Abstract
Påvisning af genekspression i forskellige typer af hjerneceller, f.eks, neuroner, astrocytter, oligodendrocytter, oligodendrocyt prækursorer og mikroglia, kan blive hæmmet af manglen på specifikke primære eller sekundære antistoffer til immunfarvning. Her beskriver vi en protokol til påvisning af ekspression af tre forskellige gener i den samme hjerne afsnittet med dobbeltklæbende fluorescens in situ hybridisering med to genspecifikke prober efterfulgt af immunfarvning med et antistof af høj specificitet rettet mod proteinet kodet af et tredje gen. Den Aspartoacyclase (ASPA) gen, mutationer af hvilket kan føre til en sjælden human hvid substans sygdom - Canavan sygdom - menes at blive udtrykt i oligodendrocytter og mikroglia, men ikke i astrocytter og neuroner. Imidlertid har endnu ikke fastslået den præcise ekspressionsmønsteret for ASPA i hjernen. Denne protokol har givet os mulighed for at afgøre, at ASPA udtrykkes i en delmængde af moden oligodendrocytter ennd det kan generelt anvendes til en bred vifte af genekspression mønster undersøgelser.
Introduction
Gliaceller, som er de mest udbredte celler i centralnervesystemet (CNS), omfatter oligodendrocytter (de myelinerende celler CNS), oligodendrocytter forstadier (OP, også kendt som "NG2 celler"), astrocytter og mikroglia. Der er stigende interesse for de funktioner, gliaceller og deres potentielle rolle i neurologiske sygdomme 1. For eksempel Canavan sygdom (CD) er en arvelig neurodegenerativ lidelse starter tidligt i barndom med spongiform leukodystrofi og et progressivt tab af neuroner, hvilket fører til døden normalt før 10 års alderen 2,3. Mutationer i Aspartoacyclase (ASPA) gen, der fører til drastisk reduceret ASPA aktivitet 4 i CD er blevet identificeret. ASPA er et enzym katalyserer deacetylering af N-acetylaspartate (NAA), et molekyle stærkt koncentreret i hjernen, genererer acetat og aspartat 5-7. Mange CD patienter viser højere niveauer af NAA grund af manglende ASPA acvitet. Nogle undersøgelser spekulere at NAA-afledte acetat kunne være en væsentlig kilde til fedtsyrer / lipider i hjernen under udvikling og CD kan skyldes nedsat myelin syntese under udvikling forårsaget af svigt i NAA opdeles 3,5,6.
ASPA findes overvejende i nyrerne, leveren og hvide substans i hjernen, og i betragtning af den vigtige rolle, som ASPA i CD, har den cellulære ekspression af dette enzym i hjernen blevet undersøgt af flere laboratorier. Ved at se på ASPA enzymatisk aktivitet i hjernen, tidligere undersøgelser vist, at stigningen i ASPA aktivitet under hjernens udvikling paralleller tidsforløbet af myelinering 8-10. På celleniveau, analyser assays for enzymatisk aktivitet samt in situ-hybridisering (ISH) og immunhistokemi (IHC) antyder, at ASPA hovedsagelig udtrykkes i oligodendrocytter i hjernen, men ikke i neuroner eller astrocytter 11-16. Enkelte undersøgelser vist, at ASPA måske ogsåudtrykkes i mikroglia i CNS 12,14. Hidtil data om ASPA udtryk i OP'er er begrænsede. Ifølge en nylig undersøgelse, hvor transcriptomes af forskellige celletyper i mus hjernebarken, herunder neuroner, astrocytter, OP'er, nydannede oligodendrocytter, myelinerende oligodendrocytter, mikroglia, endotelceller og pericytter blev analyseret ved RNA-sekventering 17 er ASPA udelukkende udtrykkes i oligodendrocytter , navnlig i myelinerende oligodendrocytter (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). På trods af disse undersøgelser af ASPA udtryk mønster i hjernen, en række usikkerheder tilbage.
Forskellige teknikker kan anvendes til at studere genekspressionsmønstre. IHC er en almindeligt anvendt fremgangsmåde til påvisning af funktionelt produkt (dvs. protein) af et gen-ekspression i vævssnit. Trods sin store nytte har denne teknik begrænsninger som dens anvendelse og specificitet er underlagt to tilgængeligheden og specificitet af antistoffet nødvendig. Til sammenligning ISH har den fordel at være i stand til at afsløre ekspressionen af ethvert gen på mRNA-niveauet. Men det kan være teknisk udfordrende at anvende flere prober på samme tid for at lokalisere en genekspression til specifikke celletyper. I denne artikel beskriver vi en protokol kombinerer dobbelt fluorescens-RNA in situ hybridisering med fluorescens immunomærkning af et protein. Vi har anvendt dette sæt af teknikker til at undersøge ekspressionsmønsteret for Aspa i musehjerne. Denne fremgangsmåde tillader den præcise undersøgelse af genekspression under anvendelse af konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement:
Mus dyrehold og håndtering er i overensstemmelse med UK hjemmekontor regler og UCL retningslinjer etisk komité, som opfylder Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 i Det Forenede Kongerige og ændringen Regulations 2012.
BEMÆRK: Alle løsninger skal foretages med diethylpyrocarbonat (DEPC) - behandlet vand for at ødelægge enhver resterende RNase. For DEPC behandling, tilføje DEPC (1 ml pr liter), ryst kraftigt, indtil alle DEPC kugler er forsvundet derefter autoklaveres at forringe DEPC.
1. RNA probesyntese
- ADVARSEL: Ved håndtering formamid, slid personlige værnemidler (PPE) og bruge en sikkerhed kabinet. Forbered hybridiseringsbuffer: DEPC-behandlet deioniseret vand med 50% (v / v) deioniseret formamid, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml gær-tRNA, 1 × Denhardts solutipå, og 10% vægt / volumen dextransulfat.
- Vælg en DNA-klon, der indeholder cDNA-sekvensen af genet af interesse i et plasmid med RNA-polymerase promotorer. I dette eksempel bruge en pCMV-SPORT6 klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), med T7 og SP6-RNA-polymerase initiativtagere til Aspa (Supplerende figur 1).
- Forbered lineariserede plasmid-DNA som template.
- Grow DNA-klon, ekstraher plasmidet med en mindre plasmid oprensning kit ifølge producentens protokol og sekvensen med T7 og Sp6 universelle primere.
- Fordøje 1,020 ug plasmid-DNA med et restriktionsenzym, der skærer ved 5'-enden af sense-strengen af cDNA'et. I dette eksempel bruger 100 enhed Sall at fordøje pCMV-SPORT6- Aspa plasmid. Inkuber i 1,5 timer ved 37 ° C.
- Køre en lille alikvot på en agarosegel for at kontrollere, at plasmidet er fuldt lineariseret.
- Oprenslineariserede plasmid anvendelse af phenol-chloroform.
- Tilføj 1/10 volumen 3 M natriumacetat, et volumen 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) - ækvilibreret phenol og et volumen chloroform / isoamylalkohol (IAA) (24: 1).
- Centrifuger ved 16.000 x g i 1 min ved stuetemperatur (20 - 25 ° C, RT) og ekstraher øvre vandige fase.
- Tilsæt en volumen chloroform / IAA, centrifugeres ved 16.000 xg i 1 min og ekstraher øvre vandige fase.
- Gentag trin 1.4.3.
- Tilsæt 2 volumener ethanol og henstår ved -20 ° C i 1 time eller O / N.
- Der centrifugeres ved 16.000 xg ved 4 ° C i 10 minutter. Supernatanten kasseres.
- Vask pelleten med 70% kold ethanol og resuspender på tilnærmelsesvis 1 ug cDNA pr 2,5 pi i TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA pH 7,5).
- Syntetisere to prober, den ene mærket med digoxigenin (DIG) og den anden med fluoresceinisothiocyanat (FITC).
- Vælg den relevante RNA-polymerase for at gøre anti-seNSE probe (komplementær til target mRNA). I dette eksempel anvender T7 RNA-polymerase for at gøre Aspa probe.
- Forbered in vitro transcription reaktionen: tilsættes 1 ug af det lineariserede DNA, 4,0 pi 5 x transkription puffer, 6,0 pi 100 mM DTT, 2,0 pi 10x DIG eller FITC RNA mærkning mix indeholdende dNTP'er, 1 pi RNase inhibitor, og 20 - 40 enheder af RNA-polymerase; foretage den endelige volumen op til 20 pi med DEPC-behandlet vand.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 1,5 timer.
- Run1 pi af transkriptionsreaktion på en 1,0% agarosegel for at kontrollere, at reaktionen har fungeret. Gelen skal vise den lineære skabelon og et lyst bånd af proben.
- Der fyldes op til 100 pi med hybridiseringsbuffer og gemme 10 pi prøver ved -80 ° C.
2. Perfusion, Fiksering og Tissue Collection
- ADVARSEL: Ved håndtering af paraformaldehyd (PFA), både fast ogvandig, slid PPE og bruge en sikkerhed kabinet. Forbered formaldehydopløsning ved opløsning 4% (w / v) PFA i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) opløsning under anvendelse af varme (55 ° C). Filtreres formaldehydopløsning med filtrerpapir.
- Forbered saccharoseopløsning ved opløsning 20% (vægt / volumen) saccharose i destilleret vand, og der tilsættes 0,1% (v / v) DEPC løsning. Efterlad O / N ved stuetemperatur med en løs låg og derefter autoklave.
- Terminalt bedøve en mus ved intraperitoneal injektion af pentobarbiton (50 mg / kg). Vurdere dybden af anæstesi ved tå knivspids og fraværet af tilbagetrækning refleks indikerer dyb anæstesi.
- Når musen er under dyb anæstesi, lave et snit under brystkassen og skære gennem brystkassen på begge sider, løfte den for at blotlægge hjertet.
- Indsæt en 25-G kanyle i den venstre ventrikel af hjertet. Lave et lille snit i højre atrium af hjertet.
- Perfundere dyret med 20 ml PBS og derefter 40 ml formaldehydopløsning. For P30 og ældremus, brug en perfusion på 12 ml / min, men for yngre dyr bruge en lavere (7: - 10 ml / min).
- Dissekere hjernen.
- Sever musen hovedet med kirurgiske saks ved at lave et snit posterior fra ørerne. Lav en caudale midtlinie snit i huden og arbejder rostrally at fjerne huden fra kraniet.
- Med udgangspunkt i den caudale del, skære gennem toppen af kraniet langs midterlinien og mellem øjnene med Iris saks. Fjern parietale og knogleplader frontal ved at vippe den ene side af en knogleplade hver gang og klikke det ud med en pincet.
- vippe forsigtigt hjernen opad fra den forreste del med en pincet og skære de optiske nerver og andre kranienerver. Løft forsigtigt hjernen ud af kraniet.
- Placer hjernen i en mus coronal hjerne matrix. Skær hjernen til 3 ca. 4 mm stykker med en fjer barberblad.
- Overfør skiverne i 4% PFA-opløsning og inkuber O / N ved 4 ° C.
- Transfer hjerneskiver til DEPC-behandlet 20% sucroseopløsning og inkuber O / N ved 4 ° C
- Placer hver hjerne skive i en tør cryomould, surround med optimal skære temperatur (OCT) medium og fryse på tøris. Opbevar ved -80 ° C.
3. Cryosectioning
- Skær 15 um snit frosset væv i en kryostat og indsamle afsnittene på mikroskopobjektglas. Hvis det er nødvendigt, våd afsnittene med DEPC-behandlet PBS og gøre dem flade med en fin pensel.
- Efterlad objektglassene tørre i ca. 1 time for at sikre, at vævet klæber til objektglasset.
4. Hybridisering
- Forbered 65 ° C vaskebuffer: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x saltvand natriumcitrat), 50% (vol / vol) formamid og 0,1% (vol / vol) Tween- 20.
- Forbered MABT buffer: 100 mM maleinsyre, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5.
- Fortynd de to prober (DIG-mærket og FITC-labelled) 1 / 1.000 i hybridiseringsbuffer forvarmet til 65 ° C og bland godt.
- Påfør omkring 300 pi hybridisering blandingen på hvert objektglas, coverslipwith ovnbagte (200 ° C) dækglas og inkuber O / N ved 65 ° C i et fugtigt kammer.
- Overfør dias i en Coplin krukke indeholdende forvarmet vaskebuffer. Vaskes objektglassene i 30 minutter to gange ved 65 ° C med vaskebuffer.
- Vaskes objektglassene i 10 minutter tre gange med MABT ved stuetemperatur.
5. Visualisering af FITC Probe
- Forbered ISH blokerende buffer: MABT med 2% blokerende reagens og 10% varmeinaktiveret fåreserum.
- Valgfrit: Brug en hydrofob pen til at tegne cirkler omkring vævssnit på dias for at reducere mængden af antistof-løsninger, der kræves.
- Glassene inkuberes tildækket i 1 time ved stuetemperatur med ISH blokerende buffer i et fugtigt kammer.
- Glassene inkuberes tildækket O / N ved 4 ° C med en peberrodsperoxidase (POD) - konjugatd anti-FITC-antistof fortyndet 1/500 (v / v) i ISH blokeringsbuffer.
- Objektglassene anbringes i en Coplin beholder indeholdende PBS med 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). Vask 3 gange i 10 minutter i PBST og erstat med frisk PBST hver gang.
- Umiddelbart før brug, forberede fluorescerende tyramid ved at fortynde 100 gange i Amplification fortynder. I dette eksempel bruger FITC-tyramid.
- Tilføj til dias og lad i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Objektglassene anbringes i en Coplin krukke og vask 3 gange i PBST i 10 minutter.
6. Visualisering af DIG Probe
- Forbered 0,1 M Tris HCI pH 8,2.
- Glassene inkuberes tildækket med ISH blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur.
- Glassene inkuberes tildækket O / N ved 4 ° C med en basisk phosphatase (AP) -konjugeret anti-DIG-antistof fortyndet 1 / 1.500 (v / v) i ISH blokeringsbuffer.
- Vask med MABT i 10 minutter tre gange.
- Vask to gange med 0,1 M Tris-HCI pH 8,2 i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Umiddelbart før brug forberede Fast Red-opløsning ved at opløse tabletterne i 0,1 M Tris pH 8,2. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 uM filter.
- Glassene inkuberes tildækket ved 37 ° C med Fast Red-opløsning i et fugtigt kammer. Tidspunkt for optimal udvikling varierer, kontrollere objektglassene regelmæssigt med et fluorescerende mikroskop for at overvåge dannelsen af bundfald. I dette eksempel standse reaktionen efter 2 - 3 i timer.
- Vask med PBST i 10 minutter tre gange.
7. Immunhistokemi
- Forbered IHC blokeringspuffer: 10% (v / v) serum (af en anden art end primært antistof host) i PBST.
- Inkuber objektglassene med IHC blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.
- Forbered primært antistof: fortynd det primære antistof ved en passende fortynding i PBST med 5% serum (af en anden art end primært antistof host). I dette eksempel bruger en kanin anti-Olig2 antistof ved 1/400 (v / v) fortynding.
- Inkuber i det primære antistof opløsning ved 4 ° CO / N.
- Vask med PBST i 10 minutter tre gange.
- Forbered sekundært antistof: fortynd en fluorofor-konjugeret sekundært antistof ved en passende fortynding i PBST med 5% (v / v) serum (af en anden art end primært antistof host) og 0,1% (volumen / volumen) Hoechst 33258. Til dette eksempel Brug et æsel-anti-kanin Alexa647 sekundært antistof ved 1 / 1.000 (v / v) fortynding.
- Inkuber i det sekundære antistof opløsning ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask med PBST i 10 minutter tre gange.
8. Montering
- Delvist tørre dias på RT, og montere med en fluorescens montering medium. Lad objektglassene tørre og derefter billede i et konfokalt mikroskop under 10X, 20X og 63X mål ved hjælp af 4 forskellige kanaler med følgende excitationsbølgelængder: 570 nm for Fast Red, 488 nm for FITC, 647 nm for Olig2 immunomærkning og 350 nm for Hoechst .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikel beskriver en fremgangsmåde til en dobbelt fluorescens ISH efterfulgt af immunomærkning i musehjerne sektioner. En kort beskrivelse af denne protokol er vist i figur 1. Det første trin var at syntetisere prober specifikke for Aspa og MBP (myelin basisk protein). For at kontrollere at proberne var blevet syntetiseret, blev en lille portion af hver reaktion kørt på en agarosegel. Den svage lineære skabelon og en stor mængde af RNA-proben kan ses (figur 2). Dobbelt fluorescens ISH for Aspa og Mbp, efterfulgt af Olig2 immunomærkning og Hoechst nuklear farvning, blev udført på mus hjernesektioner. Vi scannet hjernen sektioner i et konfokalt mikroskop og syet billederne sammen for at afsløre fordelingen af genekspression signaler i hjernen. Aspa ekspression i Mbp -positiv (MBP +) celler blev observeret i hele bra i (figur 3). Vi undersøgte også Aspa ekspression i forskellige hjerneområder strukturer under anvendelse af en større forstørrelse. Aspa ekspression i oligodendrocytter i cortex og corpus callosum er vist i figur 4. Den co-lokalisering af MBP, Olig2, og Aspa indikerer at aspa udtrykkes i en delmængde af modne oligodendrocytter i cortex og corpus callosum (figur 4). disse resultater viser, at denne protokol samtidigt kan detektere ekspressionen af tre forskellige gener i hjernesektioner.
Figur 1. Protokol for Double Fluorescens in situ-hybridisering Efterfulgt af Immunfarvning. Denne protokol løber over 5 dage og detekterer ekspression af tre gener./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Undersøgelse af Aspa RNA Probe på agarosegel. Den lineære skabelon og en stor mængde af det kan observeres RNA-probe af mindre molekylvægt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dobbelt Fluorescens in situ hybridisering til Aspa og Mbp i musehjerne Sektioner. Aspa (rød) og MBP (grøn) i hjernen. Målestok:. 500 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ekspression af Aspa i Oligodendrocytter i cortex og corpus callosum. Paneler viser repræsentative billeder fra ISH for Aspa (rød) og MBP (grøn) efterfulgt af immunfarvning af Olig2 (blå) kombineret med Hoechst-farvning. Aspa blev udtrykt i nogle MBP + / Olig2 + celler i cortex (A og B) og i corpus callosum (C og D). M bp + / Olig2 + / Aspa + celler er angivet med pile og Mbp + / Olig2 + / Aspa - celler er angivet med pilespidser i de forstørrede paneler (B og D). Scale barer: 100 um (A og C); 20 pm (B og D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur 1. Sekvens og kort over Aspa Klon (IRAVp968C0654D). 1,5 kb cDNA-sekvensen af Aspa blev indsat i pCMV-Sport6 plasmid (A). Kortet over pCMV-Sport6-Aspa plasmid er vist i (B).m / filer / ftp_upload / 53.976 / 53976supfig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en trin-for-trin procedure for en dobbelt RNA in situ hybridisering efterfulgt af immunfarvning. Vi har brugt denne protokol til at bekræfte, at Aspa udtrykkes i modne oligodendrocytter på flere områder i hjernen.
Denne multi-trins procedure har mange potentielle faldgruber, der kan påvirke følsomhed og bør undgås. Først, alle opløsninger og opbevaring puffere til transkription reaktion skal være RNase-fri. For det andet, at valget af cDNA templates er vigtig, og vi foretrækker skabeloner omtrent 1 kb i længden. Det er nødvendigt at rense cDNA skabeloner med phenol / chloroform-ekstraktion og re-udfælde dem før in vitro-transkription. Desuden transkriptionen af proben skal være optimal; hvis sonden ikke produceres i tilstrækkelig mængde, vil det reducere kvaliteten af ISH. Kvaliteten af proben kan kontrolleres ved at undersøge det på en agarosegel og god kvalitet vil værefremgår af den stærke lysstyrke af sonden båndet sammenlignet med skabelonen bånd (figur 2). For dobbelt ISH, er to forskelligt mærkede prober anvendes, sædvanligvis en mærket med DIG og den anden med FITC. FITC-mærkede probe anses for at være den mindst detekterbare og bør vælges, hvor det forventes target mRNA at være højest i vævet. Denne probe er normalt udvikles først og DIG-mærkede probe er udviklet sekund.
Et andet kritisk trin er fremstillingen væv. Mus perfunderet med DEPC-behandlet PBS efterfulgt af 4% PFA, post-fikseret i 4% PFA O / N og derefter kryobeskyttet i 20% sucrose løsninger, der er DEPC-behandlet for at ødelægge eventuelt resterende RNase. Fiksering tid er ret vigtigt; over- eller under-fiksering kan føre til en svagere signal, måske på grund af reduceret sonde penetration (over-fiksering) eller nedbrydning af mRNA (under-fiksering). Vævet derefter cryosectioned og to prober hybridiseres O / N. formamidetanvendes i hybridiseringsbufferen skal de-ioniseret. En meget vigtig overvejelse under O / N-hybridisering ved 65 ° C er at undgå fordampning og koncentrering af hybridiseringsblandingen som den kunne kompromittere følsomhed. I eksperimentet beskrevet udførte vi hybridisering ved 65 Co / N, men det kan være værd at forsøge lavere temperaturer for forskellige prober, hvis det viser sig at være vanskelig at opdage target mRNA.
Der er et valg af reagenser til detektering af de hybridiserede prober. Fast Red er en følsom fluorescerende reagens, men ikke alle partier af Fast Red give samme resultat. Det har brug for AP for udvikling og giver fluorescens med rhodamin excitation. Det er vores erfaring, er det vigtigt at gøre det friske med 0,1 M Tris-HCI pH 8,2 og filtreres før brug. En ikke-fluorescerende mulighed er farveudvikling med nitro-blå tetrazolium (NBT) og 5-brom-4-chlor-3'-indolyphosphate (BCIP), der arbejder med den samme AP-konjugeret antistof. AnoTher mulighed er at bruge fluorescerende tyramid til påvisning. Selvom fluorescerende tyramid systemer er ikke de mest følsomme metoder, udviklingslandene omsætning med peberrodsperoxidase er meget hurtig, og der er mindst tre fluorescerende farver (FITC, Cyanin 3 og Cyanin 5), der kan anvendes. En begrænsning ved denne protokol er, at nogle målantigener (eller epitoper), især lav hyppighed proteiner, ikke kan være detekterbart efter ISH proces og er derfor ikke egnede til IHC efter ISH. I vores immunfarvning, antistofpåvisning af Olig2 synes upåvirket. Brugeren skal vælge den rigtige antistof til immunomærkning følgende ISH.
IHC og ISH er almindeligt anvendt teknikker til genekspression mønster undersøgelser, og begge har fordele og ulemper. IHC er en yderst følsom metode til påvisning af cellulær ekspression af gener i hjernesnit, men dens afhængighed af antistoffet påvirker dets specificitet og begrænser anvendelsen heraf. Derimod ISH har en høj specificity og proben af ethvert gen kan let syntetiseres ved in vitro transkription ved hjælp af genspecifikke cDNA som template. Den protokol, som vi udviklet drager fordel af begge metoder, der kombinerer dobbelt ISH med IHC at opnå tredobbelte påvisning af genekspression med høj specificitet.
Kort sagt, den protokol vi beskriver her muliggør samtidig farvning af to mRNA og en protein, så det giver et nyttigt værktøj til at illustrere co-lokaliserede genekspression. På trods af at mRNA-ekspression ikke altid hænger sammen med proteinekspression, ISH er en kraftfuld teknik, der giver os mulighed for at undersøge genekspression med høj specificitet. Vores protokol af dobbelt fluorescens ISH kombineret med IHC har vist sig at være en succes i påvisning Aspa ekspression i en delmængde af oligodendrocytter i hjernevæv fra voksne mus, og det kan let tilpasses til en række forskellige væv af forskellig oprindelse og udviklingsstadier. Desuden denne protokolkan også anvendes til påvisning af ekspression af små RNA'er såsom miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al.
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
