Summary
Här visar vi isolerade humana trombocyter kan användas som en tillgänglig ex vivo modell för att studera metaboliska anpassningar som svar på det komplexa I-inhibitor rotenon. Detta tillvägagångssätt utnyttjar isotopisk spårning och relativ kvantifiering genom vätskekromatografi-masspektrometri och kan appliceras på en mängd olika studiedesign.
Introduction
Dysfunktionell mitokondriell metabolism har varit inblandad i ett stort antal olika sjukdomar inkluderande neurodegeneration, cancer och hjärt-kärlsjukdom 30. Som sådan har stora ansträngningar lagts på att karakterisera metaboliska defekter som bidrar till sjukdomen patogenes. Vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS / MS) anses vara den gyllene standarden för kvantifiering av analyter från komplexa biologiska matriser och ofta används för metaboliska studier 8. Men som ofta är fallet med biomedicinska studier, uppnå en tillgänglig och väldefinierad modell gäller människors sjukdom är en utmaning.
Många studier anställer omvandlas cellulära modeller för sondera effekterna av xenobiotika eller genetiska avvikelser på cellulär metabolism 7,9. Den metaboliska omprogrammering som sker i cancerceller kan införa confoundingfaktorer 21 och är därför inte idealiskt. Dessa frågor kan vara circumvented med primära cellmodeller, men att få tillräckligt med biomassa för metabola analyser kan vara en utmaning. Dessutom har effekterna av höga halter av antibiotika som används i odling lyfts fram som potentiellt störande mitokondrie studier 16.
Humana blodplättar ge möjlighet att utnyttja en primär cellmodell med tillräcklig mitokondrie innehåll för metaboliska studier 5,22,27,32. För det första kan trombocyter lätt förvärvas genom bloddragningar från enskilda givare, eller i stora volymer från blodbanker, och ger därmed en modell där externa faktorer kan lätt kontrolleras. För det andra, på grund av sin ringa storlek, blodplättar kan lätt isoleras från andra blodkomponenter med minimal förberedande arbete med minimalt utrustade laboratorier 5. Notera gör blodplättar innehåller kärnor och kan därför användas för att studera förändringar i metabolism oberoende av transkriptionell reglering. Här visar vi attförutom relativ kvantifiering av acyl-koenzym A (CoA) tioestrar, kan isoleras systemet plätt användas för att undersöka kolmetabolism. Specifikt rapporterar vi användning av metabolisk märkning med stabil isotop (icke-radioaktiv) märkt [13 C 6] glukos och [13 C 16] -palmitate att sondera inkorporering av [13 C] -märkt i den viktiga metaboliten acetyl- CoA via glykolys eller fettsyra oxidation. Detta ger ett kraftfullt, generaliserbar och mångsidig plattform på grund av den omfattande engagemang av acyl-CoA arter i biokemiska vägar 13,24 och spårbarhet av detta system att testa andra variabler, såsom hämning av komplex I med rotenon 3,33. Förutom de uppgifter som lämnats i protokollet nedan kan hittas en omfattande beskrivning av de metoder som används för isotopmärkning och för LC-MS-baserade analyser i Basu och Blair 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla protokoll som rör behandlingen av humana prover följa riktlinjerna i University of Pennsylvania forskningsetiska kommittén människa.
1. Framställning av buffertar och 100x förrådslösningar
- Förbereda ett L av bas Tyrodes buffert. Kombinera 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO 3, 0,466 g CaCl2 ∙ 2 H2O, 0,224 g KCl, och 0,095 g MgCl 2. Justera totalvolymen till 1 L med DDH 2 O. Filter sterilisera bas Tyrodes buffert.
- Förbereda 100x stamlösningar av glukos och palmitinsyra. För 100x glukosstamlösningar, upplösa 100 mg glukos eller [13 C 6] glukos i 1 ml DDH 2 O. För 100x palmitat lösningar, upplösa 2,56 mg palmitinsyra eller 2,72 mg [13 C 16] -palmitic syra i 1 ml etanol. Filtersterilisera 100x stamlösningar.
- Utarbeta lämpliga Enriched Tyrodes Buffertar
- För glukosmärkningsstudier, tillsätt 1 ml av 100x [13 C 6] -glukos förrådslösningen och 1 ml av 100x palmitinsyra stamlösning till 98 ml av bas Tyrodes buffert.
- För palmitinsyra märkningsstudier, tillsätt 1 ml av 100x glukosförrådslösningen och 1 ml av [13 C 16] -palmitic syrastamlösning till 98 ml av bas Tyrodes buffert.
- Bered en 10 mM förrådslösning av rotenon i dimetylsulfoxid (DMSO).
- För icke-märkning dos-responsstudier, fortsätt till 1.4.3. För märkning studier vid en enda dos, fortsätt till 1.4.5.
- Utföra en serieutspädning av 10 mM rotenon lager i DMSO för att erhålla lösningar med rotenon koncentrationer varierande från 1 nM till 100 ^ M. Dessa är 100x stocks.
- Tillsätt 50 pl av varje lager till 5 ml bas Tyrodes buffert + glukos + palmitinsyra från 1.3.1 för att framställa lösningar med rotenon koncentrationer som sträcker sig från 22:00 till 1 ^ M. Alternativt, tillsätt 50 pl DMSO för att tjäna som en vehikelkontroll. Fortsätt till 2,1.
- Späd 10 mM stamlösning 1000-faldigt i DMSO för erhållande av en 10 ^ M arbetslösning.
- Tillsätt 50 pl av detta bestånd till 5 ml vardera av bas Tyrodes buffert + [13 C 6] glukos + palmitinsyra från 1.3.2 och bas Tyrodes buffert + glukos + [13 C 16] -palmitic syra från 1.3.3. Den slutliga koncentrationen är 100 nM rotenon. Alternativt tillsätt 50 | il DMSO till varje buffert för att fungera som vehikelkontroller.
2. Blodplätts Isolering
Obs: Denna metod är mottaglig för blodplättar härledda från antingen helblod eller från blodplättpåsar. De exempeldata häri framställdesmed hjälp av blodplättar som härrör från påsar blodplättar. Se Basu et al. 5 för mer information om användning av blodplättar som isolerats från helblod.
- Platelet Isolering från helblod
OBS: Om isolera blodplättar från en påse med blodplättar, fortsätt till 2.2.1.- Centrifugera helblod vid 175 x g under 15 min utan bromsar.
- Över 1 ml av övre blodplättsrik plasma i (PRP) skikt till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera PRP vid 400 x g under 5 min.
- Aspirera supernatanten och fortsätt till steg 3,1 eller 3,2.
- Platelet Isolering från en blodplättsbehållaren
- Överföring 1 ml av blodplättssuspension till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera suspensionen vid 400 xg under 5 min.
- Aspirera supernatanten och gå vidare till steg 3,1. eller 3,2.
3. Utföra ett experiment
- För att bestämma effekten av xenobiotiskabehandling (t.ex., rotenon) på nivåerna av en metabolit av intresse (t.ex. acetyl-CoA), fortsätt till 3.1.1. För att bestämma effekten av en xenobiotiska (eg., Rotenon) om införande av en metabolisk prekursor till en nedströms metabolit av intresse, fortsätt till 3.2.1.
- Använda inte mindre än tre biologiska replikat för varje tillstånd, suspendera blodplättpellet från steg 2.1.4 eller 2.2.3 i en ml av varje lösning från steg 1.4.4.
- Inkubera återsuspenderade blodplättar i en vattenmantlad CO2 inkubator inställd på 95% fuktighet, 5% CO2 och 37 ° C under 1 timme. Gå vidare till steg 4,1
Obs: Här beskriver vi en dos-responsexperiment. Alternativt skulle ett tidsförlopp experiment göras i vilken dosen var fast och längden av inkubationstiden varierades i stället.
- För att bestämma effekten av xenobiotiska behandling på inkorporering av en metabolisk prekursor till en nedströms metabolit av intresse.
- Usjunga inte mindre än tre biologiska replikat för varje tillstånd, suspendera blodplättpellet från steg 2.1.4 eller 2.2.3 i 1 ml för varje formulering av märkt Tyrodes buffert från steg 1.4.6.
- Inkubera återsuspenderade blodplättar i en vattenmantlad CO2 inkubator inställd på 95% fuktighet, 5% CO2 och 37 ° C under 1 timme. Gå vidare till steg 4,1.
4. Släckning och CoA Extraction
- Pelletera blodplättar genom centrifugering vid 3000 x g under 3 min.
- Aspirera supernatanten.
- Resuspendera blodplättar i 750 | il iskall 10% triklorättiksyra (vikt / volym).
- Tillsätt stabil isotopmärkt intern standard. Till exempel, om målet är att jämföra halterna av CoA arter över prover, använder 100 pl av en blandning av stabil-isotop märkta CoA tioestrar erhållits från jäst såsom beskrivits tidigare (SILEC teknik) 29.
- Puls sonikera varje prov 30 gånger med 0,5 sek pulser.
- Centrifugera proverna vid 16.000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Fäst C18 fast fas extraktion (SPE) kolumner till vakuumröret.
- Konditionera kolonnerna med 1 ml metanol.
- Jämvikt kolonnerna med 1 ml DDH 2 O.
- Kör prov härrörande supernatanten (ca 850 pl i detta fall) genom kolonnerna.
- Tvätta kolonnerna med 1 ml vatten.
- Belastning 10 ml glas centrifugrör i vakuumgrenröret för att samla elueringsfraktionen.
- Eluera kolonnerna med 1 ml av 25 mM ammoniumacetat i metanol.
- Torr eluatet under kvävgas.
- Resuspendera torkade rester i 50 | il 5% (vikt / volym) 5-sulfosalicylsyra och överför till HPLC-ampuller.
5. HPLC-Setup
- Med hjälp av styrprogram för HPLC-systemet, skapa en metod med HPLC-betingelser som är optimerade för de målanalyter och utnyttjas kolonn, såsom anges i tabell 1.
Obs: Kolumnen tempure används för generering av dessa uppgifter var 25 ° C, men de specifika parametrarna varierar beroende på instrument och med hänsyn till föreningarna av intresse. För acyl-CoA kvantifiering, har flera metoder för LC-MS-analys har rapporterats, och validerats för olika analyter i olika LC-betingelserna 14,19,20. - Låt HPLC på ett tillfredsställande sätt Jämvikt.
Obs: Det bör omfatta både priming av lösningsmedel innan fästa en kolonn och utjämning av kolonnen vid startlösningsmedelsbetingelser för metoden. Jämvikts volym bör följa tillverkarens anvisningar, och resulterande utflödet ska vidarekopplas till spillo.
Obs: Kontakta Basu och Blair 5 för mer information om HPLC-inställningar.
6. masspektrometer Setup
- Med hjälp av styrprogram för masspektrometern, skapa en riktad metod för detektion av joniserade former av föreningarna av intresse. Parametrar presenterasi tabell 2.
Notera: Stabila isotop analoger till dessa föreningar bör användas för att bestämma huruvida en positiv eller negativ läge ger överlägsen känslighet och för att optimera källan och optiken förutsättning för deras detektering. Den totala detekteringstiden för masspektrometern metoden bör motsvara tidskomponenten av den tillhörande HPLC-metoden.
Obs: Som tidigare nämnts, har flera metoder för acyl-CoA analys har rapporterats, inklusive positiva 14 och negativa jonisering 15 lägen och användning av en hög upplösning masspektrometer 17 snarare än en trippelkvadrupol instrument 28. - Ren och kalibrera instrumentet, etablera en stabil sprej i spektrometern, och ge tid för kalibreringslösningen på ett tillfredsställande sätt försvinna från källan och optiken enligt tillverkarens anvisningar.
- Ställ in en sekvens för alla prover med kontroll av massa spektrometer programvara. incluDE namn eller numeriska identifierare och ange lämplig injektionsvolym och instrumentmetod. Kör en tom innan det första provet, och köra andra ämnen och tvättar mellan prover som behövs för att minska övervältrings eller matriseffekter.
Obs: En bearbetningsmetod för toppintegrering av utvalda analyter likvida kromatogram kan ofta ställas in inom denna sekvens eller senare används i databehandlingen. - Börja sekvensen och övervaka masssystemet spektrometer och HPLC med jämna mellanrum för problem, bland annat tryckvariationer eller systemfel och förlust av signalstyrka under körningen.
Obs: Allvarliga problem eller ihållande kör fel kan kräva att stoppa körningen och utrensning och återjämvikt HPLC-systemet liksom för rengöring och kalibrering av masspektrometer. Consult Basu och Blair 5 för mer information om MS inställningar och databehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera användbarheten av denna metod har vi återskapat generaliserbarhet av tidigare beskrivna kompensations metabolisk anpassning till följd av exponering för rotenon. Denna upptäckt har tidigare identifierats i cellodlingsmodeller och undersökningen syftade till att testa om denna metaboliska förändring sker också i blodplättar, som är anuclear och inte benägna att samma experimentella artefakter som cellodling. Detta arbete utfördes med sex dagar gamla trombocyter från Penn Trauma Center, som hade bedömts vara för gammal för mänsklig infusion, även om de behöll sin metaboliska aktivitet. Isoleringen utfördes såsom visas i Figur 1. Den totala arbetsflödet kan skalas lätt från ett begränsat antal kliniska prover eller experimentella förhållanden till 96-brunnar baserad högre genomströmning med tillgången på blodplättar som inte längre är användbara för infusion i patienter.
(Figur 2). Specifikt har vi observerat i SH-SY5Y-celler en dosberoende minskning av succinyl-CoA (IC50 = 25 nM) med en samtidig ökning av β-hydroxibutyryl (HB) -COA (ED 50 = 75 nM), medan acetyl-CoA nivåerna var oförändrade 1. Vår analys av humana trombocyter som behandlats med rotenon avslöjade mycket konsekventa resultat (Figur 3). Detta ger en unik uppsättning av experimentella data i humana blodplättar som pekar på den mitokondriella beroende av svaret på rotenon. Detta svar kan inte förmedlas genom konventionella transkriptionsmekanismer eftersom blodplättar saknar kärnor.
Relativ kvantifiering ger en dimension av metabolisk information, menisotopmärkning ger ovärderlig kompletterande inblick i aktiviteten av specifika metaboliska vägar. Detta är avgörande för metaboliska studier på grund flera vägar kan konvergera genom en enda mellan. För att demonstrera denna punkt, var trombocyter behandlades med antingen 100 nM rotenon eller DMSO i närvaro av antingen [13 C 6] -glukos eller [13 C 16] -palmitate under 1 timme. Samtidig eluering av isotopologues av acyl-CoAs från LC-kolonnen medger definitiv bestämning av isotopsammansättningen av analyter (Figur 4). Efter korrigering för den naturliga överflödet av tunga isotoper såsom beskrivits 11 detta tillvägagångssätt visade en signifikant minskning av glykolytiska produktionen av acetyl-CoA i blodplättarna medan palmitat inkorporering ökades signifikant (Figur 5). Dessa resultat är liknande de som observerats tidigare i SH-SY5Y cellodlingsmodell 33 och så ger ytterligare bevis thatt denna väg kan vara viktigt in vivo.
| Tid (min) | 0 | 0 | 1,5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| Totalt flöde (l / min) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % A | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % B | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. Tabell 1. vätskekromatografi Gradient Lösningsmedel A: 5 mM ammoniumacetat i vatten, lösningsmedel B: 5 mM ammoniumacetat i 95: 5 ACN / Vatten Lösningsmedel C: 80:20 ACN / vatten 0,1% myrsyra
| Parameter | Värde |
| Spray Spänning (V) | 4000 |
| Vaporizer Temperatur (° C) | 400 |
| Mantelgastryck | 35 |
| Auxiliary Gastryck | 10 |
| Kapillär Temperatur (° C) | 350 |
| Tublinsen Offset (V) | 100 |
Tabell 2. masspektrometer parametrar.
Figur 1. Gener Workflow för Provberedning och analys. Denna schematiska visar arbetsflödet för isolering plätt och behandling för metaboliska studier med LC-MS / MS-analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Metabolic Scheme of Glucose och Lipid Metabolism och elektrontransportkedja. Acetyl-CoA kan syntetiseras antingen glukos eller palmitat. Rotenon hämmar korrekt skytteltrafik av elektroner genom mitokondriell komplex I.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kvantifiering av CoA-tioestrar som svar på Rotenon. Rotenon behandling påverkar inte acetyl-CoA nivåerna men inducerar en dosberoende minskning av succinyl-CoA (IC50 = 4,1 nM) med en åtföljande ökning av βHB-CoA (ED 50 = 4,2 nM). Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM); n = 4. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa Kromatogram Visar Isotop Märkning från palmitattill acetyl-CoA. Rotenon behandling ökar införlivandet av palmitat i acetyl-CoA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Relativ Införlivandet av [13 C 6] glukos eller [13 C 16] -palmitate till acetyl-CoA. Rotenon behandling minskar glukos införlivande i acetyl-CoA och ökar palmitat inkorporering. Felstaplar representerar SEM; n = 4. Asterisker betecknar p <0,05 (Students oparade t-test). Klicka häratt se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi visat användbarheten av isolerade blodplättar som en plattform för att studera perturbed mitokondriell metabolism. Specifikt har vi karaktäriseras metabolic anpassning som svar på komplexa I hämning av rotenon.
Den aktuella studien har förlängt tidigare rapporterade resultaten på sig rollen av komplexa I hämning av rotenon i cellinjer till humana blodplättar. Viktigt har detta visat att rotenon också hämmade trombocyter succinyl-CoA bildning, stimulerade en ökning av blodplätts βHB-CoA och hade ingen effekt på nivåerna av acetyl-CoA blodplättar.
Stor försiktighet måste vidtas för att säkerställa giltigheten och reproducerbarheten för varje analys av denna typ. Om blodplättar ska isoleras från helblod, bör isoleringen gör likadant som beskrivits ovan för att förhindra kontaminering lymfocyter och blodplättsaktivering, med särskild uppmärksamhet ägnas åt att lämna buffy coat innehåller lymfocyter Undisturbed. För dosresponskurvor att vara meningsfull, måste serieutspädningar utföras exakt, med blandning till homogenitet vid varje steg. Efter blodplättar resuspension kan inkubationsbetingelser ändras från de som beskrivs ovan, men de måste vara strikt standardiserade i alla behandlingsgrupper för att möjliggöra meningsfulla jämförelser. Kanske det viktigaste steget i en kvantitativ LC / MS-baserad analys är användningen av stabilt-isotopmärkta interna standarder.
Användningen av interna standarder är avgörande för den här inställningen eftersom det skyddar mot potentiellt störande "sats effekter" såsom variabla utsugseffektivitet och analyt stabilitet över prover. Tillsats av den interna standarden, (igen, blandning till homogenitet) så tidigt som möjligt i ett experimentellt protokoll minskar potentialen för artefakter. Slutligen, som i något experiment, användningen av flera replikat för varje experimentell betingelse är nödvändig, och om möjligt, Kraft beräkningar baserade på pilotförsök kan vara användbara.
Blodplättar kan snabbt isoleras från enskilda eller sammanställda källor 5,27,32, vilket gör denna metod kan bli föremål för ett stort antal tillämpningar. Det är viktigt att notera att förmågan att utföra studier med både relativ kvantifiering och isotopmärkning möjliggör en mer omfattande karakterisering av en metabola systemet. För närvarande kräver detta två separata analyser, vilket ökar efterfrågan på biomassa som krävs för experimentet. Av denna anledning, blodplättar, som lätt kan erhållas i stort antal, är mer effektiva än andra cellodlingsmodeller.
Trots de många fördelar som följer av användningen av blodplättar, det finns nackdelar. För det första måste man vara försiktig vid valet av humana donatorer eftersom det finns många sjukdomar som påverkar blodplätt fysiologi 25. Dessutom trombocytaktivering under loppet av provetberedning och analys är en potentiell confounding variabel i alla blodplättbaserad analys. Av dessa skäl, samtidig bedömning av markörer av trombocytaktivering genom ELISA 26, flödescytometri 1, eller analyser såsom ljustransmissionen aggregometry (LTA) -analys 34 kan visa sig vara klokt.
Även om föreliggande studie har fokuserat på analys av acyl-CoA-tioestrar, kan detta tillvägagångssätt enkelt utvidgas till att omfatta ett bredare spektrum av analyter. Oriktade metabolomik tillvägagångssätt tillhandahåller mekanistisk insikt i en matris av sjukdomstillstånd 23. Tillämpa sådana oriktade metoder för att trombocyter modeller kommer sannolikt att ge ytterligare insikt i de underliggande biokemiska mekanismer som är involverade i oreglerad cellulär metabolism.
Detta tillvägagångssätt kan lätt utvidgas till att omfatta undersökningar av andra kemikalier i miljön och läkemedel som är kända för att störa mitokondriell metabolism 6,12,18,31 samt ett system för att testa effekterna av xenobiotika som potentiella modulatorer av CoA metabolism 10. Dessutom kan användas i allmän strategi för att studera metaboliska defekter i genetiska sjukdomar såsom Friedreichs ataxi 5,32. Dessutom någon av de ovannämnda experimentell design kan kopplas till en funktionell andning analys för att mer kraftfullt karakterisera tillståndet av mitokondrier i varje sammanhang 2. Sålunda är det sannolikt att ge nya möjligheter att ytterligare karakterisera avvikande mitokondriell metabolism koppling stabila isotoper och LC-MS-analys med metaboliska studier i isolerade blodplättar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner stöd av NIH bidrag P30ES013508 och T32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
