Protocol
Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol blev udført i overensstemmelse med regler fastsat af University of Michigan Unit for Laboratory Animal Medicine.
1. Fremkald genetisk rekombination i mus
Bemærk: Gli1 TM3 (CRE / ERT2) ALJ / J mus stamme (Gli1-CreERT2) 13 muliggør målretning af tamoxifen-induceret genetisk rekombination til TD epithel. Indlæg denne stamme med B6.129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm1Sor / J-reporter-mus (LacZ) 22 til frembringelse Gli1; LacZ dyr at visualisere TD celler ved hel-mount farvning nedenfor.
- Forbered tamoxifen opløsning til en koncentration på 12,5 mg / ml i majsolie.
- I et 1,5 ml rør, tilføje op til 20 mg krystallinsk tamoxifen, og derefter 1 ml majsolie. Fast tape røret til en vortex-blander, og vortex kontinuerligt ved den højeste indstilling ved stuetemperatur indtil tamoxifen har fuldstændig opløst (2-4 timer), sombekræftet ved at undersøge rør under et dissektionsmikroskop for fravær af tamoxifen partikler.
- Opløsningen overføres til en 15 ml rør og fortynde tamoxifen til en endelig koncentration på 12,5 mg / ml med yderligere majsolie. Vortexes den viskose opløsning i yderligere 30 sek. denne løsning i op til 1 uge ved 4 ° C i mørke lagre.
- Injicer tamoxifen opløsning intraperitonealt i Gli1, LacZ-mus, i et volumen på 200 pi pr 20 g mus legemsvægt, for en effektiv tamoxifen dosis på 2,5 mg pr 20 g mus vægt.
2. Harvest Skin Biopsier
Bemærk: Afhængigt af forsøget, høst hud biopsier flere dage til uger efter tamoxifen induktion. For alle operationer, følg standard protokoller til gnaver kirurgi, herunder brug af sterile handsker, iført en kirurgisk maske eller hår netto, og som dækker dyret med en steril kirurgisk afdækningsstykke under proceduren.
- Forbered 10x stock bedøvende opløsning ved at blande 90 mg / ml ketamin og 6,5 mg / ml xylazin i vand. Fortynd denne stamopløsning 1:10 i sterilt PBS umiddelbart før anvendelse, og opbevares ved stuetemperatur i mørke i op til 8 måneder.
- Alternativt bedøver mus ved isofluran inhalation, begynder med en gaskoncentration på 4% med oxygen til fuldt ud at bedøve dyret, og derpå efterfølgende at sænke denne til 1-2% for varigheden af proceduren.
- Injicer bedøvende opløsning intraperitonealt i en dosis på 200 pi pr 20 g mus legemsvægt. Kontroller, at dyret har nået den rette plan sedation ved tå knivspids assay, og bekræfter, at hjerte og respiratoriske satser er normale (ca. 600 beats og 160 vejrtrækninger per minut, henholdsvis).
- Brug en elektrisk Clipper til at fjerne hår fra det sted, biopsi på dorsale tilbage hud, pas på ikke at nick eller beskadige underliggende hud.
- Forbered operationsstedet ved at tørre barberingd område i en anterior-til-posterior retning med Betadine og spritservietter. Sørg for at alle hår udklip er fjernet fra sitet.
- Outline biopsi websted ved hjælp af en sort markør, placere dyret på en opvarmning pad i et aseptisk kirurgisk område, og dække med en steril kirurgisk afdækningsstykke (til demonstration, blev sterile drapere undladt at øge synligheden).
Bemærk: For at opnå længdesnit af hårsækkene, jo længere kant af biopsi (til kanten skal skæres til histologi, ~ 1 cm) skal køre i en anterior-posterior retning (parallelt med retningen af hårsækkene), parasagital til den dorsale midtlinje (figur 1A). - Brug en steril # 11 skalpel til at foretage en fuld tykkelse excision langs markerede område uden at beskadige underliggende muskulære fascia.
Bemærk: Det udskårne hud væv omfatter epidermis, dermis, spæk og panniculus carnosus. Blødning er typisk minimal. - Flad than fjernet hud prøve på en tør papirserviet, dermis side ned, trim væk overskydende køkkenrulle, og opbevar prøven i koldt PBS i op til 1 time, hvis andre prøver skal indsamles. Når du er klar, skal du fortsætte til trin 3.1 eller 3.2 til at behandle prøver til histologi, eller trin 4 for hel-mount β-galactosidase (LacZ) farvning.
- Sutur lukke biopsistedet hjælp 6-0 nylonsuturer på en enkel afbrudt mønster anbragt omtrent 3 mm fra hinanden.
- Må ikke returnere mus, der har gennemgået kirurgi i samme bur som andre dyr før efter fuld helbredelse.
- Overvåg dyr umiddelbart efter operationen, indtil de kommer til bevidsthed, og også dagligt indtil det kirurgiske område er helet, typisk inden for 1 uge. Brug analgetika i overensstemmelse med udpegede institutionelle dyr pleje og brug retningslinjer, hvis mus udviser tegn på smerte eller lidelse. Fjern suturer inden for 7-10 dage efter operationen.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, forberede analgetisk opløsning ved fortynding carprofen (50 mg / ml stamopløsning solution) 1: 100 i sterilt vand. Injicer opløsningen subkutant mellem skulderbladene nær nakkeskindet, i en dosis på 200 pi pr 20 g legemsvægt (5 mg / kg mus legemsvægt).
3. Proces Prøver til histologi
Bemærk: For at fastsætte og behandle udskårne væv, enten bruge metoden nedenfor afhængig af anvendelsesområde.
- For at generere paraffinindlejrede histologiske prøver, fastsætte huden i 3,7% formalin i PBS O / N ved stuetemperatur, og opbevar det i 70% ethanol i op til 2 uger. Fjern køkkenrulle før indlejring i paraffin.
- Til generering frosne histologiske prøver, nedsænkes vævet i koldt 4% paraformaldehyd i PBS og ryst forsigtigt i 1 time. Fjern opløsningen og vask prøven med 3 hold PBS, ca. 5 minutter hver. Dernæst nedsænkes prøven i 30% sucrose i PBS til cryoprotect vævet ( "saccharose synkende").
- Inkuber under forsigtig omrystning O / N ved 4 ° C. Den næste dag, fjerne papiret slæbel og skær overskydende fedtvæv fra den dermale side af huden. Indlejre vævet direkte ind OLT gemme den frosne blok ved -80 ° C.
Bemærk: Efter sektionering, kan enten paraffin eller frosne prøver farves ved immunhistokemi til at identificere TDs, Merkel-celler og nerver ved anvendelse af antistoffer mod keratin 17, keratin 8 og neurofilament, henholdsvis som tidligere beskrevet 5,19.
4. Visualiser Prøver fra Whole-mount LacZ Farvning
- Forbered X-gal-farvning opløsning.
- Kombiner 0,94 g monobasisk natriumphosphat og 2,6 g dibasisk natriumphosphat i 250 ml sterilt vand. Indstil pH til 7,3. Dertil tilsættes 0,5 ml 1 M magnesiumchlorid, 0,528 g kaliumferrocyanid og 0,412 g kaliumferricyanid. Tilsættes 250 pi octylphenyl-polyethylenglycol og 125 mg deoxycholat. Basen opløsning kan opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder i mørke.
- Forbered 50x lager X-gal solutipå ved tilsætning dimethylformamid til X-gal stock flasken for at generere en 50 mg / ml opløsning. denne opløsning ved -20 ° C i mørke lagre.
- Lige før anvendelse, fortyndes stock X-gal-opløsning 1:50 i X-gal baseopløsning til dannelse farveopløsning. For mindre biopsier (<1 cm 2), alikvote 1-2 ml farvningsopløsning per prøve.
- Fastgør huden prøve indsamlet i trin 2.7 i en opløsning indeholdende 2% paraformaldehyd / 0,2% glutaraldehyd i koldt PBS i 30 min, forsigtigt at ryste på is. For mindre biopsier (<1 cm 2), bruge 1-2 ml fikseringsopløsning per prøve.
Bemærkning: Alternativt kun lave prøver i 2-4% paraformaldehyd, eller i kun 0,5% glutaraldehyd. Optimale fiksering betingelser afhænger af væv, graden af LacZ-ekspression og anvendelse. - Fjern fiksativ opløsning og skylles prøverne med 3 hold PBS, 5 min hver, på en ryster ved stuetemperatur.
- Fjern køkkenrulle under prøven og skåret væk for strams fedtvæv fra den dermale side af huden ved at gribe fat med stumpe pincet og trimning med dissekere saks.
- Sænk prøven i X-gal-farvning opløsning, og der inkuberes ved 37 ° CO / N. LacZ-ekspression vil være synlig som en blå plet under et dissektionsmikroskop (figur 1B).
Bemærk: Hvis signalintensiteten er svag, udskift farvningsopløsningen den næste dag og gentag O / N inkubation. Hvis baggrundsfarvning er for intens, reducere den tid af farvning eller inkubere prøven ved stuetemperatur i stedet for 37 ° C. - Fjern farveopløsningen og vaske prøverne i 3 hold PBS indeholdende 3% DMSO i ca. 5 min, forsigtigt rystning ved stuetemperatur.
- Vask prøverne i 2-3 ændringer i 70% ethanol i 5 minutter hver. Opbevar prøver i 70% ethanol.
5. Kirurgisk Denervation
- Bedøver dyret som i trin 2.2 og barbere hele dorsale hud.
- Forbered kirurgiske område of ryggen huden ved hjælp af Betadine og spritservietter, og dække dyret med en steril kirurgisk afdækningsstykke (til demonstration, blev sterile drapere undladt at øge synligheden). Hold dyret varme ved hjælp af en varmepude under drift i et aseptisk kirurgiske område.
- Lave et snit under anvendelse af en steril # 11 skalpel langs den dorsale midtlinie fra bunden af halsen til omkring 0,5 cm over halen.
- Ved stump pincet, forsigtigt afspejle huden på venstre side væk fra fløjen at visualisere det underliggende væv fra skulderblad fedtpuder nær halsen til lige over bagbenet.
Bemærk: Dorsal kutane nerver fremstå som hvide tråde, der rejser kaudalt gennem den gennemsigtige fascia af stammen væg før skarpe bøjninger og ind i løst bindevæv under huden (figur 2). - Brug ultrafine pincet under et dissekere lysmikroskop, fjerne nerverne udelukkende fra venstre side af animal placeret på anatomiske steder T3-12 ved plukning hvorfra segmenterne bøje på stammen væg til deres entry sites i huden (figur 2).
- Orient pincet lodret og fjern nerverne ved at tage fat på ca. 0,5 cm under deres bøje sites og trække opad, hvilket den frækhed at strække og adskilt fra det omgivende væv (Figur 2C - E). Vær omhyggelig med at undgå brud tilstødende blodkar.
- Fortsæt indtil alle nerver strækker sig fra stammen væg på huden, fjernes. Må ikke forstyrre nerverne inden den tætte fascia af stammen væg. Hold vævet fugtig under hele proceduren ved jævnligt at anvende dråber sterilt 0,9% saltvandsopløsning.
- Alternativt fjerne nerver ved at tage fat deres proksimale ender nær stammen væggen med pincet og klippe med fine saks. Bagefter afskære de distale ender nær huden (figur 2F - H). Endelig fjernes intervening nerve segmenter (Figur 2i).
- Fjern eventuelle nerver fra huden flap eksponeret i trin 5.4. Disse fibre omfatter de distale grene af den dorsale kutane nerver og vises som hvide branching tråde placeret sporadisk i bindevævet på den dermale side af huden flap (figur 2J - K).
- For at fjerne disse fine grene, placere de fine pincet nogenlunde parallelt med dermal overflade, fat nerverne og plukke opad for at undgå at forstyrre blodkar og punktere huden. Fortsæt, indtil alle synlige nerver er fjernet.
- Ved stump dissektion, afspejler huden på højre side af den dorsale midtlinie incision, men ikke fjerne nerverne. Dette vil tjene som den kontralaterale skinopereret kontrol.
- Sutur langs den dorsale midtlinie i en enkel afbrudt mønster at lukke snittet. Overvåg dyret under genopretning og post-opertivt som tidligere påvist (trin 2.8-10). Fjern suturer inden for 7-10 dage efter operationen.
- Til funktionelt vurdere stabil denervering op til flere uger efter operationen, fjerne hår fra den dorsale hud med en elektrisk clipper.
- pik forsigtigt denerveres hud område med en kanyle, og bemærk, om dyret reagerer, typisk ved gysende eller dreje hovedet. Hvis huden område er blevet stabilt denerveres vil dyret udviser ringe eller ingen reaktion.
- Ved hjælp af en sort markør, skitsere det område af intet svar, såvel som et område med samme størrelse og placering på den kontralaterale sham side.
- Saml biopsier fra disse websteder som i trin 2.1-2.9 til analyse.
Bemærkning: Alternativt kan hele dorsale tilbage hud, herunder denerverede og sham-opererede regioner, fjernes som et enkelt ark for hel-mount-farvning, ligner som beskrevet i trin 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved at generere mus, der udtrykker tamoxifen-inducerbar Gli1-CreERT2 og en LacZ reporter allel, er det muligt at visualisere TD epitel og spore skæbner disse celler over tid. Hele denervering procedure kan typisk være afsluttet inden for 1 time pr mus og skulle forårsage minimal nød til dyret.
Vores tidligere undersøgelser har vist, at nerverne er afgørende for at opretholde både normale TDs samt deres tilknyttede Keratin 8 + Merkel celler (figur 3A - C) 5,19. Nerver er også kritisk for fremme Gli1 ekspression i TD (figur 3D). Givet den relativt sjældne forekomst af TD klynger i hele huden (figur 1B), er det bydende nødvendigt at prøve flere frosne snit til præcist kvantificere TD frekvens. Typisk vurderer vi 15 ikke-consdirektion sektioner (hver 10 um tyk og ~ 1 cm lang) fra både humbug og denerveres hud fra hvert dyr. Efter denervering, stabil tab af nerver, både på TD og i hele huden, kan bekræftes ved fravær af immunhistokemisk farvning for standard pan-neurale markører, såsom neurofilament i enten frosne eller paraffinsnit (figur 3A og 3C, og som tidligere rapporteret 5). Alternativt kan nerver også identificeres ved ekspression af β3-tubulin eller PGP9.5 6,9.
Ved at bruge Gli1, LacZ-mus, er det også muligt at bekræfte både kravet om nerverne i aktivering hedgehog signalering i TD og for opretholdelsen TD celleskæbnen ved at variere sekvensen af tamoxifen-induceret rekombination og denervering. Hvis denervering udføres før rekombination, for eksempel, ville teste kravet om nerverne i aktivering af Hedgehog pathway, som overvåget ved Cre-rekombinase aktivitet og niveauer, der er korreleret med Gli1 ekspression i disse dyr. På den anden side, hvis denervering udføres efter rekombination, ville dette vurdere kravet om nerverne i at opretholde allerede mærkede celler i TD.
Figur 1. Hudbiopsi og hel-mount LacZ-farvning af TD epithel. (A) (Top) Fotografi af mus efter biopsi og før suturering. (Nederst til venstre) Forstørret billede af biopsi site. (Nederst til højre) Hud prøve opnået fra biopsi med sin dermis side spredt fladt på et tørt stykke køkkenrulle. (B) Whole-mount LacZ-farvning af hud fra en Gli1, LacZ mus, 7 dage efter tamoxifen induktion, afhåret lige før biopsi for at forbedre hudens visualisering. Gli1 + / LacZ + TDS er mærket som intense blå klynger.Scale bar = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. To metoder til denerveringsvirkninger dorsale hud. (A) Cartoon diagram over innerverede mus hud. Røde stiplede linjer angiver en enkelt udskæring lavet langs den dorsale midtlinie at eksponere den underliggende muskulatur på stammen væg (lilla) samt dermis (grå, asterisk), beneath reflekterede hud. Dorsal kutane nerver rejser kaudalt synes at "bøje" som de forlader stammen væg (den sorte pil viser én sådan bøjning). Nerve segmenter, der skal udskæres, er afgrænset af sorte stiplede linjer. (B) Fotografi af intakte nerver med lokaliteter af bøjning angivet (pile). Blå pile peger på 2 nerve segmenter, der vil være remOved. (C - D) Fotografier viser denervering teknik. Brug ultrafine pincet, greb nerverne 0,5 cm under deres websteder for at bøje og trække udad. (E) fotografi, der viser legemshulen efter fjernelse af 2 nerve segmenter (blå pile). De resterende nerver skal også fjernes. (F - I) En alternativ metode til nerve fjernelse er afbildet, hvor nerverne er klippede på deres proximale ender lige under, hvor de bøje (pilespidser) (G), og også distalt, tæt på deres hjemmeside træder i huden (pilespidser) (H). Bemærk at midtliniesnit i disse billeder er længere end typisk med henblik på bedre visualisering. (J) Fotografi af dermale side af det reflekterede hudlap til den ene side af midterlinjen. (K) nerver er skitseret (sorte linjer), med større blodkar angivet med rødt. De nerver beliggende på dermis side af skin flap skal også skæres. Asterisk, underliggende dermis fra den reflekterede hudlap. Skala bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Stabil tab af nerver og forringelse af TDs efter denervering. (A) Immunhistokemi viser TD epitel med Keratin 8 + Merkel celler (K8, grøn) og Neurofilament + nerver (NF, rød) i sham-opererede hud. (B) Cartoon skildring, med TD epitel fremhævet i lilla, Merkel celler i grøn, og sensoriske nerver i blåt. (C) Immunhistokemi viser denerveres hud (DEN) mangler Merkel celle-neurite komplekser i TD-området. Stiplede gule linjer, hårsækken epitel. Asterisk, background farvning. (D) Whole-mount LacZ-farvning af dorsal tilbage hud fra Gli1 LacZ / + mus 2 uger efter ensidig hud denervering. I boksen til venstre for helet midtliniesnit (pil), er rigelige mærkede TD epitel observeret i sham-opererede hud. Til højre for midterlinjen TDs er ikke synlige i denerveres hud. Scale bar = 10 um for (A), (C); og 1 mm for (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nerver forsyner afgørende funktioner ikke kun i fornemmelse, men også i pattedyr orgel udvikling, vedligeholdelse og regenerering 13,24-27. Som nerver nylig har været impliceret i forskellige hudlidelser, kan de her beskrevne teknikker anvendes til at undersøge kravet om innervation i en række forskellige dyremodeller. Faktisk den ensidige denervering teknik giver mulighed for direkte sammenligning af huden med enten intakte eller forstyrrede nerver fra samme mus. Dette giver en ideel intern kontrol for at kompensere for dyr-til-dyr forskelle, med efterfølgende dataanalyser at gøre brug af en parret t-test.
Mens de her beskrevne procedurer stort set udnytte LacZ-reportergenet, kan disse eksperimenter tilpasses således, at Gli1-CreERT2 allel kombineres med andre fluorescerende reporter eller betingede alleler at modificere genekspression i TD. For eksempel kan Gli1-CreERT2 mus krydsesmed dyr, der huser betingede alleler af Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 til frembringelse af mus, der danner TD-afledte tumorer efter tamoxifen induktion 5. Det er vigtigt at bemærke, at Gli1-CreERT2 stammen inducerer også rekombination i en delmængde af Gli1 + hår follicle stamceller, der er fysisk adskilt fra dem i TD 13.
Efter denervering, nerver i huden forbliver stabilt ablateret i flere måneder (figur 3C) 5,19. I andre undersøgelser, men nogle re-innervation er blevet rapporteret at forekomme over tid 6. Den perdurance af denerveres fænotype kan afhænge af grundigheden af nerve fjernelse, da det er helt afgørende at udskære nerve segmenter mellem deres exit fra brystvæggen til et punkt tæt på de steder, hvor indsætning i dermis af huden.
helt removing hår fra huden før biopsi kan forbedre evnen til efterfølgende at visualisere TDs ved helcelle-mount-farvning (figur 1B). Dette opnås ved at påføre hårfjerningsmiddel til klippet hud i 2 minutter, og derefter tørrer håret væk i en anterior-til-posterior retning med bomuld bolde. Bemærk venligst, at hårfjerning kan påvirke hår cyklus kinetik ved at fremme indrejse i anagen vækstfase. Alternativt kan hår fjernes fuldstændigt ved anvendelse af et barberblad. Desuden hel mount immunhistokemi kan udføres for at visualisere TDs og Merkel celler på epitelbaner adskilt fra dermis, som er blevet beskrevet tidligere 23.
Muligheden er, at kirurgisk denervering kan forårsage betændelse på operationsstedet, potentielt confounding observerede fænotyper. Det er vores erfaring, har vi ikke observeret betydelig inflammation efter denervering, sandsynligvis fordi de skader sikkerhedsstillelse væv afholdt i ski er lille, hvis proceduren er gjort ordentligt. For at minimere muligheden for, at betændelse kan påvirke resultaterne, kan yderligere kontroller skal indarbejdes i eksperimentet. For eksempel, vi observeret, at denervering specifikt hæmmede TD-afledte tumorer, men ikke støder op hårsækken-associerede læsioner i de samme hudprøver og hævder, at denervering-og ikke en generel sår-induceret inflammatorisk respons-sandsynligvis hæmmede tumorigenese ved TD 5.
Det er vigtigt at bemærke, at kirurgisk denervering ablaterer alle kutane nerver, herunder sensoriske og sympatiske fibre 5, og dermed giver en generel overordnet vurdering af indflydelsen af disse nerver på enten normal eller syge hud. Andre eksperimentelle tilgange, for eksempel ved anvendelse pharmacologics såsom botulinum neurotoksin at blokere neurotransmission, kan give mere detaljerede mekanistiske indsigt 7, selv om det er uklart, om disse midler inhiberer retrogradsekretion af cytokiner, såsom Hedgehog ligander. Alternativt er forbindelser, såsom 6-hydroxydopamin blevet anvendt til at ablatere sympatiske nerver i huden 9. Derudover kan targeting receptorerne for nerve-afledte faktorer, såsom calcitonin gen-relateret peptid og substans P være nyttig til interrogering specifikke interaktioner mellem nerver og de omgivende celler i deres niche 6. I sidste ende kan flere strategier anvendes i kombination til at identificere, eller i det mindste udelukke, potentielle signaleringsmekanismer.
Endelig målrettet genetisk sletning af nerve-afledte faktorer i det neurale afstamning ved hjælp af enten Wnt1-Cre eller Advillin-Cre kan repræsentere den gyldne standard for at belyse de signaler, der udveksles mellem nerver og deres niche 19. Da ingen af disse stammer er tamoxifen-inducerbare dog skal træffes for at sikre, at afbrydelse af disse signaler ikke skader nerve udvikling eller korrekt ta en vis forsigtighedrgeting af neurale afferenter. Anvendelse af en tamoxifen-inducerbar Cre såsom Advillin-CreERT2 kan hjælpe omgå disse problemer 29.
Samlet set teknikkerne beskrevet her-en kombination af afstamning opsporing, celle visualisering og kirurgiske denervering-tilbyde effektive tilgange til undersøgelse af indflydelsen af nerver på normal og syg hud. Med erfaring, kan disse procedurer udføres rutinemæssigt og pålideligt, mens forårsage minimal nød til dyret, eller investigator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
- Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
- Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
- Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
- Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
- Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
- Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
- Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
- Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
- Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
- Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
- Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
- Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
- Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
- Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
- Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
- English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
- Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
- Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
- Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
- Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
- Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
- Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).
