Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Epiteliale til mesenkymale overgang (EMT) beskriver processen med epitel transdifferentiating ind mesenchyme. EMT er en grundlæggende proces under fosterudviklingen, der også ofte forekommer i glioblastom, den hyppigste maligne hjernetumor. EMT er også blevet observeret i flere carcinomer uden for hjernen, herunder brystcancer, lungecancer, coloncancer, gastrisk cancer. EMT er centralt forbundet med malignitet ved at fremme migration, invasion og metastase-dannelse. Mekanismerne i EMT-induktion er ikke fuldt forstået. Her beskriver vi et in vitro system til standardiseret isolering af corticale neurale stamceller (NSC) og efterfølgende EMT-induktion. Dette system giver fleksibilitet til at bruge enten enkelte celler eller eksplantation kultur. I dette system rotte eller mus embryonale forhjerne NSC'er dyrkes i et defineret medium, blottet for serum og enzymer. De NSC'er udtrykte Olig2 og Sox10, to transkriptionsfaktorer observeret i oligodendrocYTE precursorceller (OPCs). Med dette system interaktioner mellem FGF-, BMP- og TGF-signalering involverer Zeb1, Zeb2, og Twist2 blev observeret hvor TGFp-aktivering signifikant forøget cellemigration, hvilket antyder en synergistisk BMP- / TGFp-interaktion. Resultaterne peger på et netværk af FGF-, BMP- og TGF-signalering at være involveret i EMT induktion og vedligeholdelse. Dette modelsystem er relevant at undersøge EMT in vitro. Det er omkostningseffektiv og viser høj reproducerbarhed. Det giver også mulighed for sammenligning af forskellige forbindelser med hensyn til deres migration reaktioner (kvantitativ måling af afstand), og high-throughput screening af forbindelser til at inhibere eller forøge EMT (kvalitativ måling). Modellen er derfor velegnet til at teste drug biblioteker for stoffer, der påvirker EMT.
Under flere stadier af fosterudviklingen, epitelceller mister deres stærke tilslutning til hinanden (f.eks tætte forbindelser) og erhverve en vandrende fænotype i en proces kaldet epitelial til mesenkymale overgang (EMT) 1. EMT er nødvendig for dannelsen af yderligere celletyper, såsom mesenkymale crista neuralis-celler, en population, der segregerer fra neuroepithelium 2. EMT er ikke kun vigtigt i fosterstadiet, men også nødvendig på senere stadier af voksne liv til at opretholde fysiologiske processer i den voksne organisme, såsom sårheling 3 og centralnervesystemet (CNS) regenerering i demyeliniserende læsioner 4.
Epiteliale tumorer er kendt for at genaktivere EMT som en indvielse skridt for migration, invasion og metastase, i sidste ende fører til kræft progression 1,3. EMT er faktisk centralt forbundet med stærk migration 1,3. De cellulære trinnene conditioning, initiering, gennemgår og vedligeholdelse EMT er ikke fuldt forstået, og har brug for yderligere undersøgelser.
Her er en standardiseret in vitro EMT model baseret på NSC, med definerede vækstfaktorer og medier (ingen serum og ingen brug enzym) præsenteres. Denne model system er af relevans for forskere, der arbejder på EMT. Sneglen, Zeb og Twist protein familier har vist sig at være kritisk for EMT både i udvikling og sygdom 1. Sneglen, Zeb og Twist familier er også involveret i den præsenterede system. Systemet er baseret på en specifik region af forhjernen, der normalt ikke undergår EMT giver en særlig fordel for studiet af indledende begivenheder under EMT induktion.
Modelsystemet kan potentielt anvendes til at studere EMT i epitel uden for CNS, idet centrale EMT induktorer som sneglen, Zeb og Twist proteiner, bliver også fundet under EMT i vævs- systemer uden for CNS. Denne model system tillader standardiseret isolering af NSC'er fra udviklingslandene cortex at studere stamcellelinjer funktioner i almindelighed og EMT i særdeleshed. Anvendelse af dette system, vi isoleret NSC'er, induceret EMT og studerede efterfølgende migrering under indvirkning af FGF2 og BMP4. Vi observerede, FGF- og BMP-signalering interagerer med TGFp-signalering at fremme cellemigration, derved valideret modelsystemet.
I denne undersøgelse et standardiseret system til EMT analyse under anvendelse NSC'er er beskrevet (opsummeret i supplerende figur 3). Standardiseringen sikrer reproducerbarhed (tabel 1 og 2). De NSC'er stammer fra det udviklende cortex, et væv, der normalt ikke undergår EMT. Dette er en fordel for analysen af de tidlige stadier af EMT. Indledende skridt i EMT kan ikke tilstrækkeligt undersøgt hos tumorceller, der har akkumuleret genetiske ændringer og kan allerede v…
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev støttet af universitetet i Basel Science Foundation og den schweiziske National Science Foundation med et tilskud til MHS og AG (SNF IZLIZ3_157230). Vi takker: Dr. Tania Rinaldi Burkat for generøst leverer infrastruktur alle medlemmer af Bettler gruppen for diskussioner og kommentarer. Vi takker Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Schweiz) til professionel og kompetent installation af Full HD MC170 videokamera (Leica Microsystems, Schweiz).
BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
HBSS media | Sigma | H9394 | |
Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |