Summary
Hier zeigen wir isolierten menschlichen Blutplättchen kann als zugänglich ex vivo - Modell verwendet werden metabolische Anpassungen in Antwort auf den Komplex I Rotenon Inhibitor zu studieren. Dieser Ansatz beschäftigt Isotopenverfolgung und relative Quantifizierung durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und kann auf eine Vielzahl von Studiendesigns angewendet werden.
Introduction
Dysfunctional mitochondrialen Stoffwechsel wurde in einer Vielzahl von Krankheiten , einschließlich Neurodegeneration, Krebs und Herz - Kreislauferkrankungen 30 gebracht. Als solche große Anstrengungen unternommen, auf die Charakterisierung metabolische Defekte wurden platziert, die Pathogenese der Erkrankung beitragen. Flüssigchromatographie-Tandem - Massenspektrometrie (LC-MS / MS) ist der Goldstandard für die Quantifizierung von Analyten aus komplexen biologischen Matrizen betrachtet und wird häufig für metabolische Studien beschäftigt 8. Doch wie es oft der Fall mit biomedizinischen Studien, eine leicht zugängliche und gut definierte Modell relevant für die menschliche Krankheit zu erreichen, ist eine Herausforderung.
Viele Studien beschäftigen für die Erforschung der Wirkung von Xenobiotika oder genetische Anomalien auf den Zellstoffwechsel 7,9 zellulären Modellen umgewandelt. Die metabolische Neuprogrammierung , die in Krebszellen auftritt , kann confounding einzuführen Faktoren 21 und sind daher nicht ideal. Diese Probleme können sein circumvented mit primären Zellmodellen, obwohl sich eine ausreichende Biomasse für metabolische Analysen kann eine Herausforderung sein. Darüber hinaus verwendet die Auswirkungen der hohen Mengen an Antibiotika in der Kultur wurde als potentiell verwirrende mitochondrialen Studien 16 hervorgehoben.
Menschliche Blutplättchen die Chance zu einer primären Zellmodell mit ausreichender mitochondrialen Inhalt für metabolische Studien 5,22,27,32 zu nutzen. Erstens können Blutplättchen leicht erworben werden, durch Blut von einzelnen Spendern anfertigt oder in großen Mengen von Blutbanken und bieten daher ein Modell, in dem externe Faktoren leicht gesteuert werden. Zweitens, die aufgrund ihrer geringen Größe, Plättchen kann leicht von anderen Blutbestandteilen mit minimaler Vorbereitungsarbeiten auch nur minimal ausgestatteten Labors 5 isoliert werden. unabhängig von der Transkriptionsregulation der Anmerkung, Blutplättchen enthalten keine Kerne und kann daher verwendet werden, Änderungen an den Stoffwechsel zu studieren. Hier zeigen wir, dassZusätzlich zur relativen Quantifizierung der Acyl-Coenzym A (CoA) Thioester kann das isolierte Thrombozyten-System verwendet werden Kohlenstoffmetabolismus zu untersuchen. Insbesondere stellen wir die Verwendung von metabolischer Markierung mit stabilen Isotopen (nicht radioaktiv) markiert [13 C 6] -Glucose und [13 C 16] -Palmitat Sonde Einbau des [13 C] -markierten in den wichtigen Metaboliten acetyl- CoA durch Oxidation Glykolyse oder Fettsäure. Dies bietet eine leistungsstarke, verallgemeinerbar und vielseitige Plattform auf Grund der umfangreichen Beteiligung von Acyl-CoA - Spezies in biochemischen Wege 13,24 und die Lenkbarkeit dieses Systems zu testen anderen Variablen, wie die Hemmung der Komplex I mit Rotenon 3,33. Zusätzlich zu den Informationen im Protokoll unten vorgesehen ist , eine ausführliche Beschreibung der Methoden zur Isotopenmarkierung verwendet und für die LC-MS-basierte Analysen in Basu und Blair 4.
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Protocol
Ethikerklärung: Alle Protokolle, die die Behandlung von menschlichen Proben über folgen den Richtlinien der University of Pennsylvania des Komitees Forschung mit menschlichen Ethik.
1. Herstellung von Puffern und 100x Stammlösungen
- Bereiten Sie 1 l Basis Tyrode-Puffer. Kombinieren 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO 3, 0,466 g CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g KCl und 0,095 g MgCl 2. Stellen Sie ein Gesamtvolumen von 1 l mit ddH 2 O. Filter sterilisieren Basis Tyrode-Puffer.
- Bereiten Sie 100x Stammlösungen von Glukose und Palmitinsäure. Für 100x Glucose - Stammlösungen auflösen 100 mg Glucose oder [13 C 6] -Glucose in 1 ml ddH 2 O. Für 100x Palmitat Lösungen, 2,56 mg Palmitinsäure oder 2,72 mg [13 C 16] -palmitic Säure in 1 ml Ethanol lösen. Filter sterilisieren 100x Stammlösungen.
- Bereiten Geeignete Enriched Tyrode-Puffer
- Für Glukose Markierungsstudien, 1 ml 100x [13 C 6] -Glucose Stammlösung und 1 ml 100x Palmitinsäure Stammlösung zu 98 ml Basis Tyrode-Puffer.
- Für Palmitinsäure Studien Kennzeichnung Säure, 1 ml 100x Glucose - Stammlösung und 1 ml [13 C 16] -palmitic Säure - Stammlösung auf 98 ml Basis Tyrode-Puffer.
- Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Rotenon in Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Für Nicht-Kennzeichnung Dosis-Wirkungs-Studien, auf 1.4.3 gehen. Für die Kennzeichnung Studien in einer einzelnen Dosis, fahren Sie mit 1.4.5.
- Führen Sie eine serielle Verdünnung der 10 mM Rotenon Lager in DMSO-Lösungen mit Rotenon Konzentrationen von 1 nM bis 100 & mgr; M bis hin zu erhalten. Dies sind 100x Lagers.
- In 50 ul jeder Aktie zu 5 ml Basis Tyrode-Puffer + Glukose + Palmitinsäure aus 1.3.1 Lösungen mit Rotenon Konzentrationen von 10.00 Uhr bis 1 & mgr; M bis hin vorzubereiten. Alternativ werden 50 & mgr; l DMSO als Vehikel Kontrolle zu dienen. Fahren Sie mit 2.1.
- Verdünne die 10 mM Stammlösung 1000-fach in DMSO 10 & mgr; M-Arbeitslösung zu erhalten.
- In 50 ul dieser Lager zu je 5 ml Basis Tyrode-Puffer + [13 C 6] -Glucose + Palmitinsäure aus 1.3.2 und Basis Tyrode-Puffer + Glukose + [13 C 16] -palmitic Säure aus 1.3.3. Die Endkonzentration beträgt 100 nM Rotenon. Alternativ werden 50 & mgr; l DMSO zu jedem Puffer als Fahrzeugsteuerungen zu dienen.
2. Platelet Isolation
Hinweis: Diese Methode an Blutplättchen von entweder Vollblut oder aus Blutplättchen Taschen abgeleitet zugänglich ist. Die Beispieldaten enthalten sind hierin hergestelltVerwendung von Thrombozyten-Taschen abgeleitet Blutplättchen. Bitte beachten Sie Basu et al. 5 weitere Einzelheiten bezüglich Blutplättchen isoliert aus Vollblut verwendet.
- Platelet-Isolierung aus Vollblut
HINWEIS: Wenn Plättchen aus einem Beutel von Blutplättchen, gehen Sie auf 2.2.1 zu isolieren.- Zentrifuge Vollblut bei 175 x g für 15 min ohne Bremse.
- 1 ml der oberen plättchenreiches Plasma (PRP) -Schicht in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie das PRP bei 400 x g für 5 min.
- Überstand entfernen und gehen 3.1 oder 3.2 zu treten.
- Platelet-Isolierung aus einer Platelet-Tasche
- 1 ml der Blutplättchensuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Suspension bei 400 xg für 5 min.
- Überstand entfernen und gehen 3,1 Schritt. oder 3.2.
3. Durchführung eines Tests
- Um die Wirkung von xenobiotischen bestimmen,Behandlung (zB Rotenon) auf dem Niveau eines Metaboliten von Interesse (zB Acetyl-CoA), 3.1.1 fortfahren. Um die Wirkung einer xenobiotischen (z. B. Rotenon) auf dem Einbau eines metabolischen Vorläufers in einem nachgeschalteten Metaboliten von Interesse zu bestimmen, gehen zu 3.2.1.
- Mit nicht weniger als drei biologischen Replikaten für jede Bedingung, resuspendieren Blutplättchen-Pellet aus Schritt 2.1.4 oder 2.2.3 in 1 ml jeder Lösung aus Schritt 1.4.4.
- Inkubieren resuspendierten Blutplättchen in einem mit Wassermantel CO 2 Inkubator auf 95% Feuchtigkeit, 5% CO 2 und 37 ° C für 1 Stunde. Gehen Sie zu Schritt 4.1
Hinweis: Hier haben wir eine Dosis-Wirkungs-Experiment beschreiben. Alternativ könnte ein Zeitverlaufsexperiment, in dem durchgeführt werden wurde die Dosis festgelegt und die Länge der Inkubation statt variiert wurde.
- Um die Wirkung von xenobiotischen Behandlung auf den Einbau von einem metabolischen Precursor in einen nachgeschalteten Metaboliten von Interesse bestimmen.
- Usingen nicht weniger als drei biologischen Replikaten für jede Bedingung, resuspendieren Blutplättchen-Pellet aus Schritt 2.1.4 oder 2.2.3 in 1 ml jeder Formulierung des Puffers von Tyrode-markierten Schritt 1.4.6.
- Inkubieren resuspendierten Blutplättchen in einem mit Wassermantel CO 2 Inkubator auf 95% Feuchtigkeit, 5% CO 2 und 37 ° C für 1 Stunde. Gehen 4.1 zu treten.
4. Lösch- und CoA-Extraktion
- Pellet Blutplättchen durch bei 3000 × g für 3 min zentrifugiert.
- Überstand entfernen.
- Resuspendieren Blutplättchen in 750 ul eiskalter 10% Trichloressigsäure (w / v).
- In geeigneten stabilen isotopenmarkierten internen Standards. Wenn beispielsweise das Ziel ist , die Ebenen von CoA Spezies in Proben zu vergleichen, verwenden 100 & mgr; l einer Mischung von mit stabilen Isotopen markierten CoA Thioester aus Hefe , erhalten wie zuvor (SILEC Technik) 29 beschrieben.
- Pulse-beschallen jede Probe 30-mal mit 0,5 sec Impulsen.
- Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Affix C18-Festphasenextraktion (SPE) Spalten Vakuumkammer.
- Voraussetzung für die Spalten mit 1 ml Methanol.
- Äquilibrieren die Spalten mit 1 ml ddH 2 O.
- Führen Probe abgeleiteten Überstand (etwa 850 & mgr; l in diesem Fall) durch die Säulen.
- Waschen Sie die Spalten mit 1 ml Wasser.
- Last 10 ml Glaszentrifugenröhrchen in die Vakuumkammer Elutionsfraktion zu sammeln.
- Eluieren der Säulen mit 1 ml 25 mM Ammoniumacetat in Methanol.
- Trockene Eluat unter Stickstoffgas.
- Resuspendieren getrockneten Rückstände in 50 ul 5% (w / v) 5-Sulfosalicylsäure und Transfer in HPLC-Ampullen.
5. HPLC-Setup
- Verwendung der Steuerungssoftware für das HPLC - System erstellen , ein Verfahren mit HPLC - Bedingungen für die Zielanalyten optimiert und verwendeten Säule, wie in Tabelle 1 aufgelistet.
Hinweis: Die Spalte temperature für die Erzeugung dieser Daten war C 25 ° verwendet, aber die spezifischen Parameter nach Instrument variieren und in Bezug auf die Verbindungen von Interesse. Für Acyl-CoA - Quantifizierung wurden mehrere Methoden der LC-MS - Analyse berichtet worden, und für unterschiedliche Analyte in unterschiedlichen LC Bedingungen 14,19,20 validiert. - Lassen Sie die HPLC adäquat zu äquilibrieren.
Hinweis: Dies sollte sowohl die Grundierung von Lösungsmitteln umfassen, bevor eine Spalte und die Äquilibrierung der Säule in den Startlösungsmittelbedingungen für das Verfahren anzubringen. Der Ausgleichsvolumen sollte den Anweisungen des Herstellers folgen, und die daraus resultierende Abwasser sollte Abfall umgeleitet werden.
Hinweis: Bitte Basu und Blair 5 , um weitere Informationen in Bezug auf die HPLC - Einstellungen.
6. Massenspektrometer-Setup
- Mit Hilfe der Steuerungssoftware für das Massenspektrometer, erstellen Sie eine gezielte Methode zur Detektion von ionisierten Formen der Verbindungen von Interesse. Die Parameter werden vorgestelltin Tabelle 2.
Hinweis: Stabil Isotop Analoga dieser Verbindungen verwendet werden sollte, um zu bestimmen, ob ein positiver oder negativer Modus überlegene Empfindlichkeit verleiht und die Quelle und der Optik Bedingung für deren Nachweis zu optimieren. Die Gesamterfassungszeit des Massenspektrometers Verfahren sollte auf die Zeitkomponente der zugehörigen HPLC-Methode entsprechen.
Anmerkung: Wie bereits erwähnt, mehrere Methoden der Acyl-CoA Analyse berichtet worden, einschließlich positive 14 und negative Ionisierung 15 Modi und die Verwendung eines hochauflösenden Massenspektrometer 17 anstelle eines Triple - Quadrupol - Instrument 28. - Sauber und das Instrument zu kalibrieren, stellen Sie eine stabile Spray in das Spektrometer, und genügend Zeit für die Kalibrierungslösung ausreichend von der Quelle abzuleiten und Optik den Anweisungen des Herstellers entsprechend.
- Stellen Sie eine Sequenz für alle Proben mit dem Massenspektrometer Steuerungssoftware auf. include den Namen oder die numerische Kennungen und geben Sie die entsprechende Injektionsvolumen und Instrument-Methode. Führen Sie einen Rohling vor der ersten Probe und führen andere Zuschnitte und Waschungen zwischen den Proben nach Bedarf Verschleppung oder Matrixeffekte zu mildern.
Hinweis: Ein Verarbeitungsverfahren zur Peak-Integration ausgewählter Analyten 'Flüssigkeit Chromatogramme können oft innerhalb dieser Sequenz oder später in der Datenverarbeitung angewendet eingestellt werden. - Beginnen Sie mit der Sequenz und überwachen das Massenspektrometer und HPLC-System regelmäßig für Probleme, einschließlich Druckschwankungen oder Systemausfälle und der Verlust der Signalintensität während des Laufs.
Hinweis: Schwere Probleme oder persistent Lauf Ausfälle erfordern den Lauf und Spülen zu stoppen und neu Äquilibrieren der HPLC-System sowie die Reinigung und Kalibrierung des Massenspektrometers. Consult Basu und Blair 5 , um weitere Informationen über die MS - Einstellungen und Datenverarbeitung.
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Representative Results
Zur Demonstration der Nützlichkeit dieser Methode wir die Verallgemeinerung der zuvor beschriebenen Ausgleichs metabolische Adaptation reproduziert aus der Exposition gegenüber Rotenon. Dieser Befund wurde zuvor in Zellkulturmodelle identifiziert und diese Untersuchung zielte darauf ab, zu testen, ob diese metabolische Verschiebung tritt auch in Blutplättchen, die kernlose und nicht anfällig für den gleichen experimentellen Artefakte wie Zellkultur sind. Diese Arbeit wurde mit 6-Tage alten Plättchen von der Penn Trauma Center durchgeführt, die für die menschliche Infusion zu alt befunden worden war, obwohl sie ihre metabolische Aktivität beibehalten. Die Isolierung wurde , wie in Fig . 1 die Gesamtarbeitsablauf skaliert werden kann , aus einer begrenzten Anzahl von klinischen Proben oder experimentellen Bedingungen auf 96-Well - Platte auf Basis höherer Durchsatz mit der Verfügbarkeit von Blutplättchen, die nicht mehr nützlich für die Infusion in Patienten leicht gezeigt durchgeführt.
(Figur 2) die Hypothese aufgestellt werden. Genauer gesagt haben wir in SH-SY5Y - Zellen eine dosisabhängige Abnahme der Succinyl-CoA (IC 50 = 25 nM) mit einer gleichzeitigen Erhöhung der β-Hydroxybutyryl (HB) -CoA (ED 50 = 75 nM), während die Acetyl-CoA - Spiegel beobachtet waren 1 unverändert. Unsere Analyse der humanen Thrombozyten mit Rotenon behandelt ergab sehr konsistente Ergebnisse (Figur 3). Dies bietet einen einzigartigen Satz von experimentellen Daten in humanen Thrombozyten in die mitochondriale Abhängigkeit der Reaktion auf Rotenon zeigt. Diese Antwort kann nicht durch herkömmliche transkriptionale Mechanismen vermittelt werden, da Blutplättchen Kerne fehlen.
Relative Quantifizierung liefert eine Dimension des metabolischen Informationen, aberIsotopenmarkierung liefert wertvolle komplementäre Einblick in die Aktivität spezifischer Stoffwechselwege. Dies ist entscheidend, in metabolischen Studien, da mehrere Wege durch einen einzigen Zwischen konvergieren. Um diesen Punkt zu demonstrieren, Thrombozyten wurden mit entweder 100 nM behandelt Rotenon oder DMSO in Gegenwart von entweder [13 C 6] -Glucose oder [13 C 16] -Palmitat für 1 Stunde. Co-Elution von Isotopologen von Acyl-CoAs aus der LC - Säule ermöglicht eine endgültige Bestimmung der Isotopenzusammensetzung von Analyten (Abbildung 4). Folgende Korrektur für die natürliche Häufigkeit von schweren Isotopen , wie 11 gezeigt , dieser Ansatz eine signifikante Abnahme der glykolytischen Herstellung von Acetyl-CoA in den Blutplättchen während Palmitat Inkorporation signifikant erhöht wurde (Abbildung 5). Diese Ergebnisse sind ähnlich denen beobachtet zuvor in der SH-SY5Y Zellkulturmodell 33 und so zusätzliche Beweise tHut dieser Weg könnte in vivo von Bedeutung sein.
| Zeit (min) | 0 | 0 | 15 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| Total Flow (ul / min) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % EIN | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % B | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. Tabelle 1. Liquid Chromatography Gradient Solvent A: 5 mM Ammoniumacetat in Wasser, Lösungsmittel B: 5 mM Ammoniumacetat in 95: 5 ACN / Wasser - Lösungsmittel C: 80:20 ACN / Wasser 0,1% Ameisensäure
| Parameter | Wert |
| Spray Spannung (V) | 4000 |
| Verdampfertemperatur (° C) | 400 |
| Mantel Gasdruck | 35 |
| Hilfsgasdruck | 10 |
| Kapillar-Temperatur (° C) | 350 |
| Tubuslinse Offset (V) | 100 |
Tabelle 2. Massenspektrometer Parameter.
Abbildung 1. Generalized - Workflow für die Probenvorbereitung und Analyse. Dieses Schema zeigt den Workflow für die Thrombozyten Isolierung und Behandlung für metabolische Untersuchungen mittels LC-MS / MS - Analyse. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Metabolische Schema von Glucose und Lipidstoffwechsel und der Elektronentransportkette. Acetyl-CoA kann entweder von Glucose oder Palmitat synthetisiert werden. Rotenon hemmt die richtige Pendeln von Elektronen durch mitochondriale Komplex Itps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Quantifizierung von CoA-Thioestern in Antwort auf Rotenon. Rotenon Behandlung nicht Acetyl-CoA - Spiegel beeinflussen jedoch induziert eine dosisabhängige Abnahme in Succinyl-CoA (IC 50 = 4,1 nM) mit einer gleichzeitigen Erhöhung der βHB-CoA (ED 50 = 4,2 nM). Fehlerbalken stellen Standardfehler des Mittelwerts (SEM); n = 4. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Repräsentative Chromatogramme Zeige Isotopenmarkierungs- von Palmitatein Acetyl-CoA. Rotenon Behandlung der Einbau von Palmitat in Acetyl-CoA erhöht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Relative Einbau von [13 C 6] -Glucose oder [13 C 16] -Palmitat in Acetyl-CoA. Rotenon Behandlung verringert Glucose Inkorporation in Acetyl-CoA und erhöht Palmitat Inkorporation. Die Fehlerbalken stellen SEM; n = 4. Sternchen bezeichnen p <0,05 (Student ungepaarten t-Test). Bitte klicken Sie hiereine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier haben wir die Nützlichkeit von isolierten Blutplättchen als Plattform gezeigt für das Studium gestörte mitochondriale Stoffwechsel. Insbesondere haben wir metabolische Anpassung in Antwort auf komplexe I Hemmung durch Rotenon gekennzeichnet.
Die vorliegende Studie wurde erweitert zuvor berichteten Ergebnisse über die Rolle der Komplex I-Hemmung durch Rotenon in Zelllinien menschlichen Blutplättchen. Wichtig ist, dass dies zeigte, dass Rotenon auch inhibierte Plättchen Succinyl-CoA Bildung, eine Zunahme der Plättchen βHB-CoA stimuliert und hatte keine Wirkung auf die Thrombozytenspiegel von Acetyl-CoA.
Große Sorgfalt muss die Gültigkeit und die Reproduzierbarkeit der Analysen dieser Art zu achten. Wenn Blutplättchen aus Vollblut isoliert werden, so sollte die Isolation genau gehen Sie wie oben beschrieben, um Lymphozyten-Kontamination und Thrombozytenaktivierung, mit besonderer Aufmerksamkeit gewidmet Verlassen des Buffy-Coat mit den Lymphozyten UNDIS verhindernstörten. Damit die Dosis-Wirkungs-Kurven genau durchgeführt werden, bei jedem Schritt unter Mischen bis zur Homogenität bedeutungsvoll, serielle Verdünnungen werden müssen. Nach Thrombozyten Resuspension Inkubationsbedingungen können von den oben aufgeführten modifiziert werden, aber sie müssen konsequent in allen Behandlungsgruppen vereinheitlicht werden, um sinnvolle Vergleiche zu ermöglichen gemacht werden. Vielleicht der wichtigste Schritt in jedem quantitative LC / MS-basierte Analyse ist die Verwendung von stabilen Isotopen markierten internen Standards.
Die Verwendung von internen Standards ist von entscheidender Bedeutung in dieser Einstellung, weil es gegen potenziell verwirrende "Batch-Effekte" wie variable Extraktionseffizienzen und Analgtstabilität über Proben schützt. Zugabe des internen Standards (wiederum bis zur Homogenität Mischen) so früh wie möglich in einem Versuchsprotokoll verringert das Potential für Artefakte. Schließlich wird, wie in jedem Experiment, repliziert die Verwendung von mehreren für jede Versuchsbedingung erforderlich ist, und wenn möglich,, Leistungsberechnungen auf Pilotversuchen basieren kann nützlich sein.
Thrombozyten können schnell einzelne oder gepoolte Quellen 5,27,32, so dass dieser Ansatz zugänglich für ein breites Spektrum von Anwendungen isoliert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Fähigkeit, Studien durchzuführen, sowohl relative Quantifizierung und Isotopenmarkierung Beteiligung für eine umfassende Charakterisierung eines metabolischen Systems ermöglicht. Derzeit erfordert dies zwei getrennte Assays, die die Nachfrage nach Biomasse für das Experiment erforderlich erhöht. Aus diesem Grund ist, Thrombozyten, die leicht in großen Stückzahlen erhalten werden können, sind effizienter als andere Zellkulturmodellen.
Trotz der zahlreichen Vorteile, die durch die Verwendung von Plättchen übertragen, gibt es Nachteile. Erstens muss bei der Auswahl von menschlichen Spendern genommen werden , weil es viele Erkrankungen sind , die Blutplättchen - Physiologie beeinflussen 25. Zusätzlich Plättchenaktivierung während des Verlaufs der ProbeVorbereitung und Analyse ist ein potentieller Störfaktoren Variable in jedem platelet-basierten Assay. Aus diesen Gründen ist die gleichzeitige Beurteilung der Marker der Plättchenaktivierung durch ELISA 26, Durchflusszytometrie 1, oder Assays , wie beispielsweise die Lichtdurchlässigkeits Aggregometrie (LTA) -Assay 34 könnte umsichtige beweisen.
Obwohl die vorliegende Studie zur Analyse von Acyl-CoA Thioester konzentriert hat, kann dieser Ansatz leicht eine breitere Palette von Analyten erweitert werden. Ungezielte metabolomics Ansätze bieten mechanistischen Einblick in einer Reihe von Krankheitszuständen 23. Die Anwendung solcher ungezielte Ansätze zur Thrombozyten-Modelle werden wahrscheinlich in dysregulated zellulären Stoffwechsel beteiligt zusätzliche Einblicke in die zugrunde liegenden biochemischen Mechanismen zur Verfügung stellen.
Dieser Ansatz kann leicht mit mitochondrialen Stoffwechsel stören bekannt sind Untersuchungen anderer Umweltchemikalien und Medikamente erweitert werden 6,12,18,31 sowie ein System , um die Wirkung von Xenobiotika als potentielle Modulatoren der CoA - Metabolismus 10 zu testen. Darüber hinaus kann der allgemeine Ansatz verwendet werden , um metabolische Defekte in der genetischen Krankheiten wie Friedreich-Ataxie 5,32 studieren. Außerdem könnte jeder der oben genannten experimentellen Designs mit einem funktionellen Assay Atmungs um gekoppelt sein , um eine robustere den Zustand der Mitochondrien in jedem Rahmen 2 charakterisieren. Somit ist die Kopplung stabile Isotope und LC-MS-Analyse mit metabolischen Untersuchungen an isolierten Blutplättchen wahrscheinlich neue Möglichkeiten zu leisten, weitere anomale mitochondrialen Stoffwechsel zu charakterisieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir erkennen die Unterstützung von NIH Zuschüsse P30ES013508 und T32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
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