Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Exosome onderzoek in de afgelopen drie jaar sterk uitgebreid de omvang in de richting van identificatie en karakterisering van biomarkers en hun therapeutische toepassingen.
Exosomes onlangs aangetoond microRNA (miRs) bevatten. Mirs zich hebben voorgedaan als waardevolle biomarkers voor diagnostische doeleinden. Zoals specimen collectie in klinieken en ziekenhuizen is erg variabel, miRNA isolatie van hele gal varieert aanzienlijk. Robuuste, nauwkeurige en reproduceerbare miRNA profielen van verzamelde monsters gal te bereiken op een eenvoudige wijze vereist de ontwikkeling van een kwalitatief hoogwaardige protocol te isoleren en te karakteriseren exosomes van gal. De werkwijze vereist verscheidene centrifugeren en een filtratiestap met een laatste stap van ultracentrifugatie om de geïsoleerde exosomes pelleteren. Elektronenmicroscopie, Western blots, stroomcytometrie en multiparameter nanodeeltjes optische analyse, indien beschikbaar, zijn cruciaal karakterisering maatregelen om de kwaliteit van de e validerenxosomes. Voor de isolatie van miRNA uit deze exosomes, spiking het lysaat met een aspecifiek synthetische miRNA van een soort zoals Caenorhabditis elegans, dwz Cel-miR-39, is belangrijk voor normalisatie van RNA extractie-efficiëntie. De isolatie van exosome van galvloeistof volgens deze werkwijze kan de succesvolle miRNA profilering van galmonsters bewaard jarenlang bij -80 ° C.
Net als andere biologische vloeistoffen, dat wil zeggen, moedermelk, plasma of urine, gal bevat exosomes, lipide rijke blaasjes 1-4. Exosomes kunnen induceren of biologische functies te wijzigen ontvangende cellen 5, 6, een vorm van cel-cel communicatie die hun normale functie 4, 7-9 kan zijn. Exosomes kunnen miRNA soorten die een waardevolle bron van biomarkers voor diagnose 10 bevatten. miRNAs profielen hebben aanzienlijke aandacht gekregen in de afgelopen jaren als diagnostische en prognostische merkers voor verschillende ziekten 11-14.
miRNA zelf vindt in biologische vloeistoffen, eventueel vrijgegeven door dode cellen en de hoeveelheid cellen stal kan sterk worden beïnvloed door een onderliggende ziekte. De miRNA profiel van exosomes niet noodzakelijk overeen met de miRNA profiel van de cel uit 6, 10, 15-17, maar exosomes kan miRNA handtekeningen die karakteristiek zijn voor de ouderlijke ce zou kunnen dragenll graag een tumorcel. Tumor afgeleide exosomes geïdentificeerd in het plasma van patiënten met longadenocarcinoom, prostaatkanker en andere tumoren 8, 16, 18.
Het doel van deze methode is de betrouwbare en robuuste isolatie van exosomes uit humane gal specimens, grotendeels onafhankelijk van hun procedures voorafgaande behandeling. Het werd ontwikkeld om gal gebruiken als een betrouwbare bron van miRNA voor mogelijke diagnose van ziekten van de galwegen zoals cholangiocarcinoma 19. Het bestaat uit verschillende stappen van centrifugatie bij toenemende snelheden exosomes isoleren en voor andere biologische vloeistoffen kunnen zijn.
Om op betrouwbare wijze te benutten exosomes geïsoleerd uit gal, is het belangrijk om een constante hoge kwaliteit isolatie methoden gebruiken om de kwaliteit van de monsters een hoog rendement te verkrijgen. De methodologie die in dit document is een gevestigde manier om exosomes en miRNA te isoleren uit humane gal. Het wijst op de volgende essentiële stappen ter karakterisering van de geïsoleerde exosomes dat ten minste elektronenmicroscopie of nanodeeltjes optische analyse en Western blots moeten omvatten. <…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
LM10-HS | Nanosight | ||
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |