- Ajouter norme marquée par un isotope stable interne appropriée. Par exemple, si l'objectif est de comparer les niveaux d'espèces CoA à travers des échantillons, utiliser 100 pl d'un mélange d'isotopes stables de thioesters CoA marqués obtenus à partir de la levure comme décrit précédemment (technique SILEC) 29.
- Impulsions de sonication chaque échantillon 30 fois avec des impulsions de 0,5 sec.
- Centrifuger les échantillons à 16000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Apposer C18 extraction en phase solide (SPE) colonnes à collecteur à vide.
- Conditionner les colonnes avec 1 ml de méthanol.
- Equilibrer les colonnes avec 1 ml ddH 2 O.
- Exécutez échantillon dérivé surnageant (environ 850 ul dans ce cas) à travers les colonnes.
- Laver les colonnes avec 1 de l'eau.
- Charge 10 ml de centrifugation en verre des tubes dans le collecteur à vide pour recueillir la fraction d'élution.
- Éluer la colonne avec 1 ml d'acétate d'ammonium 25 mM dans le methanol.
- éluat à sec sous azote gazeux.
- Remettre en suspension les résidus séchés dans 50 ul de 5% (p / v) d'acide 5-sulfosalicylique et de transférer dans des flacons de HPLC.
Configuration 5. HPLC
- En utilisant le logiciel de commande du système HPLC, de créer un procédé avec des conditions de HPLC optimisées pour les analytes cibles et la colonne utilisée, comme indiqué dans le tableau 1.
Remarque: La colonne temperature utilisé pour la génération de ces données est de 25 ° C, mais les paramètres spécifiques variera par instrument et par rapport aux composés d'intérêt. Pour acyl-CoA quantification, plusieurs méthodes d'analyse LC-MS ont été signalés, et validés pour différents analytes dans différentes conditions LC 14,19,20. - Laisser la HPLC pour équilibrer adéquatement.
Note: Ceci doit inclure à la fois l'amorçage de solvants avant la fixation d'une colonne et équilibration de la colonne dans les conditions de solvant à partir de la méthode. Le volume d'équilibration doit suivre les instructions du fabricant, et l'effluent qui en résulte doit être détourné à perdre.
Note: Consultez Basu et Blair 5 pour plus de détails concernant les paramètres de HPLC.
6. Mass Spectrometer Setup
- En utilisant le logiciel de commande pour le spectromètre de masse, de créer un procédé pour la détection ciblée des formes ionisées des composés d'intérêt. Les paramètres sont présentésdans le tableau 2.
Nota: Les produits analogues des isotopes stables de ces composés doivent être utilisés pour déterminer si un mode positif ou négatif donne une sensibilité supérieure et d'optimiser la source et l'état de l'optique pour leur détection. Le temps total de détection de la méthode de spectrométrie de masse doit correspondre à la composante temporelle de la méthode HPLC associée.
Remarque: Comme mentionné précédemment, plusieurs méthodes d'analyse acyl-CoA ont été signalées, y compris 14 positifs et négatifs ionisation 15 modes et utilisation d'un spectromètre de masse à haute résolution 17 plutôt qu'un instrument triple quadripôle 28. - Nettoyer et étalonner l'instrument, établir une pulvérisation stable dans le spectromètre, et laisser le temps pour la solution d'étalonnage pour dissiper adéquatement de la source et de l'optique selon les instructions du fabricant.
- Mettre en place une séquence pour tous les échantillons avec le logiciel de contrôle de masse du spectromètre. includé le nom ou les identificateurs numériques et indiquer la méthode de volume d'injection et instrument approprié. Exécuter un vide avant le premier échantillon, et exécuter d'autres ébauches et lavages entre les échantillons au besoin pour atténuer report ou matrice effets.
Note: Une méthode de traitement pour une intégration de crête des chromatogrammes liquides d'analytes sélectionnés peuvent souvent être réglé dans cette séquence ou appliquée ultérieurement dans le traitement des données. - Commencez la séquence et surveiller le système de spectromètre et HPLC masse périodiquement pour des problèmes, y compris les fluctuations de pression ou les défaillances du système et la perte d'intensité du signal pendant la course.
Remarque: les problèmes graves ou les échecs d'exécution persistants peuvent nécessiter l'arrêt de la course et la purge et rééquilibrant le système HPLC, ainsi que le nettoyage et l'étalonnage du spectromètre de masse. Consultez Basu et Blair 5 pour plus de détails concernant les réglages et données MS traitement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour démontrer l'utilité de cette méthode, nous avons reproduit la généralisation de l'adaptation métabolique compensatoire décrit précédemment résultant de l'exposition à la roténone. Cette constatation a déjà été identifiée dans des modèles de culture cellulaire et cette enquête avait pour but de vérifier si ce changement métabolique se produit également dans les plaquettes, qui sont sujettes et non nucléaire est aux mêmes objets expérimentaux que la culture cellulaire. Ce travail a été réalisé avec 6 jours d'âge des plaquettes de la Penn Trauma Center, qui avait été jugé trop vieux pour perfusion humaine, bien qu'ils conservent leur activité métabolique. L'isolement a été effectué comme représenté sur la figure 1. Le flux total peut être réduit facilement à partir d' un nombre limité d'échantillons cliniques ou des conditions expérimentales à un débit plus élevé sur la base plaque à 96 puits avec la disponibilité des plaquettes qui ne sont plus utiles pour l' injection aux patients.
(figure 2). Plus précisément , nous avons observé dans des cellules SH-SY5Y une diminution dose - dépendante de la succinyl-CoA réductase (CI50 = 25 nM) avec une augmentation simultanée de la β-hydroxybutyryle (HB) -CoA (ED 50 = 75 nM), alors que les niveaux acétyl-CoA étaient inchangés 1. Notre analyse des plaquettes humaines traitées avec la roténone a révélé des résultats très cohérents (figure 3). Cela fournit un ensemble unique de données expérimentales dans les plaquettes humaines pointant vers la dépendance mitochondrial de la réponse à la roténone. Cette réponse ne peut pas être médiée par des mécanismes de transcription conventionnels parce que les plaquettes manquent noyaux.
quantification relative fournit une dimension de l'information métabolique, maismarquage isotopique donne un aperçu complémentaire inestimable dans l'activité des voies métaboliques spécifiques. Cela est essentiel dans les études métaboliques parce que plusieurs voies peuvent converger par un seul intermédiaire. Pour démontrer ce point, les plaquettes ont été traités avec 100 nM roténone ou le DMSO en présence d' une ou l' autre [13 C 6] -glucose ou [13 C 16] palmitate pendant 1 h. La co-élution des isotopologues de l' acyl-CoA à partir de la colonne LC permet de déterminer de façon définitive la composition isotopique d'analytes (figure 4). Après correction pour l'abondance naturelle d'isotopes lourds , comme décrit 11 cette approche a montré une diminution significative de la production glycolytique de l' acétyl-CoA dans les plaquettes tandis que l' incorporation du palmitate a été augmentée de façon significative (figure 5). Ces résultats sont similaires à ceux observés précédemment dans le modèle de culture de cellules SH-SY5Y 33 et ainsi de fournir des preuves supplémentaires tchapeau cette voie pourrait être important in vivo.
| Temps (min) | 0 | 0 | 1.5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| Débit total (ul / min) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % UNE | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % B | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. Tableau 1. Chromatographie liquide à gradient de solvant A: acétate d' ammonium 5 mM dans l' eau, solvant B: 5 mM d'acétate d' ammonium à 95: 5 , ACN / eau Solvant C: 80-20 ACN / eau 0,1% d' acide formique
| Paramètre | Valeur |
| Vaporiser Tension (V) | 4000 |
| Vaporiseur Température (° C) | 400 |
| Pression gaine gaz | 35 |
| Auxiliaire Pression de gaz | dix |
| Capillaire Température (° C) | 350 |
| Tube objectif Offset (V) | 100 |
Tableau 2. Spectromètre de masse Paramètres.
Figure 1. Generalized Workflow pour la préparation d'échantillons et d' analyse. Ce schéma illustre le flux de travail pour l' isolement des plaquettes et de traitement pour les études métaboliques par analyse LC-MS / MS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma métabolique du glucose et du métabolisme des lipides et de la chaîne de transport d' électron. Acétyl-CoA peuvent être synthétisés à partir du glucose ou du palmitate. La roténone inhibe le bon-vient des électrons par mitochondrial I. complexetp: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Quantification de CoA-thioesters en réponse au traitement roténone. Roténone ne modifie pas le taux acétyl-CoA , mais induit une diminution dose-dépendante de la succinyl-CoA réductase (CI50 = 4,1 nM) , avec une augmentation concomitante βHB-CoA (ED 50 = 4,2 nM). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM); n = 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Représentant chromatogrammes Affichage isotopiques Étiquetage de palmitateen acétyl-CoA. traitement roténone augmente l'incorporation de palmitate en acétyl-CoA. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Incorporation relative de [13 C 6] -glucose ou [13 C 16] palmitate dans le traitement acétyl-CoA. Roténone diminue glucose incorporation en acétyl-CoA et augmente palmitate incorporation. Les barres d'erreur représentent SEM; n = 4. Les astérisques indiquent p <(apparié test t de Student) 0.05. S'il vous plaît , cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, nous avons démontré l'utilité des plaquettes isolées en tant que plate-forme pour étudier le métabolisme mitochondrial perturbé. Plus précisément, nous avons caractérisé l'adaptation métabolique en réponse au complexe I inhibition par la roténone.
La présente étude a étendu les résultats rapportés précédemment sur le rôle de I inhibition complexe par la roténone dans des lignées cellulaires à des plaquettes humaines. Surtout, ce qui a révélé que la formation roténone plaquettaire a également inhibé la succinyl-CoA réductase, stimulée par une augmentation du nombre de plaquettes βHB-CoA et n'a eu aucun effet sur les niveaux de l'acétyl-CoA plaquettes.
Un grand soin doit être pris pour assurer la validité et la reproductibilité d'une analyse de ce type. Si les plaquettes doivent être isolées à partir du sang total, l'isolement doit procéder exactement comme décrit ci-dessus afin d'éviter la contamination des lymphocytes et l'activation des plaquettes, avec une attention particulière consacrée à laisser la couche leucocytaire contenant les lymphocytes undisturbed. Pour les courbes de réponse de dose pour être significative, des dilutions en série doivent être effectuées avec précision, en mélangeant jusqu'à homogénéité à chaque étape. Après la remise en suspension des plaquettes, des conditions d'incubation peuvent être modifiés de ceux décrits ci-dessus, mais ils doivent être normalisés rigoureusement dans tous les groupes de traitement pour permettre des comparaisons significatives à faire. Peut-être l'étape la plus importante dans toute / analyse LC-MS quantitative basée est l'utilisation de normes internes marquées isotopes stables.
L'utilisation de normes internes est essentiel dans ce contexte, car il protège contre potentiellement confondants "effets de lots», tels que l'efficacité d'extraction de variables et la stabilité de l'analyte dans les échantillons. L'addition de l'étalon interne (encore une fois, en mélangeant jusqu'à homogénéité) le plus tôt possible dans un protocole expérimental réduit le risque d'artefacts. Enfin, comme dans toute expérience, l'utilisation de multiples répétitions pour chaque condition expérimentale est essentielle, et si possible, Les calculs de puissance basés sur des expériences pilotes peuvent être utiles.
Les plaquettes peuvent être isolés rapidement à partir de sources individuelles ou regroupées 5,27,32, ce qui rend cette approche prête à un large éventail d'applications. Il est important de noter que la possibilité d'effectuer des études impliquant à la fois la quantification relative et de marquage isotopique permet une caractérisation plus complète d'un système métabolique. À l'heure actuelle, cela exige deux essais séparés, ce qui augmente la demande de biomasse nécessaire pour l'expérience. Pour cette raison, les plaquettes, qui peuvent être facilement obtenues en grand nombre, sont plus efficaces que d'autres modèles de culture cellulaire.
Cependant, malgré les nombreux avantages conférés par l'utilisation de plaquettes, il y a des inconvénients. Tout d' abord, il faut prendre soin dans la sélection des donneurs humains , car il y a beaucoup de troubles qui affectent la physiologie plaquettaire 25. En outre, l'activation des plaquettes au cours de l'échantillonpréparation et l'analyse est une variable de confusion potentiel en tout essai basé sur des plaquettes. Pour ces raisons, l' évaluation simultanée des marqueurs d'activation des plaquettes par ELISA 26, une cytométrie de flux, ou des dosages tels que le agrégométrie de transmission lumineuse (TAL) Essai 34 pourrait se révéler prudente.
Bien que la présente étude a porté sur l'analyse des thioesters acyl-CoA, cette approche peut être facilement étendu pour inclure une plus large gamme d'analytes. Approches métabolomique non ciblées fournissent une approche mécanistique dans un tableau d'états pathologiques 23. L'application de ces approches untargeted plaquettaires modèles seront probablement fournir des informations supplémentaires sur les mécanismes biochimiques sous-jacents impliqués dans le métabolisme cellulaire dérégulée.
Cette approche peut être facilement étendu pour inclure les enquêtes sur les autres produits chimiques environnementaux et des médicaments connus pour interférer avec le métabolisme mitochondrial 6,12,18,31, ainsi que d' un système pour tester les effets des xénobiotiques en tant que modulateurs potentiels de CoA métabolisme 10. En outre, l'approche générale peut être utilisée pour étudier les défauts métaboliques dans les maladies génétiques telles que l'ataxie de Friedreich 5,32. En outre, l' un des modèles expérimentaux précités pourrait être couplé avec un test de respiration fonctionnelle afin de caractériser plus robuste l'état des mitochondries dans chaque contexte 2. Ainsi, le couplage des isotopes stables et des analyses LC-MS avec des études métaboliques dans les plaquettes isolées est susceptible de procurer de nouvelles opportunités pour caractériser davantage le métabolisme mitochondrial aberrante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.
Acknowledgments
Nous reconnaissons l'appui des NIH subventions P30ES013508 et T32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
