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नियंत्रण रेखा एमएस मानव प्लेटलेट्स की विश्लेषण Mitochondrial चयापचय के अध्ययन के लिए एक मंच के रूप

Published: April 4, 2016 doi: 10.3791/53941
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1,2, 2,3, 2,3, 4, 4, 1,2, 5, 1,2
1Center for Cancer Pharmacology, University of Pennsylvania, 2Center for Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania, 3Penn SRP and Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 4Division of Traumatology, Department of Surgery, Critical Care and Acute Care Surgery, University of Pennsylvania, 5A.J. Drexel Autism Institute, Drexel University
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम पृथक मानव प्लेटलेट्स जटिल मैं rotenone अवरोध करनेवाला के जवाब में चयापचय रूपांतरों का अध्ययन करने के लिए मॉडल एक सुलभ पूर्व vivo के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता दिखा। यह दृष्टिकोण तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा समस्थानिक ट्रेसिंग और रिश्तेदार मात्रा का ठहराव को रोजगार और अध्ययन डिजाइन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

बेकार mitochondrial चयापचय neurodegeneration, कैंसर और हृदय रोग के 30 सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसाया गया है। जैसे, महान प्रयास चयापचय दोष है कि रोग रोगजनन के लिए योगदान निस्र्पक पर रखा गया है। तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस) जटिल जैविक matrices से analytes की मात्रा का ठहराव के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है और अक्सर चयापचय अध्ययन 8 के लिए कार्यरत है। लेकिन, जैसा कि अक्सर जैव चिकित्सा के अध्ययन के साथ मामला है, मानव रोग के लिए प्रासंगिक एक सुलभ और अच्छी तरह से परिभाषित मॉडल को प्राप्त करने के लिए एक चुनौती है।

कई अध्ययनों से सेलुलर चयापचय 7.9 पर xenobiotics या आनुवंशिक असामान्यताएं के प्रभाव की जांच कर लिए सेलुलर मॉडल बदल रोजगार। चयापचय reprogramming कि कैंसर की कोशिकाओं में होता है confounding लागू कर सकते हैं 21 कारकों और इसलिए आदर्श नहीं हैं। इन मुद्दों circumve हो सकता हैप्राथमिक सेल मॉडल के साथ nted, हालांकि चयापचय विश्लेषण के लिए पर्याप्त बायोमास प्राप्त करने के चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, संस्कृति में इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं की उच्च मात्रा के प्रभाव संभावित confounding mitochondrial अध्ययनों से 16 के रूप में प्रकाश डाला गया है।

मानव प्लेटलेट्स चयापचय अध्ययन 5,22,27,32 के लिए पर्याप्त mitochondrial सामग्री के साथ एक प्राथमिक सेल मॉडल का उपयोग करने का अवसर दे। सबसे पहले, प्लेटलेट्स को आसानी से हासिल किया जा सकता माध्यम से रक्त दाताओं से व्यक्ति, या रक्त बैंकों से बड़ी मात्रा में आ रही है, और इसलिए एक मॉडल में जो बाह्य कारकों को आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है प्रदान करते हैं। दूसरे, उनके छोटे आकार के कारण, प्लेटलेट्स आसानी से अन्य रक्त घटकों से कम से कम प्रारंभिक कार्य के साथ भी न्यूनतम सुसज्जित प्रयोगशालाओं 5 में अलग किया जा सकता है। ध्यान से, प्लेटलेट्स नाभिक शामिल नहीं है और इसलिए ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की स्वतंत्र रूप से चयापचय के लिए परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ हम उस दिखानेएसाइल coenzyme एक (सीओए) thioesters के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के अलावा, अलग-थलग प्लेटलेट प्रणाली कार्बन चयापचय की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विशेष रूप से, हम महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट acetyl- में [13 सी] -label के समावेश की जांच के लिए स्थिर आइसोटोप (गैर रेडियोधर्मी) लेबल [13 सी 6] -glucose और [13 सी 16] के साथ -palmitate चयापचय लेबलिंग के उपयोग की रिपोर्ट ग्लाइकोलाइसिस या फैटी एसिड ऑक्सीकरण के माध्यम से सीओए। यह जैव रासायनिक रास्ते 13,24 में एसाइल सीओए प्रजातियों की व्यापक भागीदारी और इस तरह के rotenone 3,33 के साथ जटिल मैं के निषेध के रूप में अन्य चर, का परीक्षण करने के लिए इस प्रणाली का शिक्षणीयता के कारण एक शक्तिशाली, generalizable, और बहुमुखी मंच प्रदान करता है। नीचे प्रोटोकॉल में उपलब्ध कराई गई जानकारी के अलावा, आइसोटोप लेबलिंग के लिए और नियंत्रण रेखा-MS-आधारित विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की एक व्यापक विवरण बसु और ब्लेयर 4 में पाया जा सकता है।

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Protocol

आचार कथन: मानव नमूनों के इलाज के विषय में सभी प्रोटोकॉल पेनसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशा निर्देशों का पालन करें।

1. बफ़र की तैयारी और 100x स्टॉक समाधान

  1. आधार Tyrode के बफर के 1 एल तैयार करें। गठबंधन 8.123 छ NaCl, 1.428 जी 3 NaHCO, 0.466 जी 2 CaCl ∙ 2 एच 2 हे, 0.224 जी KCl, और 0.095 जी MgCl 2. DDH 2 ओ के साथ 1 एल के लिए कुल मात्रा समायोजित करें फिल्टर आधार Tyrode के बफर बाँझ।
  2. ग्लूकोज और पामिटिक एसिड की 100x स्टॉक समाधान तैयार करें। 100x ग्लूकोज स्टॉक समाधान के लिए, 100 मिलीग्राम भंग ग्लूकोज या [13 सी 6] -glucose DDH 2 ओ के 1 मिलीलीटर में 100x palmitate समाधान के लिए, या पामिटिक एसिड की 2.56 मिलीग्राम इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में [13 सी 16] -palmitic एसिड की 2.72 मिलीग्राम भंग। फ़िल्टर 100x स्टॉक समाधान बाँझ।
  3. उचित समृद्ध Tyrode के बफ़र तैयार गैर-लेबलिंग पढ़ाई के लिए, आधार Tyrode के बफर के 98 मिलीलीटर 100x पामिटिक एसिड शेयर समाधान के 1 मिलीलीटर 1 100x ग्लूकोज स्टॉक समाधान के मिलीलीटर और जोड़ें।
  4. ग्लूकोज लेबलिंग पढ़ाई के लिए, आधार Tyrode के बफर के 98 मिलीलीटर 100x पामिटिक एसिड स्टॉक समाधान के 100x [13 सी 6] -glucose शेयर समाधान के 1 मिलीलीटर और 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. पामिटिक एसिड लेबलिंग पढ़ाई के लिए, आधार Tyrode के बफर के 98 मिलीलीटर के लिए 1 100x [13 सी 16] -palmitic एसिड स्टॉक समाधान के ग्लूकोज स्टॉक समाधान के मिलीग्राम और 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  • Rotenone उपचार के लिए समाधान तैयार
    1. डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में rotenone की एक 10 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है।
    2. गैर-लेबलिंग खुराक प्रतिक्रिया पढ़ाई के लिए, 1.4.3 करने के लिए आगे बढ़ें। एक खुराक में लेबलिंग पढ़ाई के लिए, 1.4.5 करने के लिए आगे बढ़ें।
    3. rotenone 1 एनएम से 100 माइक्रोन के लिए लेकर सांद्रता के साथ समाधान प्राप्त करने के लिए DMSO में 10 मिमी rotenone शेयर के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना। ये 100x स्टॉक कर रहे हैंएस।
    4. rotenone 10 बजे से 1 माइक्रोन से लेकर सांद्रता के साथ समाधान तैयार करने के लिए 1.3.1 से आधार Tyrode के बफर + ग्लूकोज + पामिटिक एसिड के 5 मिलीलीटर करने के लिए प्रत्येक शेयर के 50 μl जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, एक वाहन पर नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए DMSO के 50 μl जोड़ें। 2.1 लिए आगे बढ़ें।
    5. एक 10 माइक्रोन के काम समाधान प्राप्त करने के लिए DMSO में 10 मिमी शेयर समाधान 1,000 गुना पतला।
    6. 5 मिलीलीटर आधार Tyrode के बफर से प्रत्येक के लिए इस शेयर का 50 μl जोड़ें [13 सी 6] -glucose + पामिटिक एसिड 1.3.2 से और आधार Tyrode के बफर + ग्लूकोज + [13 सी 16] 1.3.3 से -palmitic एसिड। अंतिम एकाग्रता 100 एनएम rotenone है। वैकल्पिक रूप से, वाहन नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए प्रत्येक बफर करने के लिए DMSO के 50 μl जोड़ें।

    • 2. प्लेटलेट अलगाव

    नोट: इस विधि या तो पूरे रक्त से या प्लेटलेट बैग से निकाली गई प्लेटलेट्स के लिए उत्तरदायी है। यहाँ निहित उदाहरण डेटा तैयार किया गया थाप्लेटलेट बैग से निकाली गई प्लेटलेट्स का उपयोग कर। कृपया पूरे रक्त से अलग प्लेटलेट्स का उपयोग कर के बारे में अधिक जानकारी के लिए बसु एट अल देखें। 5।

    1. पूरे रक्त से प्लेटलेट अलगाव
      नोट: यदि प्लेटलेट्स की एक बैग से प्लेटलेट्स को अलग-थलग, 2.2.1 करने के लिए आगे बढ़ें।
      1. में कोई ब्रेक के साथ 15 मिनट के लिए 175 x जी अपकेंद्रित्र पूरे रक्त।
      2. स्थानांतरण ऊपरी प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा के 1 मिलीलीटर (पीआरपी) एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब परत।
      3. 5 मिनट के लिए 400 x जी पीआरपी अपकेंद्रित्र।
      4. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और कदम करने के लिए 3.1 या 3.2 आगे बढ़ें।
    2. एक प्लेटलेट बैग से प्लेटलेट अलगाव
      1. स्थानांतरण एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब प्लेटलेट निलंबन के 1 मिलीलीटर।
      2. 5 मिनट के लिए 400 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र।
      3. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और कदम करने के लिए 3.1 आगे बढ़ें। या 3.2।

    3. एक प्रयोग प्रदर्शन

    1. जीनोबायोटिक के प्रभाव को निर्धारित करने के लिएउपचार (जैसे, rotenone) ब्याज की एक metabolite के स्तर पर (जैसे, एसिटाइल सीओए), 3.1.1 करने के लिए आगे बढ़ें। ब्याज की एक बहाव के मेटाबोलाइट में एक चयापचय अग्रदूत के समावेश पर एक जीनोबायोटिक (जैसे।, Rotenone) के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, 3.2.1 के लिए आगे बढ़ना।
      1. हर हालत के लिए कोई कम से कम तीन जैविक प्रतिकृति का उपयोग करना, कदम 1.4.4 से प्रत्येक समाधान के 1 मिलीलीटर में कदम 2.1.4 या 2.2.3 से प्लेटलेट गोली resuspend।
      2. एक पानी तख्ताबंदीवाला सीओ 2 इनक्यूबेटर 95% आर्द्रता, 5% सीओ 2 और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट में resuspended प्लेटलेट्स सेते हैं। कदम के लिए 4.1 आगे बढ़ें
        नोट: यहाँ हम एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग का वर्णन है। वैकल्पिक रूप से, एक समय बेशक प्रयोग किया जा सकता है, जिसमें खुराक तय की गई थी और ऊष्मायन की लंबाई के बजाय अलग-अलग किया गया था।
    2. ब्याज की एक बहाव के मेटाबोलाइट में एक चयापचय अग्रदूत के समावेश पर जीनोबायोटिक उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए।
      1. यूकोई हर हालत के लिए तीन जैविक प्रतिकृति की तुलना में कम गाते हैं, कदम 1.4.6 से लेबल Tyrode के बफर में से प्रत्येक के निर्माण के 1ml में कदम 2.1.4 या 2.2.3 से प्लेटलेट गोली resuspend।
      2. एक पानी तख्ताबंदीवाला सीओ 2 इनक्यूबेटर 95% आर्द्रता, 5% सीओ 2 और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट में resuspended प्लेटलेट्स सेते हैं। कदम के लिए 4.1 से आगे बढ़ें।

    4. शमन और सीओए निष्कर्षण

    1. 3 मिनट के लिए 3,000 XG पर centrifuging द्वारा प्लेटलेट्स गोली।
    2. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
    3. 750 μl बर्फ के ठंडे 10% Trichloroacetic एसिड में Resuspend प्लेटलेट्स (डब्ल्यू / वी)।
    4. उचित स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक जोड़ें। उदाहरण के लिए, यदि लक्ष्य, नमूने भर में सीओए प्रजातियों के स्तर की तुलना में स्थिर आइसोटोप लेबल सीओए thioesters के रूप में पहले से वर्णित खमीर से प्राप्त (SILEC तकनीक), 29 का एक मिश्रण के 100 μl का उपयोग करने के लिए है।
    5. पल्स-sonicate प्रत्येक नमूना 0.5 सेकंड दालों के साथ 30 बार।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने हैं।
    7. वैक्यूम कई गुना करने के लिए C18 ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) कॉलम प्रत्यय।
    8. 1 मिलीलीटर मेथनॉल के साथ कॉलम हालत।
    9. 1 मिलीलीटर DDH 2 ओ के साथ स्तंभों संतुलित करना
    10. कॉलम के माध्यम से चलाने के लिए नमूना व्युत्पन्न सतह पर तैरनेवाला (लगभग इस मामले में 850 μl)।
    11. 1 मिलीलीटर पानी के साथ स्तंभों को धो लें।
    12. वैक्यूम कई गुना में लोड 10 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब क्षालन अंश एकत्र करने के लिए।
    13. मेथनॉल में 25 मिमी अमोनियम एसीटेट के 1 मिलीलीटर के साथ स्तंभों Elute।
    14. नाइट्रोजन गैस के तहत सूखी eluate।
    15. 50 μl 5% (w / v) 5-sulfosalicylic एसिड में सूखे के अवशेष Resuspend और एचपीएलसी शीशियों में स्थानांतरित।

    5. एचपीएलसी सेटअप

    1. एचपीएलसी प्रणाली के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एचपीएलसी की स्थिति तालिका 1 में सूचीबद्ध के रूप में, लक्ष्य analytes और उपयोग स्तंभ के लिए अनुकूलित के साथ एक विधि बनाने के लिए।
      नोट: स्तंभ temperatइस डेटा की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया Ure 25 डिग्री सेल्सियस था, लेकिन विशिष्ट मानदंडों के साधन के द्वारा और ब्याज की यौगिकों के संबंध में अलग अलग होंगे। एसाइल सीओए quantitation के लिए, नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण करने के कई तरीके सूचित किया गया है, और विभिन्न नियंत्रण रेखा की स्थिति 14,19,20 में अलग analytes के लिए मान्य।
    2. एचपीएलसी पर्याप्त रूप से संतुलित करने की अनुमति दें।
      नोट: इस विधि के लिए शुरू विलायक की स्थिति पर एक स्तंभ और स्तंभ का संतुलन संलग्न करने से पहले सॉल्वैंट्स के दोनों भड़काना शामिल करना चाहिए। संतुलन मात्रा निर्माता के निर्देशों का पालन करना चाहिए, और जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह बर्बाद करने के लिए बँट जाना चाहिए।
      नोट: एचपीएलसी सेटिंग्स के बारे में अधिक जानकारी के लिए बसु और ब्लेयर 5 से परामर्श करें।

    6. मास स्पेक्ट्रोमीटर सेटअप

    1. मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, ब्याज की यौगिकों के आयनित रूपों का पता लगाने के लिए एक लक्षित विधि पैदा करते हैं। पैरामीटर प्रस्तुत कर रहे हैंतालिका 2 में।
      नोट: इन यौगिकों के स्थिर आइसोटोप analogues निर्धारित करने के लिए एक सकारात्मक या नकारात्मक मोड बेहतर संवेदनशीलता देता है कि क्या और उनका पता लगाने के लिए स्रोत और प्रकाशिकी हालत अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। मास स्पेक्ट्रोमीटर विधि के कुल समय का पता लगाने जुड़े एचपीएलसी विधि के समय घटक के अनुरूप होना चाहिए।
      नोट: जैसा कि पहले उल्लेख, एसाइल सीओए विश्लेषण करने के कई तरीके, सूचित किया गया है सकारात्मक और नकारात्मक 14 आयनीकरण 15 मोड और नहीं बल्कि एक ट्रिपल quadrupole साधन 28 की तुलना में एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर 17 का उपयोग भी शामिल है।
    2. स्वच्छ और साधन जांचना, स्पेक्ट्रोमीटर में एक स्थिर स्प्रे की स्थापना, और अंशांकन समाधान पर्याप्त रूप से स्रोत और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रकाशिकी से फैलने के लिए समय देते हैं।
    3. मास स्पेक्ट्रोमीटर नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ सभी नमूनों के लिए एक दृश्य सेट करें। incluनाम या संख्यात्मक पहचानकर्ता डे और उचित इंजेक्शन की मात्रा और साधन विधि से संकेत मिलता है। पहला नमूना से पहले एक खाली चलाएँ, और के रूप में भार या मैट्रिक्स प्रभाव को कम करने के लिए जरूरी नमूनों के बीच अन्य कारतूस और washes चलाते हैं।
      नोट: चयनित analytes 'तरल chromatograms के शिखर एकीकरण के लिए एक प्रसंस्करण विधि अक्सर इस क्रम में सेट किया जा सकता है या बाद में डाटा प्रोसेसिंग में लागू होता है।
    4. अनुक्रम शुरू और दबाव उतार चढ़ाव या सिस्टम विफलताओं और चलाने के दौरान संकेत तीव्रता के नुकसान सहित समस्याओं के लिए समय समय पर मास स्पेक्ट्रोमीटर और एचपीएलसी प्रणाली की निगरानी।
      नोट: गंभीर समस्या या लगातार रन विफलताओं रन और मिटाने को रोकने की आवश्यकता होती है और फिर से equilibrating सफाई के रूप में एचपीएलसी प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से और मास स्पेक्ट्रोमीटर औजार हो सकती है। एमएस सेटिंग्स और डाटा प्रोसेसिंग के बारे में अधिक जानकारी के लिए बसु और ब्लेयर 5 से परामर्श करें।

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    Representative Results

    इस पद्धति हम जोखिम से rotenone के परिणामस्वरूप पहले से वर्णित प्रतिपूरक चयापचय अनुकूलन के generalizability reproduced है की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए। यह निष्कर्ष पहले से सेल संस्कृति मॉडल में पहचान की थी और इस जांच अगर यह चयापचय पारी भी प्लेटलेट्स, जो anuclear और सेल संस्कृति के रूप में एक ही प्रयोगात्मक कलाकृतियों से ग्रस्त नहीं हैं में होता है परीक्षण करने के उद्देश्य से किया गया था। यह काम करते हैं, पेन ट्रामा सेंटर है, जो मानव निषेचन के लिए बहुत पुराना माना गया था से 6 दिन पुरानी प्लेटलेट्स के साथ प्रदर्शन किया गया था, हालांकि वे अपने चयापचय गतिविधि को बनाए रखा। के रूप में चित्र 1 में दिखाया अलगाव प्रदर्शन किया गया था। कुल कार्यप्रवाह प्लेटलेट्स कि अब रोगियों में निषेचन के लिए उपयोगी होते हैं की उपलब्धता के साथ 96 अच्छी तरह से थाली आधारित उच्च throughput के लिए नैदानिक ​​नमूने या प्रयोगात्मक शर्तों की एक सीमित संख्या से आसानी से पहुंचा जा सकता है।

    (चित्रा 2) के निषेध से परिणाम के लिए कर रहे हैं धारणा की सूचना दी है। विशेष रूप से हम एसएच SY5Y कोशिकाओं में β-hydroxybutyryl में एक साथ वृद्धि के साथ succinyl सीओए (आईसी 50 = 25 एनएम) में एक खुराक निर्भर कमी मनाया है (एचबी) -CoA (ईडी 50 = 75 एनएम) है, जबकि एसिटाइल सीओए का स्तर अपरिवर्तित 1 थे। Rotenone के साथ इलाज मानव प्लेटलेट्स के हमारे विश्लेषण अत्यधिक अनुरूप परिणाम (चित्रा 3) का पता चला। इस rotenone के जवाब की mitochondrial निर्भरता की ओर इशारा करते मानव प्लेटलेट्स में प्रयोगात्मक डेटा का एक अनूठा सेट प्रदान करता है। यह प्रतिक्रिया पारंपरिक transcriptional तंत्र के माध्यम से मध्यस्थता नहीं किया जा सकता क्योंकि प्लेटलेट्स नाभिक की कमी है।

    सापेक्ष मात्रा का ठहराव, चयापचय जानकारी का एक आयाम प्रदान करता है, लेकिनसमस्थानिक लेबलिंग विशिष्ट चयापचय मार्ग की गतिविधि में अमूल्य पूरक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। यह चयापचय के अध्ययन में महत्वपूर्ण है क्योंकि कई रास्ते एक भी मध्यवर्ती के माध्यम से एकाग्र हो सकता है। इस बात को प्रदर्शित करने के लिए, प्लेटलेट्स 1 घंटे के लिए दोनों में से किसी [13 सी 6] -glucose या [13 सी 16] -palmitate उपस्थिति में या तो 100 एनएम rotenone या DMSO के साथ इलाज किया गया। नियंत्रण रेखा स्तंभ से एसाइल-थल सेनाध्यक्ष के आइसोटोपोलोग्स के सह-क्षालन analytes की समस्थानिक रचना (चित्रा 4) की निश्चित निर्धारण के लिए अनुमति देता है। के रूप में वर्णित 11 भारी आइसोटोप की प्राकृतिक बहुतायत के लिए सुधार के बाद इस दृष्टिकोण प्लेटलेट्स में एसिटाइल सीओए के glycolytic उत्पादन में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई, जबकि palmitate समावेश काफी (चित्रा 5) की वृद्धि हुई थी। इन निष्कर्षों एसएच SY5Y सेल संस्कृति मॉडल में पहले से मनाया उन लोगों के लिए समान हैं और इसलिए 33 अतिरिक्त सबूत उपलब्ध कराने के टीटोपी इस मार्ग विवो में महत्वपूर्ण हो सकता है।

    समय (मिनट) 0 0 1.5 5 12 17 18 23 25 30
    कुल फ्लो (μl / मिनट) 200 200 200 200 200 250 200 200 200 200
    % ए 98 98 98 80 0 0 0 0 98 98
    % बी 2 2 2 20 100 100 0 0 2 2
    % सी 0 0 0 0 0 0 100 100 0 0

    । तालिका 1. तरल क्रोमैटोग्राफी ढाल विलायक एक: जल में 5 मिमी अमोनियम एसीटेट, विलायक बी: 5 ACN / पानी विलायक C: 95 में 5 मिमी अमोनियम एसीटेट 80:20 ACN / पानी के 0.1% चींटी एसिड

    पैरामीटर मूल्य
    स्प्रे वोल्ट (वी) 4000
    Vaporizer तापमान (डिग्री सेल्सियस) 400
    म्यान गैस दबाव 35
    सहायक गैस दबाव 10
    केशिका तापमान (डिग्री सेल्सियस) 350
    ट्यूब लेंस ऑफसेट (वी) 100

    तालिका 2 मास स्पेक्ट्रोमीटर पैरामीटर।

    आकृति 1
    चित्रा 1. सामान्यीकृत कार्यप्रवाह नमूना तैयार करने और विश्लेषण के लिए। यह योजनाबद्ध नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण द्वारा प्लेटलेट अलगाव और चयापचय के अध्ययन के लिए इलाज के लिए कार्यप्रवाह दर्शाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2. मेटाबोलिक ग्लूकोज की योजना और लिपिड चयापचय और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला। Acetyl सीओए या तो ग्लूकोज या palmitate से संश्लेषित किया जा सकता है। Rotenone mitochondrial परिसर आई द्वारा इलेक्ट्रॉनों का उचित चक्कर रोकताटीपीएस: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3. सीओए-thioesters के quantitation Rotenone। Rotenone उपचार के जवाब में एसिटाइल सीओए के स्तर को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन succinyl सीओए (आईसी 50 = 4.1 एनएम) βHB सीओए में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ में एक खुराक पर निर्भर कमी लाती है (ईडी 50 = 4.2 एनएम)। त्रुटि सलाखों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं; एन = 4. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4. प्रतिनिधि chromatograms Palmitate से समस्थानिक लेबलिंग दिखामें Acetyl सीओए। Rotenone उपचार एसिटाइल सीओए में palmitate के समावेश बढ़ जाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5. [13 सी 6] -glucose या [13 सी 16] -palmitate के सापेक्ष निगमन Acetyl सीओए। Rotenone उपचार में एसिटाइल सीओए में ग्लूकोज समावेश कम हो जाती है और palmitate समावेश बढ़ जाती है। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं; एन = 4 तारों को निरूपित पी <0.05 (छात्र unpaired टी परीक्षण)। कृपया यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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    Discussion

    यहाँ हम परेशान mitochondrial चयापचय के अध्ययन के लिए एक मंच के रूप में अलग-थलग प्लेटलेट्स की उपयोगिता से पता चला है। विशेष रूप से, हम rotenone द्वारा जटिल मैं निषेध के जवाब में चयापचय अनुकूलन की विशेषता है।

    वर्तमान अध्ययन मानव प्लेटलेट्स के लिए सेल लाइनों में rotenone द्वारा जटिल मैं निषेध की भूमिका पर पहले की रिपोर्ट के निष्कर्षों को बढ़ा दिया गया है। महत्वपूर्ण बात, इस से पता चला है कि rotenone भी हिचकते प्लेटलेट succinyl सीओए गठन, प्लेटलेट βHB सीओए में वृद्धि को प्रेरित किया और एसिटाइल सीओए के प्लेटलेट के स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

    महान देखभाल वैधता और इस प्रकार के किसी भी विश्लेषण के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। प्लेटलेट्स पूरे रक्त से अलग हो रहे हैं, तो अलगाव बिल्कुल के रूप में आदेश लिम्फोसाइट प्रदूषण और प्लेटलेट सक्रियण को रोकने के लिए ऊपर वर्णित आगे बढ़ना चाहिए, बफी लिम्फोसाइट undis युक्त कोट छोड़ने के लिए समर्पित विशेष ध्यान के साथturbed। आदेश खुराक प्रतिक्रिया घटता सार्थक होने के लिए, धारावाहिक dilutions हर कदम पर एकरूपता के मिश्रण के साथ, ठीक किया जाना चाहिए। प्लेटलेट मेजबान के बाद, ऊष्मायन शर्तों ऊपर विस्तृत उन लोगों से संशोधित किया जा सकता है, लेकिन वे कड़ाई से उपचार समूहों में मानकीकृत किया जाना चाहिए किए जाने के लिए सार्थक तुलना के लिए अनुमति देने के लिए। शायद किसी भी मात्रात्मक नियंत्रण रेखा / एमएस आधारित विश्लेषण में सबसे महत्वपूर्ण कदम स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानकों का इस्तेमाल होता है।

    आंतरिक मानकों का उपयोग इस सेटिंग में महत्वपूर्ण है क्योंकि यह इस तरह के चर निकासी क्षमता और नमूने भर analyte स्थिरता के रूप में संभावित confounding "बैच प्रभाव 'के खिलाफ की रक्षा करता है। आंतरिक मानक के अलावा, (फिर से, एकरूपता के लिए मिश्रण) एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में के रूप में जल्दी संभव के रूप में कलाकृतियों के लिए क्षमता कम कर देता है। अंत में, किसी भी प्रयोग के रूप में, कई के उपयोग के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत आवश्यक है प्रतिकृति, और यदि संभव, बिजली पायलट प्रयोगों के आधार पर गणना के लिए उपयोगी हो सकता है।

    प्लेटलेट्स तेजी से व्यक्तिगत या जमा सूत्रों 5,27,32 से अलग किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदायी बना रही है। यह ध्यान रखें कि दोनों रिश्तेदार मात्रा का ठहराव और समस्थानिक लेबलिंग शामिल अध्ययन प्रदर्शन करने की क्षमता एक चयापचय प्रणाली के एक अधिक व्यापक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, यह दो अलग assays, जो प्रयोग के लिए आवश्यक बायोमास के लिए मांग बढ़ जाती है मांग। इस कारण से, प्लेटलेट्स, जो आसानी से बड़ी संख्या में प्राप्त किया जा सकता है, अन्य सेल संस्कृति मॉडल की तुलना में अधिक कुशल हैं।

    हालांकि, प्लेटलेट्स के उपयोग के द्वारा प्रदत्त कई फायदे के बावजूद, वहाँ कमियां हैं। सबसे पहले, देखभाल मानव दाताओं के चयन में लिया जाना चाहिए क्योंकि वहाँ कई विकारों कि प्लेटलेट शरीर क्रिया विज्ञान, 25 को प्रभावित कर रहे हैं। इसके अलावा, नमूना के दौरान प्लेटलेट सक्रियणतैयार करने और विश्लेषण के लिए किसी भी प्लेटलेट आधारित परख में एक संभावित confounding चर रहा है। इन कारणों के लिए, एलिसा 26 से प्लेटलेट सक्रियण के मार्कर के सहवर्ती मूल्यांकन, इस तरह के प्रकाश संचरण aggregometry (एलटीए) परख 34 के रूप में cytometry 1, या assays के प्रवाह विवेकपूर्ण साबित हो सकता है।

    हालांकि वर्तमान अध्ययन एसाइल सीओए thioesters के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया है, इस दृष्टिकोण आसानी से analytes की एक व्यापक रेंज को शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। अलक्षित metabolomics दृष्टिकोण रोग राज्यों में 23 की एक सरणी में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर रहे हैं। इस तरह अलक्षित दृष्टिकोण को लागू करने के लिए प्लेटलेट मॉडल की संभावना dysregulated सेलुलर चयापचय में शामिल अंतर्निहित जैव रासायनिक तंत्र में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करेगा।

    यह दृष्टिकोण आसानी से अन्य पर्यावरणीय रसायनों और दवाओं mitochondrial चयापचय के साथ हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है की जांच में शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता 6,12,18,31 के रूप में अच्छी तरह से एक प्रणाली सीओए चयापचय 10 के संभावित modulators के रूप में xenobiotics के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए। इसके अलावा, सामान्य दृष्टिकोण ऐसे Friedreich गतिभंग 5,32 के रूप में आनुवंशिक रोगों में चयापचय दोष का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऊपर उल्लिखित प्रयोगात्मक डिजाइन के किसी भी क्रम में और अधिक मजबूती के साथ प्रत्येक संदर्भ 2 में माइटोकॉन्ड्रिया के राज्य को चिह्नित करने में एक कार्यात्मक श्वसन परख के साथ मिलकर किया जा सकता है। इस प्रकार, पृथक प्लेटलेट्स में चयापचय की पढ़ाई के साथ स्थिर आइसोटोप और नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण युग्मन उपन्यास अवसर वहन करने के लिए आगे न्यायपालिका mitochondrial चयापचय को चिह्नित करने की संभावना है।

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    Disclosures

    लेखकों ने प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की अनुपस्थिति की घोषणा की।

    Acknowledgments

    हम एनआईएच अनुदान P30ES013508 और T32ES019851 का समर्थन स्वीकार करते हैं।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 746398
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
    Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) Sigma-Aldrich 223506
    Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
    Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 208337
    Glucose Sigma-Aldrich G8270
    13C6-Glucose Sigma-Aldrich 389374
    Palmitic acid Cayman 10006627
    13C16-Palmitic Acid Sigma-Aldrich 605573
    Rotenone Sigma-Aldrich R8875
    Trichloro Acetic Acid Sigma-Aldrich T6399
    5-Sulfosalicylic Acid Sigma-Aldrich 390275
    Acetonitirle Fischer Scientific A996-4 (optima)
    Water (H2O) Fischer Scientific W7-4 (optima)
    Formic acid Fischer Scientific 85171 (optima)
    Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 472301
    Ethanol Fischer Scientific 04-355-222
    Methanol Fischer Scientific A454-4 (optima)
    Ammonium Acetate Fischer Scientific A639-500
    2 ml Eppendorf Tubes BioExpress C-3229-1
    LC vials (plastic) Waters 186002640
    10 ml Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 73785-10
    Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns Waters WAT094225
    Pastuer Pipets Fischer Scientific 13-678-200
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    CO2 Water-Jacketed Incubator Nuaire AutoFlow NU-8500
    Triple Quadropole Mass Spectrometer Thermo Scientific Finnigan TSQ Quantum
    HPLC Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000
    Source Thermo Scientific HESI II
    HPLC Column Phenomenex Luna C18 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    पर्यावरण विज्ञान अंक 110 चयापचय समस्थानिक ट्रेसर प्लेटलेट्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री माइटोकॉन्ड्रिया rotenone xenobiotics
    नियंत्रण रेखा एमएस मानव प्लेटलेट्स की विश्लेषण Mitochondrial चयापचय के अध्ययन के लिए एक मंच के रूप
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    Worth, A. J., Marchione, D. M., Parry, R. C., Wang, Q., Gillespie, K. P., Saillant, N. N., Sims, C., Mesaros, C., Snyder, N. W., Blair, I. A. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. J. Vis. Exp. (110), e53941, doi:10.3791/53941 (2016).

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