Protocol
Bu protokol açıklanan tüm işlemler Laboratuar Hayvan Tıp Michigan Birimi Üniversitesi tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yapıldı.
1. Farelerde genetik rekombinasyonu azaltmak
Not: Gli1 TM3 (CRE / ERT2) Alj / J fare suşu (Gli1-CreERT2) 13 epitel TD tamoksifen kaynaklı genetik rekombinasyon hedef mümkün kılar. Gli1 oluşturmak için B6.129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm1Sor / J muhabiri fareler (LacZ) 22 Bu gerginlik çapraz; LacZ hayvanlar tüm montaj aşağıda boyanarak TD hücreleri görselleştirmek için.
- mısır yağı içinde 12.5 mg / ml'lik bir konsantrasyona tamoksifen çözeltisi hazırlayın.
- 1.5 ml tüp içinde, kristalin tamoksifen 20 mg, ve mısır yağı, sonra 1 ml'ye kadar ekleyin. tamoksifen tamamen (2-4 saat) çözülene kadar sıkıca gibi bir girdaplı karıştırıcı tüp, ve oda sıcaklığında en yüksek ayarda sürekli girdap banttamoksifen parçacık bulunmaması için bir mikroskop altında bir tüp incelenmesi ile teyit edilmiştir.
- 15 ml'lik bir tüpe transfer çözeltisi ve ek mısır yağı ile 12.5 ml mg / bir nihai konsantrasyona tamoksifen seyreltin. ilave bir 30 saniye süre ile yapışkan bir solüsyon vorteks karıştırın. Karanlıkta 4 ° C'de 1 hafta kadar bu çözelti saklayın.
- Gli1 intraperitonal tamoksifen çözelti enjekte edilir; LacZ fareler, fare vücut ağırlığının her 20 gramı başına 200 ul bir hacimde, 20 g fare ağırlığı başına 2.5 mg etkin tamoksifen dozu.
2. Hasat Cilt biyopsiler
Not: Tamoksifen indüksiyon sonrası hafta deneye bağlı olarak, hasat deri biyopsileri birkaç gün. Tüm ameliyatlar için, steril eldiven kullanarak cerrahi maske ya da saç net giyen ve işlem sırasında steril cerrahi örtü ile hayvan kapsayan dahil kemirgen cerrahi için standart protokoller, izleyin.
- Suda 90 mg / ml ketamin ve 6.5 mg / ml ksilazin karıştırarak 10x stok anestezik solüsyon hazırlanır. kullanımdan hemen önce, steril PBS içine Bu stok solüsyonu 1:10 seyreltilir ve 8 aya kadar karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
- Seçenek olarak ise, tam olarak hayvan anestetize oksijen ile% 4 arasında bir gaz konsantrasyonu ile başlayarak, izofluran teneffüs ile fareler anestezi ve daha sonra işlem sırasında% 1-2, bu düşürür.
- 20 g fare vücut ağırlığı başına 200 ul bir dozda intraperitonal anestezik enjekte edilir. hayvan ayak tutam testi ile sedasyon uygun düzlemine ulaştığını kontrol edin ve bu kalbi onaylamak ve solunum oranları (sırasıyla, yaklaşık 600 atım ve min başına 160 nefesler) normaldir.
- Dorsal arka cilt üzerinde biyopsi sitesinden saç kaldırmak değil nick dikkatli olmak ya da altta yatan cilde zarar bir elektrik kesme makinesi kullanın.
- tıraş silerek cerrahi sitesi hazırlamakBetadinede ve alkol mendil kullanarak ön-to-posterior yönde d alanı. Tüm saç kupürleri siteden kaldırılır emin olun.
- Siyah kalem kullanarak biyopsi sitesi anahat aseptik cerrahi alanda bir ısınma pad üzerinde hayvan koyun ve bir steril cerrahi örtü ile kaplayın (gösteri amaçlı steril örtüyü görünürlüğünü artırmak için ihmal edilmiştir).
Not: saç köklerinin uzunlamasına bölümleri elde etmek için, biyopsi uzun kenarının, bir ön-arka yönde parasagital (saç köklerinin yönüne paralel) çalıştırmanız gerekir (kenar ~ 1 cm histoloji için kesitli olmak üzere) dorsal orta hat (Şekil 1A). - Altta yatan kas fasya zarar vermeden işaretli alanı boyunca tam kalınlıkta eksizyonu yapmak için steril 11. neşter kullanın.
Not: eksize cilt dokusu epidermis, dermis, deri altı yağ ve panniculus carnosus içerir. Kanama genellikle az. - t düzleştirmeko kuru bir kağıt havlu üzerine deri örneği eksize, dermis, aşağı yan aşırı kağıt havlu uzak trim ve diğer örnekleri toplandı gerekiyorsa kadar 1 saat boyunca soğuk PBS örnek saklayın. Hazır olduğunuzda, histoloji için numune veya tüm montaj β-galaktosidaz (LacZ) boyama Adım 4 işlemek için Adımlar 3.1 veya 3.2 geçin.
- Sütür kabaca 3 mm aralıklı basit bir kesintiye desen, 6-0 naylon sütür ile biyopsi sitesini kapatın.
- tam iyileşme sonrasına kadar diğer hayvanlar aynı kafesin içine ameliyat geçiren fareler iade etmeyin.
- cerrahi alan tipik olarak 1 hafta içinde, iyileşinceye kadar her gün aynı zamanda bilinci kazanmak ve kadar ameliyattan hemen sonra hayvanların izleyin. Fareler ağrı veya sıkıntı belirtileri göstermesi durumunda belirlenen kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak analjezikler kullanın. Ameliyat sonrası 7-10 gün içinde sütür çıkarın.
Not: Gerekirse, (50 mg / ml stok SOLUT karprofen seyreltilmesiyle analjezik bir çözelti hazırlamakiyon): 1, steril su içinde 100. 20 g vücut ağırlığı başına 200 ul (5 mg / kg fare vücut ağırlığı) bir dozda, Boynun ense yakınındaki kürek kemikleri arasında çözelti, deri altına enjekte edilir.
Histoloji 3. İşlem Örnekleri
düzeltmek için ve eksize doku işlemek, uygulamaya bağlı olarak aşağıdaki yöntemi kullanabilirsiniz: Not.
- parafine gömülmüş histolojik örnekleri oluşturmak için en fazla 2 hafta boyunca% 70 etanol içinde oda sıcaklığında PBS O / N% 3.7 formalin deri ve mağaza düzeltmek. parafin içine gömmeden önce kağıt havluyu çıkarın.
- Dondurulmuş histolojik numune üretilmesi için, PBS içinde, soğuk% 4 paraformaldehid daldırın doku ve yavaşça 1 saat boyunca çalkalanır. çözelti çıkarın ve PBS 3 değişiklik, yaklaşık 5 dakika ile her numune yıkanır. Daha sonra, ( "sükroz batma") doku cryoprotect PBS içinde% 30 sukroz içinde örnek daldırın.
- 4 ° C'de nazik bir çalkalama O / N kuluçkalayın. Ertesi gün, kağıt yedekte kaldırmakEl derinin dermal tarafında aşırı yağ dokusu uzak trim ve. doğrudan OCT içine doku embed ve -80 ° C'de dondurulmuş blok saklayın.
Not: Daha önce 5,19 açıklandığı gibi kesit sonra, parafin veya dondurulmuş numuneler ya TDS Merkel hücreleri ve sırasıyla Keratin 17, Keratin 8 ve Nörofilaman, karşı antikorlar kullanılarak sinirler tanımlamak için immünohistokimyasal olarak boyanmış olabilir.
Tüm montaj LacZ Boyama tarafından 4. gözünüzde canlandırın Örnekleri
- X-gal boyama çözüm hazırlayın.
- steril su, 250 ml 0.94 g sodyum fosfat monobazik ve 2.6 g sodyum fosfat dibazik birleştirin. 7.3 pH ayarlayın. Buna, 1 M magnezyum klorid, 0.5 ml, potasyum ferrosiyanür 0.528 g, potasyum ferrisiyanür ve 0.412 g ilave edin. oktilfenil-polietilen glikol 250 ul ve deoksikolat 125 mg ekleyin. baz çözeltisi karanlıkta 6 ay için 4 ° C'de saklanabilir.
- 50x stok X-gal soluti hazırlayın50 mg / ml solüsyon oluşturmak için X-gal hazır şişeye dimetilformamid eklenerek ilgili. karanlıkta -20 ° C'de bu çözüm saklayın.
- boyama çözüm üretmek için X-gal baz çözeltisi içine stok X-gal çözüm 01:50 sulandırmak, kullanımdan hemen önce. Daha küçük biyopsi (<1 cm2), örnek başına boyama çözeltisi alikosu 1-2 ml.
- yavaşça buz üzerinde sallayarak, 30 dakika boyunca soğuk PBS içinde% 2 paraformaldehit /% 0.2 glutaraldehit ihtiva eden bir çözelti içinde Aşama 2.7'de elde deri örneği düzeltildi. Daha küçük biyopsi (<1 cm2) için, numune başına sabitleyici çözeltisi 1-2 ml kullanın.
Not: Alternatif olarak, sadece% 2-4 paraformaldehid örnekleri düzeltmek, ya da% 0.5 glutaraldehit sadece. Optimum sabitleme koşulları doku, lacZ ekspresyonu ve uygulama derecesine bağlıdır. - sabitleyici çözeltisini çıkarın ve oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde PBS 3 değişiklikler, her biri 5 dakika ile örnekleri yıkayın.
- numunenin altında kağıt havlu çıkarın ve excès kesipkünt forseps ile yağ tutma ve kesme makas ile kırparak derinin dermal tarafında yağ dokusu s.
- X-gal ile boyama çözeltisi içinde örnek daldırın ve 37 ° CO / H inkübe edin. LacZ ifadesi bir mikroskop (Şekil 1B) altında mavi bir leke olarak görülebilir.
Not: sinyal yoğunluğu zayıfsa, boyama çözüme ertesi gün yerini ve O / N inkübasyon tekrarlayın. arka plan boyama çok yoğun ise, boyama süresini azaltmak, ya da C ° 37 oda sıcaklığında örnek inkübe yerine. - boyama çözeltisini çıkarın ve PBS yavaşça oda sıcaklığında çalkalanarak yaklaşık 5 dakika için% 3 DMSO içeren 3 değişiklikleri örnekleri yıkayın.
- Her biri 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde 2-3 değişiklikler yıkayın örnekler. % 70 etanol içinde mağazası örnekleri.
5. Cerrahi denervasyon
- Adım 2.2 gibi hayvan anestezisi ve tüm dorsal cilt tıraş.
- Cerrahi alan o hazırlayınBetadine ve alkol mendil ve bir steril cerrahi örtü ile hayvan kapak kullanarak arka cilt f (gösteri amaçlı steril örtüyü görünürlüğünü artırmak için ihmal edilmiştir). aseptik cerrahi alanda çalışırken bir ısıtma yastığı kullanılarak hayvan sıcak tutun.
- kuyruk yukarıda kabaca 0.5 cm boyun tabanından dorsal orta hat boyunca steril 11. neşter kullanılarak bir kesi yapmak.
- Künt forseps kullanarak, hafifçe sadece arka bacak yukarıda boyun yakın skapular yağ pedleri altta yatan doku görselleştirmek için uzağa zayıf sol tarafta cilt yansıtmaktadır.
Not: Dorsal deri sinirler (Şekil 2) keskin virajlı yapma ve deri altına gevşek bağ dokusu girmeden önce gövde duvarının saydam fasya ile kaudal seyahat gibi beyaz ipliklerini görünür. - Diseksiyon ışık mikroskobu altında ultra-ince forseps kullanarak, anima sol kanattan gelen sadece sinirleri çıkarmakyerden toplama anatomik sitelerde T3-12 bulunan l deri içine kendi giriş sitelerine gövde duvara bölümleri bend (Şekil 2).
- Orient forseps dikey ve streç ve çevre dokuya (- E Şekil 2C) ayrı sinir neden kendi viraj siteleri aşağıda yaklaşık olarak 0.5 cm açgözlü ve yukarı doğru çekerek sinirleri kaldırın. Bitişik kan damarlarının çatlaması önlemek için dikkatli olun.
- Cilde gövde duvarının uzanan tüm sinirler kaldırılana kadar devam edin. gövde duvarının yoğun fasya içinde sinirleri bozmaya etmeyin. periyodik steril% 0.9 tuzlu su çözeltisi damla damlatılarak işlem boyunca nemli bir doku tutun.
- Alternatif olarak, forseps ile gövde duvarının yakınında yakın kenarlarından tutarak ve ince makas ile kırpma yoluyla sinirleri kaldırın. Daha sonra, cilt yakın uzak uçları sever (Şekil 2F - H). Son olarak, int kaldırmakervening sinir segmentleri (Şekil 2I).
- Adım 5.4 maruz cilt flebi herhangi sinirleri çıkarın. Bu lifler dorsal deri sinirlerin distal dalları içerir ve cilt kapağının dermal tarafında (Şekil 2J - K) üzerinde bağ dokusu içinde düzensiz bulunan beyaz dallanma ipliklerini olarak görünür.
- Bu ince dalları kaldırmak için, ince forseps kabaca, dermal yüzeyine paralel sinirleri kavramak ve kan damarlarını bozarak ve cilt delinmesiyle önlemek için yukarı doğru koparmak yerleştirin. Görünen tüm sinirler kaldırılıncaya kadar devam edin.
- Künt diseksiyon kullanarak, dorsal orta hat kesi sağ tarafında cilt yansıtan, ama sinirleri çıkarmayın. Bu kontralateral sahte operasyona kontrol olarak görev yapacak.
- Basit bir kesintiye desen dorsal orta hat boyunca sütür insizyon kapatmak için. kurtarma ve post-oper sırasında hayvan izleyinonları bir arada, daha önce (Adım 2,8-10) gösterdi. Ameliyat sonrası 7-10 gün içinde sütür çıkarın.
- işlevsel ameliyattan sonra birkaç hafta istikrarlı denervasyon kadar değerlendirmek için, bir elektrik clipper kullanarak sırt derisine saç kaldırmak.
- Yavaşça bir derialtı iğne kullanılarak Denerve deri alanını prick ve hayvan genellikle titreyerek ya da başını çevirerek, yanıt verip not edin. cilt alanı stabil sinirsiz olmuşsa, hayvan çok az veya hiç tepki gösterecektir.
- siyah kalem kullanarak, herhangi bir yanıt alanı yanı sıra kontralateral sahte tarafında benzer boyut ve konumu bir alan belirtin.
- Adımlar analiz için 2,1-2,9 gibi bu sitelerden biyopsi toplayın.
Not: Alternatif olarak, Denerve ve sham operasyonu bölgeler dahil olmak üzere tüm dorsal arka deri, Adım 4'te tarif edildiği gibi benzer tüm montaj boyama için tek bir sayfaya olarak kaldırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üretilmesi tamoksifen indüklenebilir Gli1-CreERT2 ifade eden farelerde ve LacZ haberci alel tarafından, TD epitel görselleştirmek ve zaman içinde bu hücrelerin kaderini izlemek mümkündür. Tüm denervasyon işlemi genellikle fare başına 1 saat içinde tamamlanabilir ve hayvana en az sıkıntıya neden gerekir.
5,19 - Daha önceki çalışmalar sinirler, normal TDS yanı sıra bunların ilişkili Keratin 8 + Merkel hücreleri (C Şekil 3A) ve bakımı için çok önemli olduğunu belirttiler. Sinirler ayrıca TD (Şekil 3D) olarak Gli1 ifadesini teşvik etmek için kritik öneme sahiptir. Cilt (Şekil 1B) boyunca TD kümeleri nispeten seyrek bir görünüm göz önüne alındığında, doğru TD frekansını ölçmek için birden fazla dondurulmuş bölümleri örnek zorunludur. Tipik olarak, biz 15 sigara eksilerini değerlendirmekHer bir hayvanın hem sahte ve sinirsiz deride (her 10 mikron kalınlığında ve yaklaşık 1 cm uzunluğunda) Art Arda bölümler. TD de ve cilt boyunca her ikisi de aşağıdaki denervasyon, sinirlerin istikrarlı kaybı, daha önce dondurulmuş ya da parafin kesitleri (Şekil 3A ve 3C ya böyle Nörofilaman gibi standart pan-nöral belirtileri için immünohistokimyasal boyama yokluğunda teyit edilebilir bildirilen 5). Seçenek olarak ise, sinirler β3-tübülin ya PGP9.5 6,9 ifadesi ile tespit edilebilir.
Gli1 kullanılarak, LacZ fareler, TD Kirpi sinyallemesini aktive ve tamoksifene bağlı rekombinasyon ve denervasyon dizisi değiştirilerek TD hücresi kaderi muhafaza sinirler için gereksinimi ve onaylamak için de mümkündür. denervasyon önce rekombinasyon için yapılırsa, örneğin, bu Hedgehog pathwa aktive sinirler için gereklilik test olacağınıY, bu hayvanlarda Gli1 ekspresyonu ile ilişkilidir Cre yeniden bağlayıcı etkinliği ve seviyeleri, tarafından izlenen. denervasyon rekombinasyon sonra gerçekleştirilir, diğer taraftan, bu TD zaten etiketli hücreler muhafaza sinirler için gereksinimi değerlendirecektir.
Şekil 1. Cilt biyopsisi ve TD epitel tüm montaj LacZ boyama. (A) biyopsi sonrası fare (Üst) Fotoğraf ve dikilmesi öncesinde. (Alt sol) biyopsi sitenin Genişletilmiş görüntü. (Sağ alt) Cilt numune kuru kağıt havlu üzerine düz yayılmış dermis tarafı ile biyopsi elde. (B) Gli1 derinin Tüm montaj LacZ boyama, LacZ fare, 7 gün tamoksifen indüksiyon sonrası, cilt görselleştirme artırmak için biyopsi hemen önce tüyleri. Gli1 + / LacZ + TDS yoğun mavi kümeleri olarak etiketlenir.Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. dorsal deri denervasyonu için iki yaklaşım. Innerve sıçan derisine (A) Çizgi diyagramıdır. Kırmızı noktalı çizgiler, gövde duvarı (mor) ve yansıyan derinin altındaki dermiş (gri, yıldız) altta yatan kas maruz sırttaki orta çizgi boyunca tek bir eksizyon göstermektedir. onlar (siyah ok böyle bir viraj gösterir) gövde duvarı terk kaudal seyahat deri sinirleri "bend" görünür Dorsal. Sinir segmentleri siyah noktalı çizgilerle ile ayrılır eksize edilecek. Belirtilen (oklar) bükme siteleri ile sağlam sinirlerin (B) Fotoğraf. Mavi oklar rem olacak 2 sinir segmentleri işaretoved. Denervasyon tekniğini gösteren - (C D) Fotoğraflar. bükme ve dışa doğru çekin kendi sitelerinde aşağıdaki sinirleri kavrama, 0.5 cm ultra-ince forseps kullanarak. (E) 2 sinir bölümleri (mavi oklar) çıkarılmasından sonra vücut boşluğuna gösteren fotoğrafı. Kalan sinirler de kaldırılması gerekir. (F - I) sinirler kendi proksimal snipped nerede sinir çıkarılması için alternatif bir yaklaşım, tasvir hemen altında biter nerede viraj (ok başları) (G), ve aynı zamanda distale, cildin girdiği kendi sitesine yakın (ok başları) (H). Bu görüntülerdeki orta hat kesi daha iyi görselleştirme amacıyla tipik daha uzun olduğunu unutmayın. Orta hattın bir tarafında yansıtılan deri kanadın dermal tarafında (j) fotoğrafı. (K) Sinirler kırmızı belirtilen büyük kan damarları ile, (siyah çizgiler) özetlenmiştir. kayak dermis tarafında bulunan sinirlern kanat da eksize gerekir. Asterisk, yansıyan cilt kapağına dermis altında yatan. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sinirler ve denervasyon sonrası TD'leri bozulma Şekil 3. Kararlı kaybı. (A) İmmünohistokimya sahte operasyona deride keratin 8 + Merkel hücreleri (yeşil K8) ve sinir lifi + sinirler (NF, kırmızı) ile TD epitel gösteren. (B) TD yeşil mor, Merkel hücreleri vurgulanan epitel ve mavi duyu sinirleri ile Karikatür tasviri. TD alanı içinde Merkel hücreli-nörit kompleksleri eksik (C) İmmunohistokimya gösteren Denerve cilt (den). Kesik sarı çizgiler, saç folikülü epitel. Asterisk, background boyama. (D) Gli1 LacZ dan Tüm montaj LacZ geri dorsal boyama deri / mouse 2 hafta tek taraflı cilt denervasyon sonra. iyileşmiş orta hat kesi (ok) sol kutusunda, bol etiketli TD epiteli sahte çalışan deride gözlenir. orta hatta sağa doğru, TDS sinirsiz deride görünmez. (A), (C) Ölçek çubuğu = 10 um; ve (D) için 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinirler duyu değil, aynı zamanda, memeli organ gelişimine, bakımı ve rejenerasyonu 13,24-27 değil sadece önemli fonksiyona hizmet. sinirler en son çeşitli cilt bozuklukları işaret edildiği gibi, burada tarif edilen teknikler hayvan hastalık modellerinde çeşitli innervasyonundan gereksinimi çalışma için kullanılabilir. Nitekim, tek taraflı denervasyon tekniği aynı fare bozulmamış veya bozulmuş sinir ya cildin doğrudan karşılaştırma için izin verir. sonraki veri eşleştirilmiş t-testi yararlanarak analizleri ile bu hayvan için-hayvan farklılıkları telafi etmek için ideal bir iç kontrol sağlar.
Burada tarif edilen prosedürler büyük ölçüde LacZ haberci gen işlemini kullanmasına rağmen, bu deneyler Gli1-CreERT2 alel TD gen ekspresyonunu değiştirmek için diğer floresan bildirici ya da koşullu allel ile birleştirilmiş şekilde uyarlanabilir. Örneğin, Gli1-CreERT2 farenin çaprazlanabilirtamoksifen indüksiyon 5 TD-türevli tümörler oluşturan fareler üretmek için Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 şartlı alellerini barındıran hayvanlar. Gli1-CreERT2 suşu da fiziksel TD 13 olanlar ayrılır Gli1 + kıl folikülü kök hücrelerin bir alt kümesi rekombinasyona uyardığını dikkat etmek önemlidir.
Denervasyon sonra, deride sinirler birkaç ay (Şekil 3C) 5,19 için kararlı bir şekilde ablasyon kalır. Diğer çalışmalarda, ancak, bazı yeniden innervasyon süresi 6 içinde oluştuğu rapor edilmiştir. cildin dermis içine yerleştirilmesi sitelerine yakın bir noktada göğüs duvarından kendi çıkışı arasındaki sinir segmentleri tüketim için kesinlikle kritik olduğu Denerve fenotip perdurance, sinir kaldırma titizlik bağlı olabilir.
tamamen removibiyopsi öncesi deriden saç ng sonradan tüm montaj boyama (Şekil 1B) tarafından TDS görselleştirmek için yeteneğini artırabilir. Bu 2 dakika boyunca kırpılmış deriye tüy dökücü krem, uygulama ve pamuk topları kullanan bir ön-için-arka yöne doğru saç silerek gerçekleştirilir. Bu epilasyon anagen büyüme fazına giriş teşvik ederek kıl döngüsü kinetik etkileyebilir unutmayınız. Alternatif olarak, saç tamamen jilet kullanarak kaldırılabilir. Buna ek olarak, tüm daha önce 23 tarif edilmiş olduğu gibi immünohistokimya, dermis ayrılmış epitel yaprak TDS ve Merkel hücreleri görselleştirmek için gerçekleştirilebilir monte edin.
olasılık cerrahi denervasyon potansiyel olarak herhangi gözlenen fenotipleri karıştırıcı, cerrahi yerinde inflamasyonu neden olabileceğini kalır. teminat doku hasarı sk katlanılan çünkü bizim deneyim, biz büyük olasılıkla denervasyon sonrası önemli inflamasyon, gözlenen değilprosedür düzgün yapılırsa hafif olduğunu. inflamasyon sonuçlarını etkileyebilecek olasılığını en aza indirmek için, ek kontroller deney içine dahil edilebilir. Örneğin, denervasyon özellikle TD türevli tümörler inhibe ama bitişik saç TD 5 o denervasyon-olup, genel bir yara ile indüklenen enflamatuar tepki olasılıkla inhibe tümörogenez sürerek, aynı deri örneklerinde lezyonları folikül ilişkili olduğu görülmüştür.
Cerrahi denervasyon duyu ve sempatik lifleri 5 dahil olmak üzere tüm deri sinirleri, ablates dikkat etmek önemlidir ve bu nedenle normal veya hastalıklı deride bu sinirlerin etkisi genel bir genel değerlendirmesini sağlar. Ajanların retrograd inhibe belirsizdir olmasına rağmen böyle Botulinum nörotoksin olarak pharmacologics kullanarak örneğin diğer deneysel yaklaşımlar, daha detaylı mekanik anlayışlar 7 verebilir, sinir iletimini engellemek içinörneğin kirpi ligandlar olarak sitokinlerin salgılanmasını. Seçenek olarak ise, örneğin 6-hidroksidopamin gibi bileşikler cilt 9 sempatik sinirleri kesip çıkartmak için kullanılmıştır. Buna ek olarak, kalsitonin gen-ilişkili peptid ve madde P gibi sinir türetilmiş faktörleri için reseptörler hedef kendi niş 6 içinde sinirler ve çevresindeki hücreler arasındaki etkileşimleri sorgulamak için yararlı olabilir. Sonuç olarak, birden çok stratejiler belirlemek için kombinasyon halinde kullanılabilir ya da en azından potansiyel sinyal mekanizmalarını ekarte.
Son olarak, sinirler ve onların niş 19 arasında değiş tokuş sinyalleri ortaya çıkması için altın standart temsil edebilir Wnt1-Cre veya Advillin-Cre birini kullanarak sinir soy sinir kaynaklı faktörlerin genetik silinmesini hedeflemiştir. Bu suşların hiçbiri tamoksifen indüklenebilir olduğundan, ancak bazı dikkatli sinir gelişimini veya uygun ta zarar vermez, bu sinyallerin bozulmasının sağlanması için alınması gerekennöral afferent rgeting. Böyle Advillin-CreERT2 gibi tamoksifen indüklenebilir Cre kullanımı bu sorunları aşmak 29 yardımcı olabilir.
Genel olarak, teknikler, normal ve hastalıklı deride sinirlerin etkisi çalışmak için soy izleme, hücre görselleştirme ve cerrahi denervasyon-teklif güçlü yaklaşımların burada-bir arada nitelendirdi. tecrübesi ile, bu işlemler hayvanın ya da araştırmacıya az sıkıntı neden olurken, rutin ve güvenilir yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
- Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
- Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
- Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
- Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
- Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
- Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
- Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
- Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
- Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
- Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
- Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
- Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
- Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
- Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
- Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
- English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
- Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
- Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
- Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
- Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
- Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
- Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).
