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Immunology and Infection

生物发光成像检测到非洲锥虫病的晚期感染

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

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伦理
所有工作被英国内政部动物的批准(科学程序)1986年法令和卫生与热带医学院动物福利伦理审查委员会的伦敦经济学院下进行。 ARRIVE准则得到遵守本报告。

1.在生物发光布氏锥虫布氏体内通道

  1. 删除T的冷冻股票(称为stabilate) 湾布氏应变GVR35-VSL-2(可从约翰·凯利教授在卫生和热带医学伦敦学校通过MTA)从液氮9,并允许平衡至室温。稀释stabilate至2×10 4锥虫/ ml的无菌磷酸盐缓冲的葡萄糖盐水(PBS-G)的pH为8.0(1L PBS + 15克葡萄糖)10。
    :T。湾布氏 GVR35-VSL-2是非感染到人类和要求的SAPO授权设施来进行实验。
  2. 注射等一20-25g的雌性CD1小鼠经腹腔途径(IP)稀释锥虫0.2毫升一个地下25针。这是“供体鼠”。将受感染的鼠标变成无特定病原(SPF)-cage和饲料自由采食
    注:CD1小鼠是远交应变和T.湾布氏 GVR35感染充分表征在该菌株。然而,该协议也适用于近交或遗传修饰的菌株,但要注意,皮毛颜色可以在成像6,9的灵敏度产生影响是重要的。
  3. 监测采血外围原虫。鼠标放置到塑料限制器和取5微升的血液从尾部通过与21g的针或放血静脉穿刺和用氯化钠0.85%无菌铵混合1/10以裂解红血细胞,并允许更容易计算。
  4. 算在Neubauer血球稀释血液。
    1. 加载稀释血液到这两个腔室。计数整个中央GR一个腔室的ID,以得到N锥虫。在血液= ×10 4锥虫/ ml的锥虫的浓度,调整为任何稀释因子,并计算两个腔室的平均值。
      注意:在约5-7天感染后,外周血原虫应充分上升以2×10 4个锥虫/ ml的浓度来进行感染。
  5. 当锥虫水平足够高的所需的小鼠的数量,继续前进到步骤1.6。在一个供体小鼠的6×10 4个锥虫/ ml的原虫水平足以为10只小鼠的感染。
    注意:对于统计学显著组大小中,n = 6对于每个治疗组的小鼠的需要8个 。感染了其他模型,功率计算将需要用于确定适当的组大小。
  6. 地方的小鼠成热箱(在28-30℃下进行约5-10分钟),以允许尾静脉扩张。为了诱导终端麻醉,辖20毫克/公斤戊巴比妥静脉与地下25针。确认鼠标轻轻按下脚垫,以确保没有撤退反射麻醉。
  7. 通过等分在5000 USP单位/毫升5 ml肝素成珠宝管和进出附连到1ml注射器针头的抽吸两次Heparinize一个21g的针头。
  8. 取肝素21g的针和1ml注射器,并通过集中插入针左肋下执行对麻醉通道小鼠心脏穿刺(血液珠在针的底部池)并轻轻向后拉柱塞以免倒塌心脏的腔。收集至少0.7毫升的血液。
  9. 稀释受感染的血液,以产生的在PBS-G的pH 8.0的2×10 4个锥虫/ ml的如上步骤1.1接种物。
    注意:在这一点上,剩余的血液可以冷冻保存由用8%的甘油,20%热灭活胎钙混合以产生stabilateLF血清(HI-FCS)和72%感染者的血液。使用慢速冷冻冷冻集装箱达到-1℃/ min的冷却速度,转移到后液氮之前在-80℃下慢慢地冻结。

2.实验小鼠感染

  1. 将CD1雌性小鼠(21-25〜G)进入加热箱轻轻地暖扩张静脉。放置温热小鼠到塑料约束和一个地下25针入尾静脉,相当于每只小鼠4000锥虫静脉内注射0.2毫升稀释接种物。将压在注射部位事后阻止出血。
    注意:腹膜内感染是病毒感染的有效途径,并在以前的研究中10已被使用,但我们已发现这比静脉内途径少重复的。
  2. 随机感染小鼠和保持架在SPF-通风笼3组。作为对照,注射CD1雌性小鼠与野生型非生物发光寄生虫,T。湾布氏 GVR35(N =3)。
  3. 监测感染通过血液电影显微镜
    1. 从静脉穿刺或放血点5微升血液到载玻片并执行血涂片(使用第二载玻片轻轻地推血滴横跨滑动,以产生一个薄膜)。允许幻灯片空气干燥。
    2. 修复血涂片用100%的甲醇和染色用姬姆萨10分钟与卫生署2 O冲洗前,晾干。下100X客观计数锥虫中的视场(FOV)10的字段的数目。
      注意:血拍戏被整一起非侵入性动物的成像早一天后感染进行。当处理一批动物,锥虫定量此方法优于血球计数作为样品可以储存在室温和更高计数。

3.生物发光成像跟踪感染

注意:要监视的感染,整个动画人非侵入性成像可以使用。

  1. 制备30毫克/毫升D-萤光素,萤火虫荧光素酶底物,在Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中的储备溶液。过滤消毒,并在-20℃下以等分试样冷冻。
    注意:D-荧光素对光敏感,因此,通过在箔包裹等份避光。不要反复冻融萤光素,因为它会影响活动11。
  2. 暖D-荧光素的室温的等分试样。除去从笼(包括感染nonbioluminescent野生型寄生虫菌株的对照小鼠)各小鼠和注射150毫克/公斤的温热D-荧光素(在DPBS稀释的)的腹膜内与地下25针。将小鼠成一个异氟醚室大约5分钟,在2.5升/分,诱导用2%异氟烷/ O 2的混合麻醉。
    注:当他们麻醉状态下的小鼠变得动弹不得。对于这里使用的成像器,3只小鼠可在同一时间内进行处理。如果小鼠anesthet源化的时间超过30分钟,眼用人工泪液软膏可应用于防止小鼠的眼睛干燥。
  3. 对于此处所描述的成像器,打开软件并使用该软件按照制造商的说明初始化机器。采集图像,一旦摄像头,加热板达到的温度。
    注:本仪器通常不会关闭,从而使机器能够在一夜之间执行后台校准。在它需要重新启动的情况下,它必须首先运行校准检查。
  4. 放置在麻醉小鼠放入成像仪(见3.5)。使用小鼠之间大黑分离器,以减少通过任何光亮生物发光信号的流血。使用一组曝光时间图像的小鼠; 1,3,10,30,60和180秒,具有中等分级,1 F /停止和开口的过滤器,并实地查看电子商务(12.5×12.5 平方厘米)。
    注:感染野生型nonbioluminescent GVR35寄生虫的对照小鼠提供background生物发光值。从萤光素动力学实验( 图6)与该模型中,我们已发现,在10分钟时的生物发光信号峰值给药后和成像需要大约5分钟为3只小鼠。麻醉和成像的小鼠时,把这个时间尺度考虑。
  5. 为了确保小鼠的彻底成像,旋转获得腹,背和横向视图。保持方向为顺序动物之间的成像顺序的一致性。
  6. 成像后,让小鼠从麻醉状态下观察返回SPF-笼前恢复。
  7. 继续成像小鼠每7天到21天感染后。应该有生物发光信号在整个动物稳步增长。
  8. 在D21,图像和血膜,如上所述,和剂量的小鼠用40毫克/千克diminazene aceturate腹膜内小鼠。这种药物会清除外围原虫但不会穿过血braiN阻挡,因此,能使中枢神经系统感染的更好的可视化。
    注:Diminazene aceturate是用来治疗早期动物锥虫病一套行之有效的药物。
  9. 在D28 D35和成像继续和监督。

4.确认感染中枢神经系统

  1. 在D35,上面详细图像小鼠(步骤3.1-3.4)。
  2. 成像后,允许按照步骤1.6-1.8详细说明,以供进一步分析采血小鼠从麻醉中和抽血小鼠恢复。
  3. 以下心脏穿刺,灌注用20ml PBS小鼠(可选的:加入3毫克/毫升的荧光素灌注溶液)经由心脏从器官清除血液和重新引入可能已经从大脑区域上的时间间隔清除萤光素标签从步骤4.1。
  4. 轻轻通过使用弯曲的剪刀,从围绕颅骨的圆周基部切割,并剥离所述颅骨顶部部分,以允许大脑取出大脑,用弯钳轻轻提起。
  5. 切除脑放置到黑色塑料和吸管50微升的15毫克/毫升的荧光素在成像前的器官的截面,以确保有足够的萤光素已被添加到该切除大脑。图像使用上述的设置。这将证明感染的定位到大脑半球。
    注意:在切下脑寄生虫血症的下游量化可以通过qPCR如前所述8进行。其他替代下游应用可能包括组织学或免疫识别以下固定脑组织的寄生虫。

5.生物发光成像的定量

注:生物发光可使用的与成像软件感兴趣区域(ROI)的区域进行量化,并作为背景生物发光校正。

  1. 使用ROI工具,创建整个动物定量一个矩形的投资回报率第二它定位在鼠标图像覆盖鼻尖鼠标的尾部基地。使用同样大小的盒子,每动物和每一个时间点。当在ROI为大脑看,使用一个圆形的ROI的相同方式,将其定位在图像中的小鼠头部区域。
  2. 如果需要的话,调整图像在相同的频谱出现感染的视觉表示。
    注意:此处所用的软件为每个图像的彩色地图为最小和最大光子计数自动调整。以使一系列的图像之间的视觉比较,色标必须设置为所有图像的相同的值。
    1. 使用最高的生物发光并在工具选项板的“图像调整”选项卡中的图片,选择一个对数标度和适当的颜色比例的最小值和最大值(凭经验确定)。这个规模应用到整个实验过程中的所有图像。

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Representative Results

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此协议演示了如何遵循以下小鼠感染T.疾病进展湾布氏 ,为非洲人类锥虫病的模型。 图1显示了实验方案的时间表,这表明对于治疗和成像的步骤的时间表; 图2演示了用于定量外围原虫固定吉姆萨染色的血涂片的视图的典型字段,用锥虫和红血细胞存在。后面可以通过测量生物发光如在图3,其显示了与在每个时间点拍摄的相同的动物实验的过程中,受感染的动物的感染动物的发展。通过感染增加了生物发光可以在所有动物被观察到第21天的信号变得更加传播和激烈,与BLI的高区的过程(表示为红色从热地图比例尺)在脾区域。在D21小鼠用diminazene aceturate视为图1中,成像后详述,并在生物发光的下降可在D28被观察为外围感染被清除,以信号的低水平存在于小鼠的头部区域。在D35的信号,仍停留在头部区域和更加激烈指示可能脑部感染。大脑被切除,以确认信号在脑组织中存在,然后可以通过定量PCR进行定量。

传统上,血涂片用于定量感染进展和治疗效果。然而,这些仅测量外围原虫,并不能用于评估在大脑中寄生虫的水平; 图4结合了外围原虫和生物发光来证明疾病动力学的定量。在D7高BLI信号存在​​10 8 如图3所示在头部区域中的生物发光的量度。这表明了传统的血膜计数的生物发光方法的灵敏度更高。

为了验证,在头部区域的生物发光是真正定位于脑组织,在实验的大脑切除biolumines年底萤光测定离体图5)。在大脑之间感染的负担的差通常被与信号不出现局部化到特定的解剖区域激烈BLI信号的分布可以感染动物之间变化。例如,强BLI信号存在于鼠标2和3,并且在小鼠3小脑嗅球,而从鼠标1的脑显示遍及大脑BLI信号的一般分布。作为大脑可以立即灭杀小鼠后成像,进一步分析可以对脑组织的组织中没有离体成像过程中损坏进行。

图1
1: 实验包括成像,采样和处理的时间表 。由于生物发光成像的非侵入性,感染的监测可发生莫常重比在图中详细说明。采样和成像每7天启用进展感染的鉴定。在含有diminazene aceturate D21治疗移除外围原虫以允许头部和脑部感染的更好的可视化。 Diminazene aceturate是早期阶段的药物,不能够通过其数量足以清除后期感染血-脑屏障。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:Giemsa染色锥虫在一个固定的血膜,Giemsa染色锥虫(紫色,粉红色的核,封闭的箭头)是容易对红血细胞检测的(染成蓝色,空心箭头),并且可以迅速地计算,以获得数锥虫/ 10下100X客观的视场。比例尺表示10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:感染小鼠的生物发光成像的一组感染了VSL-2(M =小鼠)和野生型感染对照(感染野生型nonbioluminescent寄生虫线)6小鼠的三种代表性的动物萤光素也被施用到成像之前的对照小鼠,这提供了背景测量。热图刻度显示为红色指示灯高水平的生物发光的,等同于高数量的寄生虫,和蓝色表示的生物发光水平低(D =日)。控制鼠标有预期无荧光素酶表达的寄生虫没有生物发光。图像f ROM伯勒尔-Saward 由牛津大学出版社的许可。8。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:生物发光和血液原虫电影比较每个整个动物的生物发光总额在第5和在血涂片计数定量寄生虫原虫外设描述进行定量。误差线表示来自平均值±标准偏差。图片来自伯勒尔-Saward 由牛津大学出版社的许可。8。 请点击此处查看该图的放大版本。

5“SRC =”/文件/ ftp_upload / 54032 / 54032fig5.jpg“/>
5: 离体脑的 离体 成像如4.5中所述图3中的成像的小鼠的灌注大脑取出并成像。生物发光是在一个热地图比例作为图3.从感染野生型nonbioluminescent寄生虫的小鼠的对照脑测定也与萤光素处理,并可以观察到无生物发光。比例尺表示1厘米。这个数字已经从伯勒尔-Saward 8由牛津大学出版社的许可修改。 请点击此处查看本图的放大版本。

图6
图6:VSL-2感染的小鼠生物发光荧光素动力学。三VSL-2感染的CD1小鼠用萤光素150毫克/千克腹腔注射和成像器内立即放置。小鼠成像超过60分钟,并计算其生物发光测定荧光素给药后的最佳成像窗口。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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生物发光T的发展湾布氏 GVR35应变允许锥虫感染从早期到晚期的可视化。以前感染模型是无法检测到后期,当寄生虫在大脑中,在从血液膜显微镜实时,和所需的大脑的剔除和除去从被感染的小鼠,以确定寄生虫负荷12。生物发光降低小鼠间变异性为单个鼠标可以在整个感染的全部,并且可以在任何阶段被观察感染的快速定性评估进行跟踪。生物发光成像的高度敏感的方法使低水平感染早于血膜镜被识别,与相 ​​比,5×10 3锥虫/通过显微镜9毫升检测少至100锥虫通过成像可检测的。另外,在整个实验按照相同的动物消除S中需要单独的动物组每个时间点,大大减少了动物的使用。

此处所描述的成像协议可以调整,以适应科学需要作为非侵入性性质意味着额外的和更频繁的成像可以进行(使​​用适当的动物伦理委员会批准),但对于大脑感染D21的评估是最早的时间点。此时,初期的药物不再在清除后期寄生虫有效。此外,还必须使小鼠在每个时间点在相同的条件下成像。例如,应当使用相同的曝光时间和相同的视图(腹侧或背侧),以确保感染的过程中的精确测量。

如果在成像没有信号存在(当已知该模型应该具有感染),有若干可以遵循以确定问题的来源的步骤。首先,曝光时间可以增加到最大的5分钟这应该是能够检测非常低的生物发光信号。如果仍未检测到的信号和血液膜的正面为寄生虫,下一个步骤将是确定寄生虫是否仍然生物发光。这可以通过使用市售的体外萤光素酶活性测定和生物发光。将使用光度计进行检测来进行。如果在这一点上的寄生虫是不再生物发光,在寄生虫的构建体的稳定性将需要加以解决。

小鼠的颜色,使成像的灵敏度的差作为所发射的生物发光是由黑毛皮和皮肤6,9衰减。小鼠品系的选择,如白小鼠或裸鼠体内,因此可以提高业绩。如果鼠标颜色被约束,例如通过使用转基因线的,则剃须或脱毛小鼠中的感兴趣区域可以大大提高灵敏度6。

德尽管提高了灵敏度和信号,即生物发光模型产生,该生物发光不直接关联到在血液膜中观察到的外周原虫( 图4中所示天7-21)。文献记载,锥虫病的早期阶段感染感染hemolymphatic系统1中,并且不仅仅限于血液系统,这与感染外周器官的沿,也许可以解释为什么当外围原虫是血液中的薄膜中几乎检测不到,生物发光是可见的,如从图34 7天的数据尤为明显。然而,这并不意味着生物发光成像只能被用作感染的一个质量测量,并且需要进一步的分析,以确定绝对寄生虫负荷。

生物发光成像与其他感染性病原体,很难MO正在使用的能力nitor,与南美锥虫病,疟疾和弓形体病的啮齿动物模型已经建立13-16。生物发光的高信噪比加上其跟踪实时感染可提供更灵敏的,非侵入性的药物评估,以及更好地理解的CNS感染动力学的能力,使得它在一个有价值的工具传染病研究。

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Acknowledgments

我们感谢约翰·凯利和马丁·泰勒(伦敦卫生与热带医学院)提供T.湾布氏 GVR35-VSL-2和Andrea Zelmer博士(LSHTM),用于体内成像的建议。这项工作是由比尔和梅林达·盖茨基金会全球健康项目(批准号OPPGH5337)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

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References

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Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

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