Summary
ここでは、単離されたヒト血小板は私がロテノンを阻害複雑に応じて代謝適応を研究するためにアクセス可能なex vivoでのモデルとして使用できることを示します。このアプローチは、液体クロマトグラフィー - 質量分析法によって同位体トレースおよび相対的定量化を使用し、研究デザインの多様に適用することができます。
Introduction
機能不全のミトコンドリアの代謝は、神経変性、癌、および心血管疾患30を含む広範囲の疾患に関与しています。このように、多大な努力は、疾患の病因に寄与する代謝欠陥を特徴付ける上に置かれています。液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS / MS）は、複雑な生物学的マトリックスからの分析物の定量のためのゴールドスタンダードと考えられ、多くの場合、代謝研究の8のために使用されます。多くの場合、生物医学研究の場合のようにしかし、ヒトの疾患に関連するアクセスと明確に定義されたモデルを達成することが課題です。
多くの研究は、細胞の代謝7,9上の生体異物または遺伝的異常の影響をプロービングするための細胞モデルを変革採用します。癌細胞において起こる代謝再プログラミングは、交絡因子21を導入し 、従って、理想的ではないことができます。これらの問題はcircumveすることができます代謝分析のために十分なバイオマスを得ることが困難な場合がありますが、一次電池モデルとnted。また、培養に用いられる抗生物質の多量の影響は、潜在的な交絡ミトコンドリア研究16として強調されています。
ヒト血小板は、代謝研究5,22,27,32のための十分なミトコンドリアのコンテンツを持つ一次細胞モデルを利用する機会を与えます。血液は、個々のドナーから、または血液銀行から大量に描画し、したがって外部要因を容易に制御することができるモデルを提供〜第血小板を容易に取得することができます。第二に、それらの小さいサイズのために、血小板は容易も最小限備え実験室5内の最小の準備作業で他の血液成分から単離することができます。注目すべきは、血小板は核を含有しないため、独立して転写調節の代謝に変化を研究するために使用することができます。ここでは、ことを示していますアシル - コエンザイムA（COA）チオエステルの相対的定量化に加えて、単離された血小板のシステムは、炭素代謝を調べるために使用することができます。具体的には、我々は重要な代謝産物のアセチルへの[13 C] -labelの取り込みを調べるために安定同位体（非放射性）標識された[13 C 6] -グルコースおよび[13 C 16]パルミチンで代謝標識の使用を報告しますCoAの糖または脂肪酸酸化を介し。これは、生化学的経路13,24におけるアシルCoA種の広範な関与と、このようなロテノン3,33との複合体Iの阻害などの他の変数を、テストするには、このシステムの扱い易に、強力な一般化、および汎用性の高いプラットフォームを提供します。以下のプロトコルで提供される情報に加えて、同位体標識のためとLC-MSベースの分析のために使用される方法の広範な説明はBasuさんとブレア4に記載されています。
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Protocol
倫理文：ヒトサンプルの治療に関するすべてのプロトコルは、大学のペンシルベニア州の人間研究倫理委員会のガイドラインに従ってください。
緩衝液および100倍ストック溶液の調製
- ベースタイロード緩衝液1 Lを用意。 8.123グラムのNaClを組み合わせ、1.428グラムのNaHCO 3、0.466グラムの塩化カルシウム2∙2 H 2 O、0.224グラムのKCl、および0.095グラムののMgCl 2はのddH 2 Oで1 Lに総音量を調整しますフィルタは、ベースタイロード緩衝液を殺菌します。
- グルコースとパルミチン酸の100倍のストック溶液を準備します。 100Xグルコースストック溶液のために、のddH 2 O 1ml中の100mgのグルコースまたは[13 C 6] -グルコースを溶解100Xパルミチンソリューションについては、パルミチン酸の2.56ミリグラムまたはエタノール1ml中の[13 C 16] -パルミチン酸の2.72ミリグラムを溶解します。フィルタは、100×ストック溶液を滅菌します。
- 適切なエンリッチドタイロードバッファを準備します
- グルコース標識研究のために、ベースタイロード緩衝液の98ミリリットルに100倍パルミチン酸原液の1 100×[13 C 6] -グルコースストック溶液のミリリットルと1ミリリットルを追加します。
- パルミチン酸標識研究のために、1ミリリットルの100倍のグルコースストック溶液とベースタイロード緩衝液の98ミリリットルに[13 C 16] -パルミチン酸原液の1ミリリットルを追加します。
- ジメチルスルホキシド（DMSO）にロテノンの10mMストック溶液を調製します。
- 非標識の用量応答研究のために、1.4.3に進みます。単回投与での標識研究については、1.4.5に進みます。
- 1 nMの〜100μMの範囲のロテノンの濃度の溶液を得るために、DMSO中の10mMロテノンストックの連続希釈を行います。これらは、100×ストックしています秒。
- 10時から1μMまでのロテノンの濃度の溶液を準備するために1.3.1からベースタイロード緩衝液+グルコース+パルミチン酸の5ミリリットルにそれぞれ株式の50μLを加えます。また、車両制御として機能するようにDMSOの50μlを添加します。 2.1に進んでください。
- 10μMの作業溶液を得るために、DMSO中の10mMストック溶液を1000倍に希釈します。
- 5ミリリットルベースタイロード緩衝液+のそれぞれに、この株式の50μLを加える[13 C 6] -グルコース+パルミチン酸を1.3.2からとベースタイロード緩衝液+グルコース+ [13 C 16] 1.3.3から-パルミチン酸。最終濃度は、100nMのロテノンです。また、車両のコントロールとして機能するように、各バッファにDMSOの50μlを添加します。
2.血小板の分離
注：このメソッドは、いずれかの全血からまたは血小板バッグ由来の血小板に適しています。ここに含まれるデータ例を調製しました血小板バッグ由来の血小板を使用。 Basuさんらを参照してください。5全血から単離した血小板を使用してについての詳細は。
- 全血からの血小板の単離
注：血小板の袋から血小板を単離する場合は、2.2.1に進みます。- ノーブレーキと15分間175×gで遠心分離全血。
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移し、上部多血小板血漿（PRP）層の1ミリリットルを。
- 5分間400×gでPRPを遠心分離します。
- 上清を吸引し、3.1または3.2に進みます。
- 血小板バッグから血小板の単離
- 1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し血小板懸濁液の1ミリリットルを。
- 5分間400×gで懸濁液を遠心。
- 上清を吸引し、3.1に進みます。または3.2。
3.実験の実行
- 生体異物の影響を決定するために、治療（ 例えば、ロテノン）関心の代謝産物のレベルでは、（ 例えば、アセチルCoA）、3.1.1に進みます。関心の下流の代謝物に代謝前駆体の取り込みに対する生体異物（ 例えば 、ロテノン）の効果を決定するために、3.2.1に進みます。
- 各条件のために何よりも少ない3つの生物学的複製物を使用していない、ステップ1.4.4からの各溶液1ミリリットルのステップ2.1.4または2.2.3から血小板ペレットを再懸濁します。
- 湿度95％、5％CO 2で1時間、37℃に設定した水ジャケットCO 2インキュベーター中に再懸濁した血小板をインキュベートします。 4.1に進み
注：ここでは、用量反応実験を記述する。代替的に、時間経過実験を行うことができるが、ここでの用量を固定し、インキュベーションの長さではなく、変化させました。
- 関心の下流の代謝物に代謝前駆体の取り込みに対する生体異物処理の効果を判定すること。
- U各条件について3つの生物学的複製物よりも少ないを歌っていない、ステップ1.4.6からの標識されたタイロードバッファの各製剤の1ミリリットルのステップ2.1.4または2.2.3から血小板ペレットを再懸濁します。
- 湿度95％、5％CO 2で1時間、37℃に設定した水ジャケットCO 2インキュベーター中に再懸濁した血小板をインキュベートします。 4.1に進みます。
4.焼入れとCoAの抽出
- 3分間3000×gで遠心分離することにより、血小板をペレット化。
- 上清を吸引。
- 750μlの氷冷10％トリクロロ酢酸で再懸濁した血小板（w / vで）。
- 適切な安定同位体標識内部標準を追加します。例えば、目標は、前述のように、酵母から得られた安定同位体標識されたアシルCoAチオエステル（SILEC技術）29の混合物100μLを使用し、試料を横切るのCoA種のレベルを比較する場合。
- パルス超音波処理0.5秒のパルスを用いて、各試料を30回。
- 4℃で10分間、16,000×gで遠心分離サンプル。
- 真空マニホールドにC18固相抽出（SPE）カラムを取り付けます。
- 1ミリリットルのメタノールでカラムをコンディショニング。
- 1ミリリットルののddH 2 Oでカラムを平衡化
- カラムを通して試料由来の上清（この場合は約850μl）を実行します。
- 1ミリリットルの水でカラムを洗浄します。
- 溶出画分を収集するための真空マニホールドへの負荷10mlのガラス遠心管。
- メタノール中の25mM酢酸アンモニウム1mlでカラムを溶出します。
- 窒素ガス下で乾燥した溶出液。
- 50μlの5％（w / v）の5-スルホサリチル酸で乾燥残渣を再懸濁し、HPLCバイアルに移します。
5. HPLCセットアップ
- HPLCシステムのための制御ソフトウェアを使用して、 表1に示すように、標的分析物と利用カラム用に最適化されたHPLC条件付きメソッドを作成します。
注：列temperatこのデータの生成に使用されるUREは、25℃であったが、具体的なパラメータは、機器によって、目的の化合物に関して変化するであろう。アシルCoAの定量化のために、LC-MS分析の複数の方法が報告されており、異なるLC条件14,19,20中の異なる分析物のための検証します。 - HPLCは十分に平衡化させます。
注：これは、メソッドの開始溶媒条件でカラムのカラムと平衡を取り付ける前に、溶媒の両方のプライミングを含める必要があります。平衡量は製造元の指示に従ってください、そして得られた流出物は無駄に転用されるべきです。
注：HPLCの設定に関する詳細についてはBasuさんとブレア5を参照してください。
6.質量分析計のセットアップ
- 質量分析計の制御ソフトウェアを使用して、目的の化合物のイオン化形態を検出するための標的化方法を作成します。パラメータが提示されています表2に示します。
注：これらの化合物の安定同位体類似体は、正または負のモードでは、優れた感度を与えるかどうかを決定し、それらの検出のためのソースと光学条件を最適化するために使用されるべきです。質量分析法の総検出時間は、関連するHPLC法の時間成分に対応する必要があります。
注意：前述のように、アシル-CoA分析の複数の方法は、正14と負イオン15モードと高分解能質量分析計17ではなく三連四重極機器28の使用を含め、報告されています。 - 清潔で、楽器を校正分析計に安定したスプレーを確立し、キャリブレーション・ソリューションのための時間が十分に製造元の指示に従ってソースおよび光学系から放散することができます。
- 質量分析計の制御ソフトウェアを持つすべてのサンプルのシーケンスを設定します。院生名前または数値識別子を解除し、適切な注入量と機器方法を示しています。最初のサンプルの前に空白を実行し、キャリーオーバーまたはマトリックス影響を緩和するために、必要に応じてサンプル間の他のブランクおよび洗浄を実行します。
注：選択された分析物」液体クロマトグラムのピークを統合するための処理方法は、多くの場合、この配列内に設定するか、またはその後のデータ処理に適用することができます。 - シーケンスを開始し、圧力変動やシステム障害や実行時の信号強度の損失などの問題のために定期的に質量分析計やHPLCシステムを監視します。
注：重度の問題や永続的な実行の失敗は、ランとパージと再平衡化HPLCシステムだけでなく、洗浄を停止し、質量分析計の校正が必要な場合があります。 MSの設定やデータ処理に関する詳細についてはBasuさんとブレア5を参照してください。
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Representative Results
我々は以前にロテノンへの暴露から生じる補償代謝適応を説明。の一般化を再現しており、この手法の有用性を実証するために、この知見は、以前に細胞培養モデルにおいて同定されたこの調査は、この代謝シフトはまた、無核および細胞培養と同様の実験アーティファクトする傾向はない血小板で発生するかどうかを試験することを目的としました。彼らは代謝活性を保持していたが、この作品は、人間の注入のために古すぎるとみなされていたペン外傷センターから6日齢の血小板を用いて行きました。 図1に示すように、単離を行った。合計ワークフローがもはや患者への注入のために有用である血小板の利用可能性と、96ウェルプレートベースのスループットに臨床サンプル又は実験条件の限定された数から容易にスケーリングすることができます。
図2）複合体の阻害に起因すると仮定されている細胞株におけるロテノンに応じて、アシルCoAチオエステルの相対的なレベルの変化を報告しました。具体的に我々は、アセチルCoAレベルながら、βヒドロキシブチにおける同時増加（HB）-CoA（ED 50 = 75 nM）を用いて、SH-SY5Y細胞中でスクシニルCoA（IC 50 = 25 nM）を用量依存的な減少を観察しています1不変でした。ロテノンで処理されたヒト血小板の我々の分析は非常に一貫性のある結果（ 図3）を明らかにしました。これは、ロテノンへの応答のミトコンドリア依存性を指しヒト血小板における実験データの固有のセットを提供します。血小板は核を欠いているため、この応答は、従来の転写のメカニズムを介して媒介することはできません。
相対定量は、代謝情報の1次元を提供していますが、同位体標識は、特異的な代謝経路の活性への貴重な補完的な洞察を提供しています。複数の経路が単一の中間を通って収束する可能性があるので、これは、代謝の研究において重要です。この点を実証するために、血小板は1時間のいずれか[13 C 6] -グルコースまたは[13 C 16]パルミチンの存在下で、100nMのロテノンまたはDMSOのいずれかで処理しました。 LCカラムからアシル-CoAの同位体の共溶出は、分析物の同位体組成（ 図4）の決定的な決意を可能にします。パルミチン酸取り込みが有意に（ 図5）を上昇させながら説明した11のような重い同位体の天然存在度の補正に続いて、このアプローチは、血小板におけるアセチルCoAの解糖産生の有意な減少を示しました。これらの知見は、SH-SY5Y細胞培養モデル33において以前に観察されたものと同様であるので、追加の証拠tを提供します帽子この経路は、in vivoで重要であり得ます。
| 時間（分） | 0 | 0 | 1.5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| 総流量（μL/分） | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| ％A | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| ％のB | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| ％C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
表1. 液体クロマトグラフィー勾配溶媒A：水中で5 mMの酢酸アンモニウム、溶媒B：5 ACN /水溶媒C：：80:20 ACN /水、0.1％ギ酸95で5 mMの酢酸アンモニウム
| パラメーター | 値 |
| 電圧（V）をスプレー | 4,000 |
| 気化器温度（℃） | 400 |
| シースガス圧力 | 35 |
| 補助ガス圧力 | 10 |
| キャピラリー温度（°C） | 350 |
| オフセットチューブレンズ（V） | 100 |
表2質量分析計のパラメータ。
サンプル調製および分析図1.一般ワークフロー。この回路図は、LC-MS / MS分析によって代謝研究のための血小板の単離および治療 のためのワークフローを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
グルコースの図2.代謝スキームおよび脂質代謝および電子輸送チェーン。アセチルCoAはグルコースまたはパルミチン酸のいずれかから合成することができます。ロテノンはミトコンドリア複合体Iによって電子の適切な往復を阻害しますTPS：//www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ロテノンに応答したのCoA-チオエステルの図3.定量。ロテノン処理はアセチルCoAレベルに影響を与えるが、βHB-CoAを（EDの同時増加とスクシニルCoA（IC 50 = 4.1 nM）をにおける用量依存性の減少を誘発しません50 = 4.2 nM）を有します。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を表します。 n = 4 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
パルミチン酸から同位体標識を表示図4.代表的クロマトグラムアセチルCoAへ。ロテノン処理は、アセチルCoAへのパルミチン酸の取り込みを増加させる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アセチルCoA。ロテノン治療への [13 C 6] -グルコースまたは[13 C 16]パルミチン 図 5. 相対的な取り込みは、アセチルCoAへのグルコースの取り込みを減少させ、パルミチン酸の取り込みを増加させます。エラーバーはSEMを表します。 n = 4アスタリスクはp <0.05（スチューデントの対応のないt検定）を示す。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
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Discussion
ここでは、摂動ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとして、単離された血小板の有用性を示しています。具体的には、ロテノンにより複合体Iの阻害に応答して、代謝適応を特徴としています。
本研究は、ヒト血小板の細胞株におけるロテノンによって複合体I阻害の役割に以前に報告の調査結果を拡張しました。重要なことに、これはロテノンはまた、血小板のスクシニルCoAの形成を阻害することを明らかにした、血小板βHBブチリル-CoAの増加を刺激し、アセチルCoAの血小板レベルに影響を及ぼしませんでした。
細心の注意は、このタイプのいずれかの分析の妥当性と再現性を保証するために注意しなければなりません。血小板が全血から単離する場合、リンパ球の汚染および血小板活性化を防止するために、上記のように、分離は、リンパ球のundisを含むバフィーコートを残すに専念特別な注意を払って、正確に進めるべきturbed。用量応答曲線は意味のあるものにするためには、連続希釈液は、各ステップで均質に混合しながら、正確に行わなければなりません。血小板再懸濁させた後、インキュベーション条件は、上記に詳述したものから変更することができるが、それらは厳密に行わなければ意味のある比較を可能にするために、治療群間で標準化されなければなりません。おそらく任意の定量LC / MSベースの分析において最も重要な工程は、安定同位体標識内部標準の使用です。
それは、このような変数抽出効率とサンプル全体の分析対象物の安定性などの潜在的交絡「バッチ・エフェクト」から保護するため、内部標準の使用は、この設定において重要です。できるだけ早期に実験プロトコルにおける内部標準を添加する、（再び、均一になるまで混合）は、成果物の可能性を低減します。最後に、任意の実験のように、各実験条件についての複数の複製を使用することは必須であり、可能であればパイロット実験に基づいて、電力の計算は有用であり得ます。
血小板は急速に広範囲の用途に適し、このアプローチを作り、個々のまたはプールされた光源5,27,32から単離することができます。相対的な定量および同位体標識の両方を含む研究を実行する能力は、代謝系のより包括的な特性評価を可能にすることに留意することが重要です。現在、これは、実験に必要なバイオマスの需要を増加させる2つの別々のアッセイを要求します。この理由のため、容易に大量に得られる血小板は、他の細胞培養モデルよりも効率的です。
しかしながら、血小板の使用により与え多くの利点にもかかわらず、欠点があります。血小板生理学25に影響を与える多くの障害があるので、まず、介護は人間のドナーの選択に注意しなければなりません。試料の過程に加えて、血小板活性化調製および分析は、任意の血小板ベースのアッセイにおける潜在的な交絡変数です。これらの理由から、ELISA 26による血小板活性化のマーカーの同時評価は、慎重な証明できるような光透過凝集測定（LTA）アッセイ34としてサイトメトリー1、またはアッセイを流します。
本研究は、アシル-CoAチオエステルの分析に焦点を当てているが、このアプローチは、容易に検体の広い範囲を含むように拡張することができます。非標的メタボロミクスのアプローチは、疾患状態23のアレイに機械的な洞察を提供しています。血小板モデルへのそのような非標的アプローチを適用することは、おそらく調節不全細胞の代謝に関与する基礎となる生化学的機構への追加の洞察を提供します。
このアプローチは、容易に、ミトコンドリアの代謝を妨害することが知られている他の環境化学物質および薬物の調査を含むように拡張することができる6,12,18,31と同様のCoA代謝10の潜在的モジュレーターとしての生体異物の効果をテストするためのシステム。また、一般的なアプローチは、フリードライヒ失調症5,32などの遺伝病における代謝異常を研究するために使用することができます。また、上記の実験計画のいずれかをより確実に各コンテキスト2にミトコンドリアの状態を特徴付けるために機能的な呼吸のアッセイを用いて結合することができます。したがって、単離された血小板における代謝研究と安定同位体およびLC-MS分析を結合することは、さらに異常なミトコンドリア代謝を特徴付ける新規な機会を与える可能性があります。
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Disclosures
著者には、競合する金融利益を宣言しません。
Acknowledgments
私たちは、NIHの助成金P30ES013508とT32ES019851のサポートを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
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