Summary
نحن هنا تظهر الصفائح الدموية البشرية معزولة يمكن استخدامها بوصفها الوصول فيفو السابقين نموذج لدراسة التعديلات التمثيل الغذائي ردا على مجمع أنا المانع روتينون. هذا النهج يعمل تتبع النظائر وتقدير نسبي من قبل السائل الطيف اللوني الشامل ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من التصاميم الدراسة.
Introduction
وقد تورط استقلاب الميتوكوندريا المختلة وظيفيا في مجموعة واسعة من الأمراض بما فيها التنكس العصبي، والسرطان، وأمراض القلب والأوعية الدموية 30. على هذا النحو، وقد انصب جهد كبير على تميز عيوب التمثيل الغذائي التي تسهم في التسبب بالمرض. يعتبر السائل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) المعيار الذهبي لتقدير حجم التحاليل من مصفوفات بيولوجية معقدة، وغالبا ما تستخدم للدراسات التمثيل الغذائي 8. لكن، وكما هو الحال مع الدراسات الطبية الحيوية، وتحقيق نموذج للوصول واضحة المعالم ذات الصلة إلى الأمراض التي تصيب البشر في كثير من الأحيان هو التحدي.
العديد من الدراسات توظف تحويل نماذج الخلوية لبحث تأثير الاكسيوبيوتك أو خلل وراثي في استقلاب الخلايا 7،9. إعادة برمجة التمثيل الغذائي الذي يحدث في الخلايا السرطانية يمكن أن يعرض الخلط عوامل 21، وبالتالي ليست مثالية. ويمكن لهذه القضايا أن يكون circumvented مع نماذج الخلية الأولية، على الرغم من أن الحصول على الكتلة الحيوية ما يكفي لتحليل التمثيل الغذائي يمكن أن يكون تحديا. وعلاوة على ذلك، تم تسليط الضوء على تأثير كميات عالية من المضادات الحيوية المستخدمة في الثقافة باعتبارها دراسات الميتوكوندريا يحتمل الخلط 16.
الصفائح الدموية البشرية تحمل الفرصة للاستفادة من نموذج الخلية الأولية مع محتوى الميتوكوندريا كافية للدراسات التمثيل الغذائي 5،22،27،32. أولا، الصفائح الدموية ويمكن الحصول عليها بسهولة، من خلال توجه الدم من المتبرعين الفردية، أو بكميات كبيرة من بنوك الدم، وبالتالي تقدم نموذجا في العوامل الخارجية التي يمكن السيطرة عليها بسهولة. ثانيا، نظرا لصغر حجمها، والصفائح الدموية يمكن عزلها من مكونات الدم الأخرى مع العمل التحضيري الحد الأدنى في مختبرات مجهزة حتى الحد الأدنى 5. وتجدر الإشارة، الصفائح الدموية لا تحتوي على نواة، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة تعديلات على عملية التمثيل الغذائي بشكل مستقل من تنظيم النسخي. نحن هنا تبين أنبالإضافة إلى تقدير النسبي (لجنة الزراعة) ثيو إستر أسيل-أنزيم، ونظام الصفائح الدموية معزولة يمكن استخدامها لدراسة التمثيل الغذائي الكربون. على وجه التحديد، ونحن التقرير استخدام العلامات الأيض مع النظائر المستقرة (غير المشعة) المسمى [13 C 6] -glucose و[13 C 16] -palmitate للتحقيق إدماج [13 C] -label في acetyl- الأيض مهم لجنة الزراعة عن طريق تحلل أو أكسدة الأحماض الدهنية. وهذا يوفر منصة قوية، للتعميم، وتنوعا نظرا لمشاركة واسعة من الأنواع أسيل، لجنة الزراعة في المسارات البيوكيميائية 13،24 وقابلية الإستطراق من هذا النظام لاختبار المتغيرات الأخرى، مثل تثبيط أنا معقدة مع روتينون 3،33. بالإضافة إلى المعلومات المنصوص عليها في البروتوكول أدناه، وصفا واسعة من الأساليب المستخدمة لوضع العلامات النظائر والتحليلات تستند LC-MS-يمكن العثور عليها في باسو وبلير 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أخلاقيات الإعلان: جميع البروتوكولات المتعلقة بمعاملة العينات البشرية اتباع المبادئ التوجيهية من جامعة بنسلفانيا جنة أخلاقيات البحوث البشرية.
1. إعداد المخازن و100X الحلول المالية
- إعداد 1 لتر من العازلة قاعدة تايرود. الجمع بين 8.123 غرام كلوريد الصوديوم، 1.428 غرام NaHCO 3، 0،466 جم CaCl 2 ∙ 2 H 2 O، 0.224 غرام بوكل، و0.095 ز MgCl 2. ضبط الحجم الإجمالي إلى 1 لتر مع DDH 2 O. فلتر تعقيم العازلة قاعدة تايرود.
- إعداد الحلول الأسهم 100X من الجلوكوز وحمض البالمتيك. ل100X الحلول الأسهم الجلوكوز، حل 100 ملغ جلوكوز أو [13 C 6] -glucose في 1 مل من ده 2 O. عن حلول بالميتات 100X، ويحل 2.56 ملغ من حمض البالمتيك أو 2.72 ملغ من [13 C 16] حامض -palmitic في 1 مل من الايثانول. فلتر تعقيم 100X الحلول الأسهم.
- إعداد المخازن المناسبة المخصب تايرود
- للدراسات العلامات الجلوكوز، إضافة 1 مل من 100X [13 C 6] حل الأسهم -glucose و 1 مل من 100X البالمتيك المحلول حامض الى 98 مل من العازلة قاعدة تايرود.
- للدراسات حمض البالمتيك وصفها، إضافة 1 مل من 100X الجلوكوز حل سهم و 1 مل من [13 C 16] -palmitic المحلول حامض الى 98 مل من العازلة قاعدة تايرود.
- إعداد ملي حل الأسهم 10 من روتينون في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]).
- للدراسات الجرعة والاستجابة غير وسم، انتقل إلى 1.4.3. لدراسات وضع العلامات في جرعة واحدة، انتقل إلى 1.4.5.
- إجراء التخفيف المتسلسل للسهم روتينون 10 ملم في DMSO للحصول على حلول مع تركيزات روتينون تتراوح ما بين 1 نانومتر إلى 100 ميكرومتر. هذه هي 100X الأسهمالصورة.
- إضافة 50 ميكرولتر من كل الأسهم إلى 5 مل من العازلة قاعدة تايرود + الجلوكوز + حمض البالمتيك من 1.3.1 لإعداد حلول مع تركيزات روتينون بدءا من 22:00 إلى 1 ميكرومتر. بدلا من ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من DMSO لتكون بمثابة السيطرة على السيارة. المضي قدما إلى 2.1.
- تمييع 10 ملي حل الأسهم 1000 أضعاف في DMSO للحصول على حل العمل 10 ميكرومتر.
- إضافة 50 ميكرولتر من هذه الأسهم إلى 5 مل كل من العازلة قاعدة تايرود + [13 C 6] -glucose + حمض البالمتيك من 1.3.2 وقاعدة عازلة تايرود + الجلوكوز + [13 C 16] حامض -palmitic من 1.3.3. التركيز النهائي هو 100 نانومتر روتينون. بدلا من ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من DMSO لكل عازلة لتكون بمثابة الضوابط السيارة.
2. صفائح الدم العزلة
ملاحظة: هذه الطريقة غير قابلة للالصفائح الدموية المستمدة إما من الدم الكامل أو من أكياس الصفائح الدموية. تم إعداد البيانات الواردة سبيل المثالباستخدام الصفائح الدموية المستمدة من أكياس الصفائح الدموية. يرجى الاطلاع باسو وآخرون. (5) لمزيد من التفاصيل حول استخدام الصفائح المعزولة من الدم الكامل.
- عزل الصفائح الدموية من الدم الكامل
ملاحظة: إذا عزل الصفائح الدموية من كيس من الصفائح الدموية، انتقل إلى 2.2.1.- الطرد المركزي الدم كله في 175 ز س لمدة 15 دقيقة مع عدم وجود فرامل.
- نقل 1 مل من البلازما الغنية بالصفائح الدموية العلوي (PRP) طبقة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- الطرد المركزي PRP في 400 ز س لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف وانتقل إلى الخطوة 3.1 أو 3.2.
- عزل الصفائح الدموية من حقيبة صفائح الدم
- نقل 1 مل من تعليق الصفائح الدموية إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- الطرد المركزي تعليق في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف وانتقل إلى الخطوة 3.1. أو 3.2.
3. إجراء تقييم للتجربة
- لتحديد تأثير أجنبي بيولوجياالعلاج (على سبيل المثال، روتينون) على مستويات التمثيل الأيضي من الفائدة (على سبيل المثال، أسيتيل التميم)، انتقل إلى 3.1.1. لتحديد تأثير أجنبي بيولوجيا (على سبيل المثال، روتينون) على إدماج تمهيدا الأيض في المستقلب المصب من الفائدة، والمضي قدما إلى 3.2.1.
- لا تستخدم أي مكررات البيولوجية أقل من ثلاثة لكل حالة، و resuspend الصفائح الدموية بيليه من الخطوة 2.1.4 أو 2.2.3 في 1 مل من كل حل من خطوة 1.4.4.
- احتضان الصفائح الدموية معلق في CO 2 حاضنة تغلف المياه المقرر أن الرطوبة 95٪، 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. انتقل إلى الخطوة 4.1
ملاحظة: نحن هنا وصف تجربة الاستجابة للجرعة. بدلا من ذلك، يمكن أن يتم دورة التجربة المرة التي تم فيها تثبيت الجرعة وتفاوتت مدة الحضانة بدلا من ذلك.
- لتحديد تأثير العلاج أجنبي بيولوجيا على إدماج تمهيدا الأيض في المستقلب المصب من الفائدة.
- Uالغناء ما لا يقل عن ثلاثة مكررات البيولوجية لكل حالة، و resuspend الصفائح الدموية بيليه من الخطوة 2.1.4 أو 2.2.3 في 1ml من كل صياغة عازلة تايرود المسمى من الخطوة 1.4.6.
- احتضان الصفائح الدموية معلق في CO 2 حاضنة تغلف المياه المقرر أن الرطوبة 95٪، 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. انتقل إلى الخطوة 4.1.
4. تسقيه والتميم استخراج
- بيليه الصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 3 دقائق.
- نضح طاف.
- الصفائح الدموية resuspend في 750 ميكرولتر الجليد الباردة حمض الخليك ثلاثي الكلور 10٪ (ث / ت).
- إضافة مستقر معيار داخلي مناسب المسمى النظير. على سبيل المثال، إذا كان الهدف هو مقارنة مستويات الأنواع جنة الزراعة عبر عينات، استخدم 100 ميكرولتر من خليط من المستقر النظائر المسمى ثيو إستر لجنة الزراعة تم الحصول عليها من الخميرة كما هو موضح سابقا (SILEC تقنية) 29.
- نبض يصوتن كل عينة 30 مرات مع نبضات 0.5 ثانية.
- عينات الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- يلصق C18 الصلبة مرحلة الاستخراج (SPE) أعمدة لمشعب فراغ.
- حالة الأعمدة مع الميثانول 1 مل.
- تتوازن الأعمدة مع 1 مل ده 2 O.
- تشغيل المستمدة من عينة طاف (حوالي 850 ميكرولتر في هذه الحالة) من خلال الأعمدة.
- غسل الأعمدة مع الماء 1 مل.
- تحميل 10 مل أنابيب زجاجية أجهزة الطرد المركزي في مشعب فراغ لجمع شطف الكسر.
- أزل الأعمدة مع 1 مل من خلات الأمونيوم 25 مم في الميثانول.
- شطافة الجافة تحت غاز النيتروجين.
- و resuspend بقايا المجففة في 50 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) وحامض 5 السلفوساليسيليك ونقل إلى قارورة HPLC.
الإعداد 5. HPLC
- باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لنظام HPLC، إنشاء أسلوب مع الظروف HPLC الأمثل لالتحاليل المستهدفة والعمود المستخدمة، كما هو موضح في الجدول رقم 1.
ملاحظة: temperat العمودكان لدى عودتهم المستخدمة لتوليد هذه البيانات 25 درجة مئوية ولكن سوف تختلف معايير محددة من قبل الصك وفيما يتعلق المركبات من الفائدة. لأسيل، لجنة الزراعة الكميات، تم الإبلاغ عن أساليب متعددة للتحليل LC-MS، والتحقق من صحتها عن التحاليل المختلفة في مختلف الظروف LC 14،19،20. - السماح للHPLC لكي تتوازن على نحو كاف.
ملاحظة: يجب أن تشمل كلا من فتيلة من المذيبات قبل ربط العمود وموازنة العمود في الظروف المذيبات انطلاق لهذه الطريقة. حجم موازنة يجب أن يتبعوا إرشادات الشركة المصنعة، ويجب أن يتم تحويل الناتجة النفايات السائلة للنفايات.
ملاحظة: استشر باسو وبلير (5) لمزيد من التفاصيل حول إعدادات HPLC.
الإعداد 6. مطياف الكتلة
- باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لمطياف الكتلة، إنشاء أسلوب المستهدفة للكشف عن أشكال المتأينة من المركبات ذات الأهمية. وتعرض المعلماتفي الجدول 2.
ملاحظة: يجب أن تستخدم نظائرها النظائر المستقرة لهذه المركبات لتحديد ما إذا كان وضع إيجابي أو سلبي يعطي حساسية فائقة ولتحسين المصدر وحالة البصريات للكشف عنها. الوقت الكشف الكامل للطريقة مطياف الكتلة يجب أن تتوافق مع المكون وقت طريقة HPLC المرتبطة بها.
ملاحظة: كما ذكر سابقا، وقد تم الإبلاغ عن أساليب متعددة للتحليل أسيل، لجنة الزراعة، بما في ذلك الإيجابية والسلبية 14 التأين 15 وسائط واستخدام دقة عالية مطياف الكتلة 17 بدلا من أداة الثلاثي رباعية 28. - نظيفة ومعايرة الصك، ووضع رذاذ مستقرة في مطياف، وإتاحة الوقت من أجل حل المعايرة لتبديد كاف من المصدر والبصريات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إنشاء تسلسل لجميع العينات مع برنامج حاسوبي لمراقبة مطياف الكتلة. Incluإزالة اسم أو معرفات رقمية، وبيان حجم الحقن وأداة الطريقة المناسبة. تشغيل فارغة قبل العينة الأولى، وتشغيل الفراغات ويغسل أخرى بين العينات حسب الحاجة لتخفيف المرحل أو مصفوفة الآثار.
ملاحظة: طريقة معالجة لذروة التكامل من الاستشرابية السائل التحاليل المختارة كثير من الأحيان يمكن أن تحدد ضمن هذا التسلسل أو تطبيقها في معالجة البيانات في وقت لاحق. - بدء تسلسل ومراقبة الطيف وHPLC النظام الشامل بشكل دوري لمشكلات، منها تقلبات الضغط أو فشل النظام وفقدان كثافة إشارة أثناء التشغيل.
ملاحظة: مشاكل حادة أو الفشل المدى المستمرة قد تتطلب وقف تشغيل وتطهير وإعادة توازنه النظام HPLC وكذلك تنظيف ومعايرة مطياف الكتلة. استشارة باسو وبلير 5 لمزيد من التفاصيل بشأن MS إعدادات ومعالجة البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإثبات فائدة هذه المنهجية قمنا مستنسخة إمكانية تعميم سبق وصفها التكيف الأيضي التعويضية الناجمة عن التعرض لروتينون. وقد تم تحديد هذه النتيجة سابقا في نماذج ثقافة الخلية ويهدف هذا التحقيق لاختبار إذا حدث هذا التحول الأيضي أيضا في الصفائح الدموية، والتي هي عديم النواة وليس عرضة للنفس الاعمال الفنية التجريبية كثقافة الخلية. تم تنفيذ هذا العمل مع الصفائح القديمة لمدة 6 أيام، من مركز الحوادث بن، الذي كان قد تعتبر قديمة جدا للتسريب البشري، على الرغم من أنها احتفظت نشاطهم الأيض. تم إجراء العزل كما هو مبين في الشكل رقم 1، وسير العمل الكلي يمكن زيادتها بسهولة من عدد محدود من عينات سريرية أو الظروف التجريبية لسرعة أعلى لوحة 96-جيدا مقرها مع توافر الصفائح الدموية التي لم تعد مفيدة للتسريب في المرضى.
ther.within الصفحات = "1"> أعلنت مجموعة لدينا سابقا التغييرات في المستويات النسبية للثيو إستر أسيل، لجنة الزراعة ردا على روتينون في خطوط الخلايا التي يفترض أن تنجم عن تثبيط معقدة الأول (الشكل 2). على وجه التحديد لاحظنا في الخلايا SH-SY5Y انخفاض تعتمد الجرعة في succinyl، لجنة الزراعة (IC 50 = 25 نانومتر) مع زيادة متزامنة في β-hydroxybutyryl (HB) -CoA (ED 50 = 75 نانومتر)، في حين أن مستويات أسيتيل التميم لم تتغير 1. كشف تحليلنا الصفائح الدموية البشرية تعامل مع روتينون النتائج متسقة للغاية (الشكل 3). وهذا يوفر مجموعة فريدة من البيانات التجريبية في الصفائح الدموية البشرية لافتا إلى الاعتماد الميتوكوندريا من الاستجابة لروتينون. لا يمكن بوساطة هذه الاستجابة من خلال آليات النسخي التقليدية لأن الصفائح الدموية تفتقر نوى.
يوفر الكمي النسبي بعد واحد من المعلومات التمثيل الغذائي، ولكنيوفر وضع العلامات النظائر رؤية متكاملة لا تقدر بثمن في النشاط من المسارات الأيضية محددة. هذا أمر بالغ الأهمية في دراسات التمثيل الغذائي لمسارات متعددة قد تتلاقى من خلال وسيط واحد. لإثبات هذه النقطة، تم علاج الصفائح الدموية مع أي 100 روتينون نانومتر أو DMSO في وجود إما [13 C 6] -glucose أو [13 C 16] -palmitate لمدة 1 ساعة. شارك في شطف من isotopologues من أسيل-شهادات توثيق البرامج من العمود LC يسمح للتقرير النهائي للتركيبة النظائر في التحاليل (الشكل 4). بعد تصحيح لوفرة الطبيعية من النظائر الثقيلة كما هو موضح 11 أظهر هذا النهج انخفاض ملحوظ في إنتاج حال السكر من أسيتيل التميم في الصفائح الدموية في حين تم زيادة التأسيس بالميتات بشكل ملحوظ (الشكل 5). هذه النتائج مشابهة لتلك التي لوحظت من قبل في نموذج زراعة الخلايا SH-SY5Y 33 وحتى توفير ر أدلة إضافيةقبعة يمكن أن يكون هذا المسار المهم في الجسم الحي.
| الوقت (دقيقة) | 0 | 0 | 15 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| إجمالي التدفق (ميكرولتر / دقيقة) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| ٪ ا | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| ٪ ب | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| ٪ C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
الجدول 1. اللوني السائل التدرج المذيبات ج: 5 ملي الأمونيوم خلات في المياه، المذيبات ب: 5 ملي الأمونيوم خلات في 95: 5 إيه سي / المياه المذيبات C: 80:20 إيه سي / المياه 0.1٪ حمض الفورميك
| معامل | القيمة |
| رذاذ الجهد (V) | 4000 |
| مبخر درجة الحرارة (° C) | 400 |
| الضغط غمد الغاز | 35 |
| مساعد ضغط الغاز | 10 |
| شعري درجة الحرارة (° C) | 350 |
| أنبوب عدسة أوفست (V) | 100 |
الجدول 2. مطياف الكتلة معلمات.
الشكل 1. المعمم سير العمل لإعداد وتحليل عينة. هذا تخطيطي يصور العمل لعزل الصفائح الدموية وعلاج للدراسات التمثيل الغذائي عن طريق تحليل LC-MS / MS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. نظام التمثيل الغذائي للجلوكوز والدهون الأيض وسلسلة نقل الإلكترون. يمكن توليفها أسيتيل التميم إما من الجلوكوز أو بالميتات. روتينون يمنع مكوكية السليم من الإلكترونات في الميتوكوندريا أولا معقدةTPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الكميات من لجنة الزراعة-ثيو إستر في الاستجابة للعلاج روتنون. روتنون لا تؤثر على مستويات أسيتيل التميم ولكن يؤدي الى انخفاض تعتمد على الجرعة في succinyl، لجنة الزراعة (IC 50 = 4.1 نانومتر) مع زيادة مصاحبة في βHB، لجنة الزراعة (ED 50 = 4.2 نانومتر). تمثل أشرطة الخطأ خطأ المعياري للمتوسط (SEM)؛ ن = 4. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الممثل الاستشرابية عرض النظائر وصفها من بالميتاتإلى أسيتيل التميم. العلاج روتنون يزيد من إدماج بالميتات إلى أسيتيل التميم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. التأسيس النسبي لل[13 C 6] -glucose أو [13 C 16] -palmitate إلى العلاج أسيتيل التميم. روتنون يقلل الجلوكوز إدماجها أسيتيل التميم ويزيد بالميتات التأسيس. أشرطة الخطأ تمثل SEM. ن = 4. النجمية دلالة ف <0.05 (الطالب أونبايريد اختبار t). الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا أثبتنا فائدة الصفائح المعزولة كمنصة لدراسة مضطرب استقلاب الميتوكوندريا. على وجه التحديد، فقد تميزت التكيف الأيضي ردا على تثبيط أنا معقدة من روتينون.
وسعت الدراسة النتائج ذكرت سابقا حول دور تثبيط أنا معقدة من روتينون في خطوط الخلايا إلى الصفائح الدموية البشرية. الأهم من ذلك، فقد كشف هذا أن تشكيل روتينون منعت أيضا الصفائح الدموية succinyl، لجنة الزراعة، حفز زيادة في الصفائح الدموية βHB، لجنة الزراعة ولم يكن لها تأثير على مستويات الصفائح الدموية من أسيتيل التميم.
يجب أن تؤخذ بعناية كبيرة لضمان صحة واستنساخ أي تحليل من هذا النوع. إذا الصفائح الدموية هي أن تكون معزولة من الدم الكامل، ينبغي أن العزلة المضي قدما بالضبط كما هو موضح أعلاه، من أجل منع التلوث اللمفاويات وتنشيط صفائح الدم، مع إيلاء اهتمام خاص المكرسة لترك معطف الشهباء التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية undisturbed. من أجل منحنيات الاستجابة للجرعة لتكون ذات مغزى، يجب إجراء التخفيفات المسلسل على وجه التحديد، مع خلط للتجانس في كل خطوة. بعد إعادة تعليق الصفائح الدموية، يجوز تعديل شروط الحضانة من تلك المفصلة أعلاه، ولكن يجب أن تكون موحدة بدقة عبر مجموعات العلاج بحيث تسمح بإجراء مقارنات ذات مغزى في هذا الشأن. ولعل أهم خطوة في أي تحليل LC الكمي / يستند إلى MS-هو استخدام مستقر-النظائر المعايير الداخلية المسمى.
استخدام المعايير الداخلية أمر بالغ الأهمية في هذا الإطار لأنه يحمي من المحتمل التباس "الآثار دفعة" مثل كفاءة استخراج متغير والاستقرار تحليلها عبر العينات. إضافة معيار داخلي، (مرة أخرى، وخلط للتجانس) في أقرب وقت ممكن في بروتوكول تجريبي يقلل من احتمال القطع الأثرية. وأخيرا، كما هو الحال في أي تجربة، واستخدام متعددة مكررات لكل حالة تجريبية أمر ضروري، وإذا كان ذلك ممكناقد تكون حسابات القوة القائمة على التجارب الرائدة مفيد.
الصفائح الدموية يمكن أن تكون معزولة بسرعة من مصادر فردية أو مجمعة 5،27،32، مما يجعل هذا النهج قابلة للمجموعة واسعة من التطبيقات. من المهم أن نلاحظ أن القدرة على إجراء دراسات تشمل كلا الكمي النسبي ووضع العلامات النظائر يسمح لتوصيف أكثر شمولا لنظام التمثيل الغذائي. حاليا، وهذا يتطلب تحليلين منفصلة، مما يزيد من الطلب على الكتلة الحيوية المطلوبة للتجربة. لهذا السبب، الصفائح الدموية، والتي يمكن الحصول عليها بسهولة في أعداد كبيرة، هي أكثر كفاءة من النماذج ثقافة الخلية الأخرى.
ومع ذلك، على الرغم من العديد من المزايا التي يمنحها استخدام الصفائح الدموية، هناك عيوب. أولا، يجب توخي الحذر في اختيار من المانحين الإنسان لأن هناك العديد من الاضطرابات التي تؤثر على الصفائح الدموية علم وظائف الأعضاء 25. وبالإضافة إلى ذلك، تنشيط صفائح الدم خلال عينةإعداد وتحليل متغير التباس محتمل في أي فحص القائم على الصفائح الدموية. لهذه الأسباب، وتقييم ما يصاحب ذلك من علامات تنشيط صفائح الدم التي ELISA 26، وتدفق الخلوي 1، أو المقايسات مثل ضوء انتقال قياس التكدس (CLS) فحص 34 قد يكون من الحكمة.
على الرغم من أن الدراسة ركزت على تحليل ثيو إستر-أسيل جنة الزراعة، فإن هذا النهج يمكن توسيعها بسهولة لتشمل مجموعة واسعة من التحاليل. النهج الايض غير المستهدفة وتقديم رؤية الميكانيكية في مجموعة من الحالات المرضية 23. تطبيق هذه المناهج غير مستهدفة لتراكم الصفائح ونماذج من المرجح أن توفر نظرة إضافية في آليات الكيمياء الحيوية الكامنة تشارك في الأيض الخلوي dysregulated.
هذا النهج يمكن توسيعها بسهولة لتشمل التحقيقات الكيماويات والعقاقير البيئية الأخرى المعروفة لتتداخل مع استقلاب الميتوكوندريا 6،12،18،31 وكذلك نظام لاختبار آثار الاكسيوبيوتك كما جهري المحتملة لعملية التمثيل الغذائي التميم 10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام النهج العام لدراسة عيوب التمثيل الغذائي في الأمراض الوراثية مثل رنح فريدريك 5،32. وعلاوة على ذلك، أي من التصاميم التجريبية المذكورة أعلاه يمكن أن يكون مقرونا فحص التنفس وظيفية من أجل تميز أكثر بقوة الدولة من الميتوكوندريا في كل سياق 2. وهكذا، اقتران نظائر مستقرة وتحليل LC-MS مع دراسات التمثيل الغذائي في الصفائح المعزولة من المرجح أن تتيح فرصا جديدة لمزيد من تميز استقلاب الميتوكوندريا الشاذة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
ونحن نعترف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30ES013508 وT32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
