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Neuroscience

डबल प्रतिदीप्ति का मेल Published: March 26, 2016 doi: 10.3791/53976
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London
* These authors contributed equally

Abstract

मस्तिष्क की कोशिकाओं जैसे, न्यूरॉन्स, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte व्यापारियों और microglia के विभिन्न प्रकारों में जीन अभिव्यक्ति की जांच, immunostaining के लिए विशिष्ट प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी की कमी आड़े आती जा सकता है। यहाँ हम दो जीन विशेष जांच उच्च विशिष्टता प्रोटीन एक तिहाई जीन द्वारा इनकोडिंग के खिलाफ निर्देशित की एक एंटीबॉडी के साथ immunostaining द्वारा पीछा के साथ सीटू संकरण में डबल प्रतिदीप्ति का उपयोग एक ही मस्तिष्क खंड में तीन अलग-अलग जीनों की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। Aspartoacyclase (ASPA) जीन, जिनमें से म्यूटेशन एक दुर्लभ मानव सफेद पदार्थ रोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं - Canavan रोग - oligodendrocytes और microglia में लेकिन astrocytes और न्यूरॉन्स में नहीं व्यक्त किया जा करने के लिए सोचा है। हालांकि, मस्तिष्क में ASPA की सटीक अभिव्यक्ति पैटर्न अभी तक स्थापित किया जाना है। इस प्रोटोकॉल निर्धारित करने के लिए कि ASPA परिपक्व oligodendrocytes एक के एक सबसेट में व्यक्त किया जाता है हमें अनुमति दी गई हैएन डी यह आम तौर पर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

Glial कोशिकाओं है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं रहे हैं, oligodendrocytes (सीएनएस के myelinating कोशिकाओं), oligodendrocytes व्यापारियों (ऑप्स, भी "NG2 कोशिकाओं" के रूप में जाना जाता है), astrocytes और microglia शामिल। वहाँ मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 1 में glial कोशिकाओं और उनके संभावित भूमिकाओं के कार्यों में रुचि बढ़ रही है। उदाहरण के लिए, Canavan रोग (सीडी) एक वंशानुगत neurodegenerative विकार स्पाँजिफार्म leukodystrophy और न्यूरॉन्स के एक प्रगतिशील हानि के साथ प्रारंभिक अवस्था में शीघ्र शुरू करने, आम तौर पर 2,3 उम्र के 10 साल से पहले मौत के लिए अग्रणी है। Aspartoacyclase (ASPA) जीन में उत्परिवर्तन कि नेतृत्व काफी ASPA गतिविधि 4 कम करने के लिए सीडी में पहचान की गई है। ASPA एक एंजाइम एन acetylaspartate (NAA) की deacetylation उत्प्रेरित करने, एक अणु अत्यधिक मस्तिष्क में केंद्रित पैदा एसीटेट और aspartate 5-7 है। कई सीडी रोगियों ASPA एसी की कमी के कारण NAA के उच्च स्तर दिखानेtivity। कुछ अध्ययनों से अटकलें NAA व्युत्पन्न एसीटेट विकास के दौरान फैटी एसिड / मस्तिष्क में लिपिड का एक प्रमुख स्रोत हो सकता है और NAA की विफलता की वजह से विकास 3,5,6 टूट किया जा करने के दौरान माइलिन संश्लेषण में कमी आई सीडी से परिणाम हो सकता है कि।

ASPA मुख्य रूप से गुर्दे, जिगर और मस्तिष्क के सफेद पदार्थ में पाया जाता है, और सीडी में ASPA की महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए मस्तिष्क में इस एंजाइम की सेलुलर अभिव्यक्ति कई प्रयोगशालाओं द्वारा अध्ययन किया गया है। मस्तिष्क में ASPA enzymatic गतिविधि को देख कर, पहले के अध्ययनों में पाया गया कि मस्तिष्क के विकास के दौरान ASPA गतिविधि में वृद्धि myelination 8-10 के समय पाठ्यक्रम समानताएं। सेलुलर स्तर पर, enzymatic गतिविधि के लिए के रूप में अच्छी तरह से सीटू संकरण (ISH) और immunohistochemistry (आईएचसी) में assays का सुझाव विश्लेषण करती है कि ASPA मुख्य रूप से मस्तिष्क में है, लेकिन न्यूरॉन्स या astrocytes 11-16 में नहीं oligodendrocytes में व्यक्त किया जाता है। कुछ अध्ययनों में पाया गया कि शायद यह भी ASPAसीएनएस 12,14 में microglia में व्यक्त किया। ऑप्स में ASPA अभिव्यक्ति पर अब तक डेटा सीमित हैं। एक ताजा अध्ययन में जहां न्यूरॉन्स, astrocytes, ऑप्स, नवगठित oligodendrocytes, myelinating oligodendrocytes, microglia, endothelial कोशिकाओं, और pericytes सहित माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के transcriptomes आरएनए अनुक्रमण 17 से विश्लेषण किया गया के अनुसार, विशेष रूप से ASPA oligodendrocytes में व्यक्त किया जाता है , oligodendrocytes myelinating में विशेष रूप से (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html)। मस्तिष्क में ASPA अभिव्यक्ति पैटर्न पर इन अध्ययनों के बावजूद, अनिश्चितताओं के एक नंबर रहते हैं।

विभिन्न तकनीकों जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आईएचसी ऊतक वर्गों में एक जीन अभिव्यक्ति के कार्यात्मक उत्पाद (यानी, प्रोटीन) का पता लगाने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि है। अपनी महान उपयोगिता के बावजूद, इस तकनीक सीमाएँ हैं के रूप में अपने आवेदन और विशिष्टता विषय टी रहे हैंउपलब्धता और एंटीबॉडी की जरूरत की विशिष्टता ओ। तुलना करके, ईश mRNA स्तर पर किसी भी जीन की अभिव्यक्ति प्रकट करने में सक्षम होने का लाभ दिया है। हालांकि, यह तकनीकी रूप से आदेश विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक जीन अभिव्यक्ति स्थानीयकरण करने में ही समय में कई जांच का प्रयोग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस अनुच्छेद में, हम एक प्रोटीन की प्रतिदीप्ति immunolabelling साथ स्वस्थानी संकरण में संयोजन डबल प्रतिदीप्ति आरएनए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम माउस मस्तिष्क में Aspa की अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच करने के लिए तकनीक के इस सेट का इस्तेमाल किया है। इस विधि confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग जीन अभिव्यक्ति की सटीक अध्ययन की अनुमति देता है।

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Protocol

नैतिकता कथन:
माउस पशुपालन और हैंडलिंग ब्रिटेन के गृह मंत्रालय के नियमों और यूसीएल आचार समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार कर रहे हैं, पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) यूनाइटेड किंगडम और इसके संशोधन विनियम 2012 के अधिनियम 1986 के साथ पालन।

नोट: सभी समाधान diethyl pyrocarbonate (DEPC) के साथ बनाया जाना चाहिए - किसी भी अवशिष्ट RNase नष्ट करने के लिए पानी का इलाज। DEPC उपचार के लिए, DEPC (प्रति लीटर 1 मिलीलीटर) जोड़ने के लिए, सख्ती से हिला तक सभी DEPC ग्लोबुलेस फिर गायब हो गया है DEPC नीचा करने के लिए आटोक्लेव।

1. शाही सेना जांच संश्लेषण

  1. चेतावनी: जब formamide हैंडलिंग, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनते हैं और एक सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग करें। संकरण बफर तैयार: DEPC इलाज 50% (वी / वी) विआयनीकृत formamide, 200 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, 10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, साथ विआयनीकृत पानी 5 मिमी नः 2 पीओ 4, 5 मिमी ना 2 HPO 4, 0.01 मिलीग्राम / एमएल खमीर tRNA, 1 × Denhardt के solutiपर, और डब्ल्यू 10% / वी dextran सल्फेट।
  2. एक डीएनए क्लोन कि शाही सेना पोलीमर्स प्रमोटरों के साथ एक प्लाज्मिड में ब्याज की जीन की सीडीएनए अनुक्रम में शामिल चुनें। इस उदाहरण के लिए, एक pCMV-SPORT6 क्लोन, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), T7 और Aspa के लिए SP6 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटरों (पूरक चित्रा 1) के साथ उपयोग करें।
  3. टेम्पलेट के रूप में linearized प्लास्मिड डीएनए तैयार करें।
    1. डीएनए क्लोन हो जाना, निर्माता प्रोटोकॉल और T7 और SP6 सार्वभौमिक प्राइमरों के साथ अनुक्रम के अनुसार एक छोटे पैमाने पर प्लाज्मिड शुद्धि किट के साथ प्लाज्मिड निकाल सकते हैं।
    2. डाइजेस्ट प्रतिबंध एंजाइम है कि सीडीएनए की भावना कतरा के 5 'अंत में कटौती के साथ 1,020 माइक्रोग्राम प्लास्मिड डीएनए। इस उदाहरण के लिए, pCMV-SPORT6- Aspa प्लाज्मिड को पचाने के लिए 100 यूनिट साल मैं का उपयोग करें। 37 ओ सी पर 1.5 घंटे के लिए सेते
    3. कि प्लाज्मिड पूरी तरह से linearized है की जाँच करने के लिए एक agarose जेल पर एक छोटे से विभाज्य चलाएँ।
  4. शुद्धlinearized प्लाज्मिड फिनोल के क्लोरोफॉर्म का उपयोग कर।
    1. 3 एम सोडियम एसीटेट के 1/10 की मात्रा, 10 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 8.0) की एक मात्रा जोड़ें - equilibrated फिनोल और क्लोरोफॉर्म / isoamyl शराब (आई ए ए) में से एक मात्रा (24: 1)।
    2. (- 25 डिग्री सेल्सियस, आर टी 20) और निकालने के ऊपरी जलीय चरण आरटी पर 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर क्लोरोफॉर्म / आई ए ए, सेंट्रीफ्यूज की एक मात्रा में जोड़ें और ऊपरी जलीय चरण निकाल सकते हैं।
    4. दोहराएँ कदम 1.4.3।
    5. इथेनॉल के 2 संस्करणों जोड़ें और 1 घंटा या हे / एन -20 ओ सी पर छोड़ दें।
    6. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    7. 70% ठंड इथेनॉल के साथ गोली धो लें और ते में 2.5 μl प्रति approximatively 1 माइक्रोग्राम सीडीएनए (10 मिमी Tris एचसीएल, 1 मिमी EDTA पीएच 7.5) पर फिर से निलंबित।
  5. दो जांच, एक Digoxigenin (डीआईजी) के साथ लेबल और fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के साथ अन्य synthesize।
    1. विरोधी एसई बनाने के लिए उचित आरएनए पोलीमर्स का चयन करेंएनएसई जांच (लक्ष्य mRNA के पूरक)। इस उदाहरण के लिए, T7 शाही सेना पोलीमर्स का उपयोग Aspa जांच करने के लिए।
    2. इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया तैयार: linearized डीएनए की 1 ग्राम, 4.0 μl 5 एक्स प्रतिलेखन बफर, 100 मिमी डीटीटी का 6.0 μl, 10x खुदाई या FITC शाही सेना लेबलिंग मिश्रण युक्त dNTPs के 2.0 μl, 1 μl RNase अवरोध, और 20 को जोड़ने - 40 शाही सेना पोलीमरेज़ की इकाइयों; DEPC इलाज पानी के साथ 20 μl के लिए अंतिम मात्रा को बनाते हैं।
    3. 1.5 घंटे के लिए 37 ओ सी पर सेते हैं।
  6. एक 1.0% agarose जेल पर प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के Run1 μl जाँच करने के लिए है कि प्रतिक्रिया काम किया है। जेल रेखीय टेम्पलेट और जांच की एक उज्ज्वल बैंड दिखाना चाहिए।
  7. संकरण बफर के साथ 100 μl करने के लिए खंड अप करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर 10 μl aliquots की दुकान।

2. छिड़काव, फिक्सेशन और ऊतक संग्रह

  1. चेतावनी: जब paraformaldehyde हैंडलिंग (पीएफए), दोनों ठोस औरजलीय, पीपीई पहनते हैं और एक सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग करें। 4% भंग (डब्ल्यू / वी) में पीएफए ​​1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान गर्मी (55 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके formaldehyde समाधान तैयार है। फिल्टर पेपर के साथ formaldehyde समाधान फ़िल्टर।
  2. 20% भंग (डब्ल्यू / वी) आसुत जल में सुक्रोज द्वारा सूक्रोज समाधान तैयार है और 0.1% (वी / वी) DEPC समाधान जोड़ें। आरटी पर हे / एन छोड़ दो एक ढीला ढक्कन और फिर आटोक्लेव के साथ।
  3. टर्मिनली pentobarbitone का अंतर peritoneal इंजेक्शन (50 मिग्रा / किग्रा) द्वारा एक माउस चतनाशून्य। पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें और वापसी पलटा के अभाव गहरी संज्ञाहरण इंगित करता है।
  4. एक बार माउस गहरी संज्ञाहरण के तहत है, रिब पिंजरे के नीचे एक चीरा बनाने और दोनों पक्षों पर रिब पिंजरे के माध्यम से काटा, दिल को बेनकाब करने के लिए इसे उठा।
  5. दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक 25-जी सुई डालें। दिल के सही आलिंद में एक छोटा सा चीरा।
  6. 20 मिलीलीटर पीबीएस के साथ पशु और फिर 40 मिलीलीटर formaldehyde समाधान छिड़कना। P30 और पुराने के लिएचूहों, 12 मिलीग्राम / मिनट की एक छिड़काव दर उपयोग करें, लेकिन छोटे जानवरों के लिए एक कम दर का उपयोग करने के लिए (7 - 10 मिलीग्राम / मिनट)।
  7. मस्तिष्क काटना।
    1. कान से एक कट पीछे बनाकर शल्य कैंची के साथ माउस सिर तोड़। त्वचा में एक दुम midline चीरा और rostrally काम खोपड़ी से त्वचा को हटाने के लिए।
    2. दुम भाग से शुरू, midline के साथ खोपड़ी के शीर्ष के माध्यम से और आइरिस कैंची से आंखों के बीच से काट दिया। हर बार एक हड्डी प्लेट के एक तरफ झुकने और इसे दूर तड़क चिमटी के साथ द्वारा पार्श्विका और ललाट हड्डी प्लेटें निकालें।
    3. धीरे चिमटी के साथ पूर्वकाल भाग से ऊपर की ओर मस्तिष्क झुकाव और ऑप्टिक नसों और अन्य कपाल नसों में कटौती। धीरे खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क उठा।
  8. मस्तिष्क एक माउस राज्याभिषेक मस्तिष्क मैट्रिक्स में रखें। एक पंख धार के साथ 3 लगभग 4 मिमी टुकड़ों में मस्तिष्क टुकड़ा।
  9. 4% पीएफए ​​समाधान में स्लाइस स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
  10. स्थानांतरण मस्तिष्कस्लाइस DEPC इलाज के लिए 20% sucrose के समाधान और ओ / एन सेते 4 डिग्री सेल्सियस पर
  11. एक सूखी cryomould में प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा प्लेस, इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) माध्यम के साथ चारों ओर और सूखी बर्फ पर फ्रीज। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

3. Cryosectioning

  1. एक cryostat में जमे हुए ऊतक के 15 माइक्रोन वर्गों में कटौती और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों इकट्ठा। यदि आवश्यक हो, DEPC इलाज पीबीएस के साथ वर्गों को गीला और उन्हें ठीक एक तूलिका के साथ समतल।
  2. स्लाइड छोड़ दो कि यह सुनिश्चित करने के ऊतकों स्लाइड का पालन करता है लगभग 1 घंटे के लिए सूखी।

4. संकरण

  1. 65 डिग्री सेल्सियस धो बफर तैयार: 150 मिमी NaCl, 15 मिमी ना 3 सी 3 एच 5 हे (सीओओ) 3 (= 1x खारा सोडियम साइट्रेट), 50% (वी / वी) formamide और 0.1% (वी / वी) Tween- 20।
  2. 100 मिमी Maleic एसिड, 150 मिमी NaCl, 0.1% (वी / वी) बीच -20, 7.5 पीएच: MABT बफर तैयार करें।
  3. दो जांच पतला (डीआईजी लेबल और FITC-Labelleघ) संकरण बफर में 1/1000 के 65 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म और अच्छी तरह मिलाएँ।
  4. प्रत्येक स्लाइड, coverslipwith ओवन बेक्ड (200 ओ सी) coverslips पर संकरण मिश्रण के लगभग 300 μl लागू करें और एक humidified कक्ष में 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
  5. पूर्व गर्म धो बफर युक्त एक Coplin जार में स्लाइड स्थानांतरण। धोने बफर के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर दो बार 30 मिनट के लिए स्लाइड्स धो लें।
  6. आरटी पर MABT के साथ तीन बार 10 मिनट के लिए स्लाइड्स धो लें।

5. FITC जांच के दृश्य

  1. 2% अवरुद्ध अभिकर्मक और 10% गर्मी निष्क्रिय भेड़ सीरम के साथ MABT: ISH अवरुद्ध बफर तैयार करें।
  2. वैकल्पिक: स्लाइड पर ऊतक वर्गों के आसपास हलकों आकर्षित करने के लिए एंटीबॉडी की आवश्यकता समाधान की मात्रा को कम करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक कलम का उपयोग करें।
  3. ISH एक humidified कक्ष में बफर अवरुद्ध साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए स्लाइड सेते हैं।
  4. स्लाइड हे / एन सेते एक हॉर्सरैडिश peroxidase के साथ 4 डिग्री सेल्सियस (Pod) पर - साधनाडी विरोधी FITC एंटीबॉडी 1/500 (वी / वी) ISH में अवरुद्ध बफर पतला।
  5. स्लाइड 0.1% (वी / वी) बीच -20 (PBST) के साथ पीबीएस युक्त एक Coplin जार में रखें। PBST में 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं और हर बार नए सिरे से PBST के साथ बदलें।
  6. तुरंत उपयोग करने से पहले, प्रवर्धन मंदक में 100 बार गिराए द्वारा फ्लोरोसेंट tyramide तैयार करते हैं। इस उदाहरण के लिए, का उपयोग FITC-tyramide।
  7. स्लाइड्स के लिए इस जोड़ें और आरटी पर 10 मिनट के लिए छोड़ दें।
  8. स्लाइड एक Coplin जार में रखें और 10 मिनट के लिए PBST में 3 बार धोएं।

6. डीआईजी जांच के दृश्य

  1. 0.1 एम Tris- एचसीएल पीएच 8.2 से तैयार करें।
  2. आरटी पर 1 घंटे के लिए ISH अवरुद्ध बफर के साथ स्लाइड्स सेते हैं।
  3. एक alkaline फॉस्फेट (एपी) के साथ सेते स्लाइड हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर पतला 1 / 1,500 (वी / वी) ISH में अवरुद्ध बफर संयुग्मित विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी।
  4. 10 मिनट के लिए तीन बार MABT के साथ धोएं।
  5. 0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 8.2 के साथ दो बार धो आरटी पर 5 मिनट के लिए।
  6. तुरंत उपयोग करने से पहले, 0.1 एम Tris पीएच 8.2 में गोलियाँ भंग द्वारा फास्ट लाल समाधान तैयार है। एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर।
  7. एक humidified कक्ष में फास्ट लाल समाधान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड सेते हैं। इष्टतम विकास के लिए समय नहीं रहता, स्लाइड एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ नियमित रूप से जाँच वेग के गठन पर नजर रखने के लिए। 3 घंटा - इस उदाहरण के लिए, 2 के बाद प्रतिक्रिया बंद करो।
  8. 10 मिनट के तीन बार के लिए PBST के साथ धो लें।

7. Immunohistochemistry

  1. आईएचसी अवरुद्ध बफर तैयार: 10% (वी / वी) PBST में (प्राथमिक एंटीबॉडी होस्ट करने के लिए एक अलग प्रजाति के) सीरम।
  2. आईएचसी एक humidified कक्ष में आरटी पर 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध साथ स्लाइड्स सेते हैं।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार: (प्राथमिक एंटीबॉडी होस्ट करने के लिए एक अलग प्रजाति के) 5% सीरम के साथ PBST में एक उपयुक्त कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी पतला। इस उदाहरण के लिए, पर 1/400 (वी / वी) कमजोर पड़ने एक खरगोश विरोधी Olig2 एंटीबॉडी का उपयोग करें।
  4. 4 डिग्री सीओ / एन पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में सेते हैं।
  5. 10 मिनट के तीन बार के लिए PBST के साथ धो लें।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार: एक fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी 5% के साथ PBST में एक उपयुक्त कमजोर पड़ने पर पतला (वी / वी) सीरम और 0.1% (वी / वी) Hoechst 33258. (प्राथमिक एंटीबॉडी होस्ट करने के लिए एक अलग प्रजाति के) इस उदाहरण के लिए , 1/1000 (वी / वी) कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी Alexa647 एक गधा विरोधी खरगोश का उपयोग करें।
  7. 1 घंटे के लिए आरटी पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में सेते हैं।
  8. 10 मिनट के तीन बार के लिए PBST के साथ धो लें।

8. बढ़ते

  1. आंशिक रूप से आरटी पर स्लाइड सूखी, और एक प्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम के साथ माउंट। स्लाइड छोड़ दो 10X के तहत एक confocal खुर्दबीन में छवि को सुखाने के लिए और फिर, 20X और 63X उद्देश्यों उत्तेजना तरंग दैर्ध्य निम्नलिखित के साथ 4 अलग अलग चैनलों का उपयोग: फास्ट लाल के लिए 570 एनएम, FITC के लिए 488 एनएम, Olig2 immunolabelling के लिए 647 एनएम और Hoechst के लिए 350 एनएम ।

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Representative Results

यह लेख एक डबल प्रतिदीप्ति ISH माउस मस्तिष्क वर्गों में immunolabelling के द्वारा पीछा के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त विवरण चित्र 1 में दिखाया गया है पहला कदम Aspa और MBP (माइलिन बुनियादी प्रोटीन) के लिए विशेष जांच के संश्लेषण के लिए किया गया था। जाँच करने के लिए है कि जांच संश्लेषित किया गया था, प्रत्येक प्रतिक्रिया के एक छोटे से विभाज्य एक agarose जेल पर चलाया गया था। बेहोश रेखीय टेम्पलेट और आरएनए जांच की एक बड़ी राशि (चित्रा 2) को देखा जा सकता है। Aspa और MBP के लिए डबल प्रतिदीप्ति ish, Olig2 immunolabelling और Hoechst परमाणु धुंधला द्वारा पीछा किया, माउस मस्तिष्क वर्गों पर प्रदर्शन किया गया था। हम MBP पॉजिटिव में एक confocal खुर्दबीन में मस्तिष्क वर्गों स्कैन और मस्तिष्क में जीन की अभिव्यक्ति संकेतों के वितरण प्रकट करने के लिए एक साथ छवियों सिले। Aspa अभिव्यक्ति (MBP +) कोशिकाओं ब्रा भर में मनाया गया (चित्रा 3) में। हम भी एक उच्च बढ़ाई का उपयोग कर विभिन्न मस्तिष्क संरचना में Aspa अभिव्यक्ति की जांच की। कोर्टेक्स और महासंयोजिका में oligodendrocytes में Aspa अभिव्यक्ति 4 चित्र में दिखाए जाते हैं। MBP, Olig2 के सह स्थानीयकरण, और Aspa इंगित करता है कि Aspa कोर्टेक्स और महासंयोजिका (चित्रा 4) में परिपक्व oligodendrocytes के एक सबसेट में व्यक्त किया जाता है। ये परिणाम है कि इस प्रोटोकॉल एक साथ मस्तिष्क वर्गों में तीन अलग-अलग जीनों की अभिव्यक्ति का पता लगा सकते प्रदर्शित करता है।

आकृति 1
चित्रा 1. डबल प्रतिदीप्ति के लिए प्रोटोकॉल स्वस्थानी संकरण में Immunostaining द्वारा पीछा किया। इस प्रोटोकॉल में 5 दिन से अधिक रन और तीन जीनों की अभिव्यक्ति का पता लगाता है।/files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. agarose जेल। रेखीय टेम्पलेट और एक कम आणविक वजन की शाही सेना जांच मनाया जा सकता है की एक बड़ी राशि पर Aspa आरएनए जांच की परीक्षा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
माउस मस्तिष्क वर्गों में Aspa और MBP के लिए बगल में संकरण में चित्रा 3. डबल प्रतिदीप्ति। Aspa (लाल) और MBP (हरा) के वितरण को दिखाने के लिए एक साथ सिले थे। स्केल पट्टी:। 500 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. कॉर्टेक्स और महासंयोजिका में oligodendrocytes में Aspa की अभिव्यक्ति। पैनलों Aspa (लाल) और MBP (हरा) Olig2 (नीला) के immunostaining द्वारा पीछा ISH से प्रतिनिधि छवियों को दिखाने Hoechst धुंधला हो जाना। Aspa के साथ संयुक्त कुछ में व्यक्त की गई थी MBP + / Olig2 + कोशिकाओं कोर्टेक्स (ए और बी) और महासंयोजिका में (सी और डी)। एम बीपी + / Olig2 + / Aspa + कोशिकाओं तीर और MBP + / Olig2 + / Aspa के साथ संकेत कर रहे हैं - कोशिकाओं बढ़े पैनल (बी और डी) में तीर के साथ संकेत कर रहे हैं। स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन (ए और सी); 20 माइक्रोन (बी और डी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1

पूरक चित्रा 1. अनुक्रम और Aspa क्लोन के मानचित्र (IRAVp968C0654D)। Aspa की 1.5kb सीडीएनए अनुक्रम pCMV-Sport6 ​​प्लाज्मिड (ए) में डाला गया था। PCMV-Sport6-Aspa प्लाज्मिड के नक्शे (बी) में दिखाया गया है।M / फ़ाइलें / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल सीटू संकरण में एक डबल आरएनए immunostaining के द्वारा पीछा के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया प्रदान करता है। हम पुष्टि करते हैं कि Aspa कई मस्तिष्क क्षेत्रों में परिपक्व oligodendrocytes में व्यक्त किया जाता है इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है।

यह बहु कदम प्रक्रिया कई संभावित नुकसान है कि संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकते हैं और बचा जाना चाहिए है। सबसे पहले, सभी समाधान और प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए भंडारण बफ़र्स RNase मुक्त होने की जरूरत है। दूसरा, सीडीएनए टेम्पलेट्स के चुनाव महत्वपूर्ण है और हम लंबाई में लगभग 1kb टेम्पलेट्स पसंद करते हैं। इन विट्रो प्रतिलेखन से पहले उन्हें यह फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और साथ सीडीएनए टेम्पलेट्स को साफ करने के लिए आवश्यक है फिर से वेग। इसके अलावा, जांच के प्रतिलेखन इष्टतम होने की जरूरत है; यदि जांच के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पादन नहीं है, यह ISH की गुणवत्ता कम हो जाएगा। जांच की गुणवत्ता एक agarose जेल पर यह परीक्षण करके जाँच की जा सकती है और अच्छी गुणवत्ता की जाएगीटेम्पलेट बैंड (चित्रा 2) की तुलना में जांच बैंड की मजबूत चमक इसका सबूत है। डबल ISH के लिए, दो अलग लेबल जांच इस्तेमाल कर रहे हैं, आम तौर पर एक डीआईजी के साथ लेबल और FITC के साथ अन्य। FITC लेबल जांच कम से कम पता लगाने योग्य होने के लिए और जहां लक्ष्य mRNA ऊतक में सबसे ज्यादा होने की उम्मीद है चुना जाना चाहिए माना जाता है। यह जांच आमतौर पर पहली बार विकसित की है और डीआईजी लेबल जांच दूसरे विकसित की है।

एक और महत्वपूर्ण कदम ऊतक तैयारी है। चूहे DEPC इलाज पीबीएस 4% पीएफए ​​के द्वारा पीछा के साथ भरकर रखा जाता है, के बाद तय 4% पीएफए ​​हे / एन में और फिर 20% sucrose के समाधान है कि किसी भी अवशिष्ट को नष्ट करने के RNase DEPC इलाज किया cryoprotected में। फिक्सेशन समय काफी महत्वपूर्ण है; अधिक या कम-निर्धारण कम कर जांच पैठ (ओवर-निर्धारण) या mRNA (अंडर नियतन) की गिरावट के कारण शायद, एक कमजोर संकेत हो सकता है। ऊतक तो cryosectioned जाता है और दो जांच संकरित हैं हे / एन। formamideसंकरण बफर में इस्तेमाल de-ionized की जरूरत है। 65 सी में हे / एन संकरण के दौरान एक बहुत महत्वपूर्ण विचार वाष्पीकरण और संकरण मिश्रण की एकाग्रता से बचने के लिए के रूप में यह संवेदनशीलता समझौता हो सकता है। प्रयोग में वर्णित है कि हम 65 सह / एन पर संकरण प्रदर्शन किया है, लेकिन अगर यह लक्ष्य mRNA पता लगाने के लिए मुश्किल हो गया लगता है यह अलग जांच के लिए कम तापमान की कोशिश कर रहा लायक हो सकता है।

संकरित जांच पता लगाने के लिए अभिकर्मकों के एक विकल्प नहीं है। फास्ट लाल एक संवेदनशील फ्लोरोसेंट अभिकर्मक है लेकिन न फास्ट लाल के सभी बैचों ही परिणाम देते हैं। यह विकास के लिए एपी की जरूरत है और rhodamine उत्तेजना के साथ प्रतिदीप्ति देता है। हमारे अनुभव में, यह यह 0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 8.2 के साथ नए सिरे से बनाने के लिए और उपयोग करने से पहले यह फिल्टर करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक गैर फ्लोरोसेंट विकल्प नाइट्रो-नीले tetrazolium (एनबीटी) और 5 ब्रोमो-4-क्लोरो-3'-indolyphosphate (BCIP) जो एक ही एपी संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ काम करता है के साथ रंग विकास है। Anoवहाँ विकल्प का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट tyramide का उपयोग कर रहा है। हालांकि फ्लोरोसेंट tyramide सिस्टम सबसे संवेदनशील तरीकों नहीं कर रहे हैं, हॉर्सरैडिश peroxidase के साथ विकसित की प्रतिक्रिया बहुत जल्दी है और वहाँ कम से कम तीन फ्लोरोसेंट रंगों (FITC, 3 और जाती जाती 5) है कि इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि कुछ लक्ष्य एंटीजन (या epitopes), विशेष रूप से कम बहुतायत प्रोटीन, ईश प्रक्रिया के बाद detectable नहीं हो सकता है और इसलिए नहीं ISH के बाद आईएचसी के लिए उपयुक्त हैं हो सकता है। हमारे immunostaining में, Olig2 के एंटीबॉडी का पता लगाने अप्रभावित दिखाई देता है। उपयोगकर्ता निम्न ISH immunolabelling लिए सही एंटीबॉडी का चयन करने की आवश्यकता होगी।

आईएचसी और ISH आमतौर पर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन के लिए तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं, और दोनों पेशेवरों और बुरा है। आईएचसी मस्तिष्क वर्गों में जीनों की अभिव्यक्ति सेलुलर का पता लगाने के लिए एक बेहद संवेदनशील तरीका है, लेकिन एंटीबॉडी पर अपनी निर्भरता को अपनी विशिष्टता को प्रभावित करता है और उसके आवेदन की सीमा। इसके विपरीत, ईश एक उच्च कल्पना हैificity और किसी भी जीन की जांच आसानी से टेम्पलेट के रूप में जीन विशिष्ट सीडीएनए का उपयोग कर इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल है कि हम विकसित दोनों तरीकों का लाभ लेता है, आईएचसी के साथ डबल ISH के संयोजन उच्च विशिष्टता के साथ जीन अभिव्यक्ति की ट्रिपल का पता लगाने प्राप्त करने के लिए।

संक्षेप में, प्रोटोकॉल हम यहाँ वर्णन दो mRNAs और एक प्रोटीन की एक साथ धुंधला सक्षम बनाता है, तो यह सह स्थानीय जीन अभिव्यक्ति illustrating के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है। तथ्य यह है कि mRNA अभिव्यक्ति हमेशा प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ संबंध स्थापित नहीं करता है के बावजूद, ईश एक शक्तिशाली तकनीक है कि हमें उच्च विशिष्टता के साथ जीन अभिव्यक्ति की जांच करने की अनुमति देता है। आईएचसी के साथ संयुक्त डबल प्रतिदीप्ति ISH की हमारी प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों में oligodendrocytes के एक सबसेट में Aspa अभिव्यक्ति का पता लगाने में सफलता साबित हुई है, और यह आसानी से अलग मूल और विकास के चरणों के ऊतकों की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉलभी इस तरह के miRNA के रूप में छोटे RNAs की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
Deionized formamide Sigma F9037 for ISH blocking buffer
Sodium chloride Sigma S3014
Trizma Base Sigma T1503
Hydrochloric acid VWR International 20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous Sigma S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate Sigma 30435
Yeast tRNA Roche 10109495001
50x Denhardt's solution Life Technologies 750018
Dextran sulfate Sigma D8906
Aspa cDNA clone Source Bioscience IRAVp968C0654D
SalI New England Biolabs R0138
Sodium acetate Sigma S2889
Equilibrated phenol Sigma P4557
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Isoamyl alcohol Aldrich 496200
Ethanol VWR International 20821.321
T7 RNA polymerase Promega P4074
Transcription buffer Promega P118B
100 mM DTT Promega P117B
UTP-DIG NTP mix Roche 11277073910
Rnasin Promega N251B
Paraformaldehyde Sigma P6148
Filter paper Fisher scientific 005479470
Sucrose Sigma 59378
Diethyl pyrocarbonate Sigma D5758
Pentobarbitone Animalcare Ltd BN43054
Dissecting scissors World Precision Instruments 15922
25 gauge needle Terumo 300600
Peristaltic pump Cole-Parmer Instrument Co. Ltd WZ-07522-30
Iris scissors Weiss 103227
No.2 tweezers World Precision Instruments 500230
Coronal Brain Matrix World Precision Instruments RBMS-200C
Razor blade Personna Medical PERS60-0138
OCT medium Tissue tek 4583
Cryostat/microtome Bright
Superfrost plus slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Sodium citrate Sigma S4641 for 65 °C wash buffer
Formamide Sigma-Aldrich F7503
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379
Coverslips VWR International 631-0146
Coplin Jar Smith Scientific Ltd 2959
Blocking reagent Roche 11096176001
Heat-inactivated sheep serum Sigma S2263
Hydrophobic pen Cosmo Bio DAI-PAP-S 1:500
α-FITC POD-conjugated antibody Roche 11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System Perkin Elmer NEL741001KT 1:1,500
α-DIG AP-conjugated Roche 11093274910
Fast red tablets Roche 11496549001
.22 µM filter Millex SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody Millipore AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody Life technologies A-31573 1:1,000
bisBenzimide H 33258 sigma B2883
Mounting medium Dako S3023
Leica SP2 confocal microscope Leica

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 109, immunohistochemistry जीन अभिव्यक्ति oligodendrocytes ASPA Canavan रोग
डबल प्रतिदीप्ति का मेल<em&gt; बगल में</em&gt; माउस मस्तिष्क वर्गों में तीन जीनों की अभिव्यक्ति की जांच के लिए Immunolabelling साथ संकरण
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Jolly, S., Fudge, A., Pringle, N., Richardson, W. D., Li, H. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (109), e53976, doi:10.3791/53976 (2016).

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