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Medicine

Cutaneous सर्जिकल वितंत्रीभवन: त्वचा रोग के माउस मॉडल में नसों के लिए आवश्यकता के परीक्षण के लिए एक विधि

Published: June 26, 2016 doi: 10.3791/54050
Automatic Translation
1, *2, *1
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु चिकित्सा के लिए मिशिगन यूनिट के विश्वविद्यालय द्वारा स्थापित नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

1. चूहे में आनुवंशिक पुनर्संयोजन प्रेरित

नोट: Gli1 tm3 (सीआरई / ERT2) ALJ / जम्मू माउस तनाव (Gli1-CreERT2) 13 epithelia टीडी के लिए tamoxifen प्रेरित आनुवंशिक पुनर्संयोजन के लक्षित करने में सक्षम बनाता है। B6.129S4-GT (रोजा) 26Sor tm1Sor / जम्मू संवाददाता चूहों (lacZ) 22 के साथ इस तनाव को पार Gli1 उत्पन्न करने के लिए; lacZ जानवरों पूरे माउंट नीचे धुंधला द्वारा टीडी कोशिकाओं कल्पना करने के लिए।

  1. मक्का का तेल में 12.5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए tamoxifen के समाधान तैयार है।
    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, मक्का का तेल के तत्कालीन 1 मिलीलीटर क्रिस्टलीय tamoxifen के 20 मिलीग्राम, और अप करने के लिए जोड़ें। दृढ़ता से, एक भंवर मिक्सर के लिए ट्यूब, और आरटी पर उच्चतम सेटिंग में लगातार भंवर टेप जब तक tamoxifen पूरी तरह से भंग कर दिया है (2-4 घंटा) के रूप मेंtamoxifen विविक्त की अनुपस्थिति के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ट्यूब का परीक्षण करके इसकी पुष्टि की।
    2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब का हल स्थानांतरण और 12.5 मिलीग्राम / अतिरिक्त मकई के तेल के साथ मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए tamoxifen पतला। एक अतिरिक्त 30 सेकंड के लिए चिपचिपा समाधान vortexing द्वारा मिक्स। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए इस समाधान स्टोर।
  2. प्रति 20 ग्राम माउस वजन 2.5 मिलीग्राम की एक प्रभावी tamoxifen खुराक के लिए माउस शरीर के वजन के 20 ग्राम प्रति 200 μl की एक मात्रा में, lacZ चूहों,; tamoxifen समाधान intraperitoneally Gli1 में इंजेक्षन।

2. फसल त्वचा बायोप्सी

नोट: प्रयोग पर निर्भर करता है, फसल त्वचा बायोप्सी कई tamoxifen के शामिल होने के बाद सप्ताह के दिनों के लिए। सभी सर्जरी के लिए, कृंतक सर्जरी के लिए मानक प्रोटोकॉल, बाँझ दस्ताने का उपयोग कर एक सर्जिकल मास्क या बाल शुद्ध पहने हुए, और प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा के साथ पशु को कवर सहित पालन करें।

  1. पानी में 90 मिलीग्राम / एमएल ketamine और 6.5 मिलीग्राम / एमएल xylazine मिश्रण से 10x शेयर संवेदनाहारी समाधान तैयार है। बाँझ पीबीएस में इस शेयर समाधान 01:10 पतला बस का उपयोग करने से पहले, और अप करने के लिए 8 महीने के लिए अंधेरे में आरटी पर दुकान।
    1. वैकल्पिक रूप से, isoflurane साँस लेना द्वारा चूहों anesthetize, ऑक्सीजन के साथ 4% की एक गैस एकाग्रता के साथ शुरुआत की पूरी तरह से पशु anesthetize, और फिर बाद में प्रक्रिया की अवधि के लिए 1-2% करने के लिए यह कम।
  2. प्रति 20 ग्राम माउस शरीर के वजन 200 μl की एक खुराक पर intraperitoneally संवेदनाहारी समाधान इंजेक्षन। जाँच करें कि पशु पैर की अंगुली चुटकी परख द्वारा बेहोश करने की क्रिया के समुचित विमान तक पहुँच गया है, और है कि दिल की पुष्टि करें और सांस की दरों में सामान्य (लगभग 600 धड़क रहा है और प्रति मिनट 160 श्वास, क्रमशः) कर रहे हैं।
  3. , पृष्ठीय वापस त्वचा पर बायोप्सी की साइट से बालों को हटाने नहीं निक के लिए सावधान किया जा रहा या अंतर्निहित त्वचा को नुकसान करने के लिए एक बिजली क्लिपर का प्रयोग करें।
  4. दाढ़ी पोंछते द्वारा शल्य साइट तैयारएक पूर्वकाल के लिए पीछे दिशा Betadine और शराब पोंछे का उपयोग करने में घ क्षेत्र। सुनिश्चित करें कि सभी बाल कतरनों साइट से हटा रहे हैं।
  5. एक काला मार्कर का उपयोग कर बायोप्सी साइट रेखांकित, एक सड़न रोकनेवाला शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में एक वार्मिंग पैड पर जानवरों की जगह है, और एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा के साथ कवर (प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, बाँझ कपड़ा दृश्यता बढ़ाने के लिए छोड़ा गया था)।
    नोट: बालों के रोम के अनुदैर्ध्य वर्गों को प्राप्त करने के लिए, बायोप्सी की लंबी बढ़त (धार ऊतक विज्ञान के लिए sectioned किया जाना है, ~ 1 सेमी) एक पूर्वकाल पीछे दिशा में (बालों के रोम की दिशा के समानांतर), parasagital को चलाना चाहिए पृष्ठीय midline (चित्रा 1 ए)।
  6. अंतर्निहित मांसपेशियों प्रावरणी को नुकसान पहुँचाए बिना चिह्नित क्षेत्र के साथ एक पूर्ण मोटाई छांटना बनाने के लिए एक बाँझ # 11 छुरी का प्रयोग करें।
    नोट: excised त्वचा के ऊतक एपिडर्मिस, डर्मिस, वसा और panniculus carnosus भी शामिल है। खून बह रहा है आम तौर पर कम है।
  7. टी समतलवह एक सूखी कागज तौलिया पर त्वचा नमूना excised, डर्मिस, नीचे की ओर अतिरिक्त कागज तौलिया दूर ट्रिम, और अप करने के लिए 1 घंटे के लिए ठंड पीबीएस में नमूना स्टोर अन्य नमूने एकत्र करने की आवश्यकता है। जब तैयार है, या ऊतक विज्ञान के लिए नमूने, पूरे माउंट β-galactosidase (lacZ) धुंधला के लिए चरण 4 पर कार्रवाई करने के लिए कदम 3.1 या 3.2 करने के लिए आगे बढ़ें।
  8. सिवनी 6-0 नायलॉन टांके का उपयोग कर बायोप्सी साइट को बंद कर, मोटे तौर पर 3 मिमी के अलावा दूरी पर एक सरल बाधित पैटर्न में।
  9. चूहों कि पूरी वसूली के बाद जब तक अन्य जानवरों के रूप में एक ही पिंजरे में सर्जरी आया है वापस नहीं है।
  10. तुरंत सर्जरी के बाद पशुओं पर नजर रखने के लिए जब तक वे होश में आने, और यह भी दैनिक जब तक शल्य चिकित्सा क्षेत्र, चंगा किया है आम तौर पर 1 हफ्ते के भीतर। नामित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग के दिशा निर्देशों के अनुसार दर्दनाशक दवाओं का प्रयोग करें अगर चूहों दर्द या संकट के संकेत दिखा रहे हैं। सर्जरी के बाद 7-10 दिनों के भीतर टांके निकालें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, Carprofen गिराए (50 मिलीग्राम / एमएल शेयर solut द्वारा एनाल्जेसिक समाधान तैयारआयन) 1: बाँझ पानी में 100। गर्दन के कूड़ा पास कंधे ब्लेड के बीच समाधान subcutaneously इंजेक्षन, प्रति 20 ग्राम शरीर के वजन 200 μl (5 मिलीग्राम / किग्रा माउस शरीर के वजन) की एक खुराक पर।

3. ऊतक विज्ञान के लिए प्रक्रिया नमूने

नोट: ठीक करने के लिए और excised ऊतक प्रक्रिया, आवेदन के आधार पर नीचे या तो विधि का उपयोग करें।

  1. आयल एम्बेडेड ऊतकीय नमूने उत्पन्न करने के लिए, 2 सप्ताह के लिए आरटी पर पीबीएस हे / एन में 3.7% formalin में त्वचा और 70% इथेनॉल में दुकान को ठीक। पैराफिन में embedding से पहले कागज तौलिया निकालें।
  2. जमे हुए ऊतकीय नमूने पैदा करने के लिए, पीबीएस में ठंड 4% paraformaldehyde में ऊतक डूब और धीरे से 1 घंटे के लिए हिला। समाधान निकालें और पीबीएस के 3 परिवर्तन, मोटे तौर पर 5 मिनट प्रत्येक के साथ नमूना धो लें। अगले, ऊतक ( "सुक्रोज डूबने") cryoprotect पीबीएस में 30% sucrose में नमूना डूब।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते हुए हे / एन के साथ सेते हैं। अगले दिन, कागज टो को दूरएल और त्वचा की त्वचीय ओर से अतिरिक्त वसा ऊतकों दूर ट्रिम। ऊतक सीधे अक्टूबर में एम्बेड और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ब्लॉक की दुकान।
    नोट: सेक्शनिंग के बाद, या तो आयल या फ्रोजन नमूनों, टीडीएस, मार्केल कोशिकाओं और केरातिन 17, केरातिन 8 और neurofilament, क्रमशः के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग तंत्रिकाओं को पहचानने के लिए immunohistochemistry द्वारा कलंकित किया जा सकता, जैसा कि पहले 5,19 का वर्णन किया।

4. साबुत माउंट lacZ धुंधला द्वारा कल्पना नमूने

  1. एक्स-लड़की धुंधला समाधान तैयार है।
    1. बाँझ पानी की 250 मिलीलीटर में 0.94 ग्राम सोडियम फॉस्फेट अकेले आधार, और 2.6 ग्राम सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय जुडा है। 7.3 पीएच को समायोजित करें। इस के लिए, 1 एम मैग्नीशियम क्लोराइड के 0.5 मिलीलीटर, पोटेशियम ferrocyanide की 0.528 ग्राम, और पोटेशियम ferricyanide की 0.412 ग्राम जोड़ें। octylphenyl-पॉलीथीन ग्लाइकोल के 250 μl और deoxycholate के 125 मिलीग्राम जोड़ें। आधार समाधान अंधेरे में अप करने के लिए 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    2. 50x शेयर एक्स-लड़की soluti तैयारएक 50 मिलीग्राम / एमएल समाधान उत्पन्न करने के लिए एक्स-लड़की शेयर बोतल के लिए dimethylformamide जोड़कर पर। अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान स्टोर।
    3. बस का उपयोग करने के लिए, एक्स-लड़की आधार समाधान में शेयर एक्स-लड़की समाधान 01:50 पतला धुंधला समाधान उत्पन्न करने के लिए पहले। छोटे बायोप्सी (<1 2 सेमी), नमूना प्रति धुंधला समाधान के विभाज्य 1-2 मिलीलीटर के लिए।
  2. त्वचा के लिए एक समाधान 30 मिनट के लिए ठंड पीबीएस में 2% paraformaldehyde / 0.2% glutaraldehyde युक्त, धीरे बर्फ पर झटकों में कदम 2.7 में एकत्र नमूना ठीक करें। छोटे बायोप्सी (<1 2 सेमी) के लिए, नमूना प्रति लगानेवाला समाधान के 1-2 मिलीलीटर का उपयोग करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, नमूने 2-4% paraformaldehyde में केवल या 0.5% glutaraldehyde में ही ठीक। इष्टतम निर्धारण की स्थिति ऊतक, lacZ अभिव्यक्ति और आवेदन की डिग्री पर निर्भर करते हैं।
  3. लगानेवाला समाधान निकालें, और पीबीएस के 3 परिवर्तन, 5 मिनट प्रत्येक, आरटी पर एक प्रकार के बरतन पर साथ नमूने कुल्ला।
  4. नमूना नीचे कागज तौलिया निकालें और दूर Exces कटौतीकुंद संदंश के साथ वसा मनोरंजक और विदारक कैंची से trimming द्वारा त्वचा की त्वचीय तरफ से वसा ऊतकों है।
  5. एक्स-लड़की धुंधला समाधान में नमूना डूब, और 37 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं। LacZ अभिव्यक्ति एक विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 बी) के तहत एक नीला दाग के रूप में दिखाई जाएगी।
    नोट: यदि संकेत तीव्रता कमजोर है, धुंधला समाधान अगले दिन की जगह है और हे / एन ऊष्मायन दोहराएँ। अगर पृष्ठभूमि धुंधला भी तीव्र है, धुंधला के समय को कम करने, या नमूना आरटी पर बजाय 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं।
  6. धुंधला समाधान निकालें और पीबीएस लगभग 5 मिनट के लिए 3% DMSO युक्त, धीरे आरटी पर झटकों के 3 परिवर्तन में नमूने धो लें।
  7. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 70% इथेनॉल के 2-3 परिवर्तन में धो नमूने हैं। 70% इथेनॉल में स्टोर नमूने हैं।

5. सर्जिकल वितंत्रीभवन

  1. 2.2 चरण में के रूप में पशु anesthetize और पूरे पृष्ठीय त्वचा दाढ़ी।
  2. शल्य चिकित्सा के क्षेत्र संगठन तैयारवापस त्वचा Betadine और शराब पोंछे, और एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा के साथ पशु कवर का उपयोग च (प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, बाँझ कपड़ा दृश्यता बढ़ाने के लिए छोड़ा गया था)। जबकि एक मम्मियाँ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में सक्रिय एक हीटिंग पैड का उपयोग कर पशु गर्म रखें।
  3. एक चीरा पूंछ ऊपर मोटे तौर पर 0.5 सेमी करने के लिए गर्दन के आधार से पृष्ठीय midline के साथ एक बाँझ # 11 स्केलपेल का उपयोग करें।
  4. कुंद संदंश का प्रयोग, धीरे बाईं ओर त्वचा के पार्श्व से दूर प्रतिबिंबित सिर्फ हिंद अंग के ऊपर गर्दन के पास स्कंधास्थि वसा पैड से अंतर्निहित ऊतक कल्पना करने के लिए।
    नोट: पृष्ठीय त्वचीय नसों के रूप में सफेद किस्में है कि तेज झुकता कर रही है और (चित्रा 2) त्वचा के नीचे ढीला संयोजी ऊतक प्रवेश करने से पहले ट्रंक दीवार की पारदर्शी प्रावरणी के माध्यम से दुमदारी यात्रा दिखाई देते हैं।
  5. एक विदारक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अल्ट्रा ठीक संदंश का प्रयोग, एनिमा के बाईं ओर से विशेष रूप से नसों को दूरसंरचनात्मक साइटों T3-12 जहां से तोड़ द्वारा पर स्थित एल त्वचा में उनके प्रवेश साइट्स के लिए ट्रंक दीवार पर खंडों Bend (चित्रा 2)।
    1. ओरिएंट संदंश खड़ी है और उनकी मोड़ साइटों नीचे लगभग 0.5 सेमी लोभी और ऊपर की तरफ खींच रहा है, तंत्रिका खिंचाव और आसपास के ऊतकों (- ई -2 सी चित्रा) से अलग करने के कारण से नसों को हटा दें। आसन्न रक्त वाहिकाओं के फटने से बचने के लिए सावधान रहें।
    2. जारी रखें जब तक त्वचा के लिए ट्रंक दीवार से देने सभी नसों को हटा रहे हैं। ट्रंक दीवार के घने प्रावरणी के भीतर नसों को बाधित न करें। समय समय पर बाँझ 0.9% खारा समाधान की बूंदों को लागू करने से ऊतक प्रक्रिया के दौरान नम रखें।
    3. वैकल्पिक रूप से, संदंश के साथ ट्रंक दीवार के पास समीपस्थ सिरों लोभी और ठीक कैंची के साथ snipping द्वारा तंत्रिकाओं को हटा दें। बाद में, त्वचा के पास बाहर समाप्त होता तोड़ (आंकड़े 2 एफ - एच)। अंत में, पूर्णांक को दूरervening तंत्रिका खंडों (चित्रा 2I)।
  6. त्वचा चरण 5.4 में उजागर फ्लैप से किसी भी नसों निकालें। इन तंतुओं पृष्ठीय त्वचीय नसों के बाहर शाखाएं शामिल है और सफेद शाखाओं में बंटी त्वचा फ्लैप के चमड़े का पक्ष (आंकड़े 2J - कश्मीर) पर संयोजी ऊतक के भीतर कई मायनों स्थित किस्में के रूप में दिखाई देते हैं।
    1. ये ठीक शाखाओं को दूर करने के लिए, स्थिति ठीक संदंश मोटे तौर पर, त्वचीय सतह के समानांतर नसों समझ और ऊपर की तरफ बांधना रक्त वाहिकाओं में बाधा पहुँचा और त्वचा puncturing से बचने के लिए। जारी रखें जब तक सभी दृश्य नसों हटा दिया गया है।
  7. कुंद विच्छेदन का उपयोग करना, पृष्ठीय midline चीरा के दाईं ओर त्वचा प्रतिबिंबित करती हैं, लेकिन नसों को दूर नहीं करते। इस contralateral दिखावा संचालित नियंत्रण के रूप में काम करेगा।
  8. एक साधारण बाधित पैटर्न में पृष्ठीय midline के साथ सिवनी चीरा बंद हुआ। वसूली और बाद कार्रवाई के दौरान पशु मॉनिटरatively के रूप में पहले प्रदर्शन (कदम 2.8-10)। सर्जरी के बाद 7-10 दिनों के भीतर टांके निकालें।
  9. कार्यात्मक सर्जरी के बाद कई हफ्तों के लिए स्थिर वितंत्रीभवन अप आकलन करने के लिए, एक बिजली का उपयोग कर क्लिपर पृष्ठीय त्वचा से बालों को हटा दें।
  10. धीरे से एक चमड़े के नीचे सुई का उपयोग denervated त्वचा क्षेत्र चुभन, और ध्यान दें पशु प्रतिक्रिया करता है या नहीं, आम तौर पर सिहरन या उसके सिर मोड़ से। त्वचा क्षेत्र स्थिरतापूर्वक denervated कर दिया गया है, तो जानवर कम या कोई प्रतिक्रिया प्रदर्शन करेंगे।
  11. एक काला मार्कर का उपयोग करना, कोई जवाब नहीं के क्षेत्र है, साथ ही contralateral दिखावा पक्ष पर समान आकार और स्थान के एक क्षेत्र रूपरेखा।
  12. कदम विश्लेषण के लिए 2.1-2.9 में के रूप में इन साइटों से बायोप्सी लीजिए।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, denervated और दिखावा संचालित क्षेत्रों सहित पूरे पृष्ठीय वापस त्वचा, पूरे माउंट धुंधला हो जाना, चरण 4 में वर्णित के रूप में करने के लिए इसी तरह के लिए एक पत्रक के रूप में हटाया जा सकता है।

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Representative Results

चूहों व्यक्त tamoxifen-inducible Gli1-CreERT2 पैदा करने और एक lacZ रिपोर्टर एलील के द्वारा, यह टीडी epithelia कल्पना और समय के साथ इन कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए संभव है। पूरे वितंत्रीभवन प्रक्रिया आम तौर पर माउस प्रति 1 घंटा के भीतर पूरा किया जा सकता है और जानवर के लिए कम से कम संकट का कारण होना चाहिए।

हमारे पिछले अध्ययनों से संकेत दिया है कि नसों दोनों सामान्य टीडीएस के रूप में अच्छी तरह से उनके जुड़े केरातिन 8 + मार्केल कोशिकाओं (आंकड़े 3 ए - सी) को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं 5,19। नसों भी टीडी (चित्रा 3 डी) में Gli1 अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण हैं। त्वचा (चित्रा 1 बी) के दौरान टीडी समूहों की अपेक्षाकृत विरल उपस्थिति को देखते हुए, यह कई जमे हुए वर्गों के नमूने के लिए सही टीडी आवृत्ति quantitate करने के लिए आवश्यक है। आमतौर पर, हम 15 गैर-विपक्ष का आकलनecutive वर्गों (प्रत्येक 10 माइक्रोन मोटी और ~ 1 सेमी लंबे) दोनों दिखावा और प्रत्येक जानवर से denervated त्वचा से। बाद वितंत्रीभवन, नसों के स्थिर नुकसान, दोनों टीडी पर और त्वचा के दौरान, या तो जमे हुए या आयल वर्गों (आंकड़े 3 ए और 3 सी में इस तरह के neurofilament मानक के रूप में अखिल तंत्रिका मार्करों के लिए immunohistochemical धुंधला के अभाव से इसकी पुष्टि की जा सकती है, और जैसा कि पहले सूचना 5)। वैकल्पिक रूप से, नसों भी β3 ट्यूबिलिन या PGP9.5 6.9 की अभिव्यक्ति से पहचाना जा सकता है।

Gli1 का उपयोग करके; lacZ चूहों, यह भी टीडी में हाथी सिगनल को सक्रिय करने में और tamoxifen प्रेरित पुनर्संयोजन और वितंत्रीभवन के अनुक्रम अलग से टीडी सेल भाग्य को बनाए रखने में दोनों नसों के लिए आवश्यकता इस बात की पुष्टि करना संभव है। वितंत्रीभवन पुनर्संयोजन से पहले किया जाता है, उदाहरण के लिए, इस नसों के लिए आवश्यकता हाथी pathwa को सक्रिय करने में परीक्षण होगाY, के रूप में Cre recombinase गतिविधि और स्तर है, जो इन जानवरों में Gli1 अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध होते हैं द्वारा नजर रखी। दूसरी ओर, यदि वितंत्रीभवन पुनर्संयोजन के बाद किया जाता है, इस नसों के लिए आवश्यकता टीडी में पहले से ही लेबल की कोशिकाओं को बनाए रखने में आकलन करेगा।

आकृति 1
चित्रा 1. त्वचा बायोप्सी और पूरे माउंट lacZ टीडी epithelia का धुंधला हो जाना। (ए) (ऊपर) बायोप्सी के बाद माउस की तस्वीर और suturing से पहले। (लोअर बाएं) बायोप्सी साइट के बढ़े छवि। (निचले सही) त्वचा नमूना एक सूखी कागज तौलिया पर फ्लैट फैल अपनी डर्मिस पक्ष के साथ बायोप्सी से प्राप्त की। (बी) के एक Gli1 से त्वचा की साबुत माउंट lacZ धुंधला; lacZ माउस, 7 दिन tamoxifen के शामिल होने के बाद, सिर्फ त्वचा दृश्य में सुधार करने के लिए बायोप्सी करने से पहले depilated। Gli1 + / lacZ + टीडीएस गहन नीले समूहों के रूप में चिह्नित कर रहे हैं।स्केल बार = 1 सेमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. पृष्ठीय त्वचा denervating के लिए दो दृष्टिकोण। (ए) इन्नेर्वतेद माउस त्वचा के कार्टून आरेख। लाल बिंदीदार रेखा ट्रंक दीवार (बैंगनी) के साथ ही डर्मिस (ग्रे, तारांकन) परिलक्षित त्वचा के नीचे पर अंतर्निहित मांसलता को बेनकाब करने के पृष्ठीय midline के साथ किए गए एक एकल छांटना संकेत मिलता है। के रूप में वे ट्रंक दीवार (काला तीर एक ऐसे मोड़ इंगित करता है) छोड़ त्वचीय दुमदारी यात्रा नसों "मोड़" दिखाई देते हैं पृष्ठीय। तंत्रिका खंडों काला बिंदीदार लाइनों द्वारा सीमांकन कर रहे हैं excised किया जाना है। (बी) के झुकने का संकेत दिया (तीर) के स्थलों के साथ बरकरार तंत्रिकाओं की तस्वीर। नीले तीर 2 तंत्रिका क्षेत्रों है कि रेम हो जाएगा करने के लिए बातOved। (सी - डी) वितंत्रीभवन तकनीक दिखा तस्वीरें। झुकने और बाहर की तरफ खींचने के लिए अपनी साइटों नीचे अल्ट्रा ठीक संदंश 0.5 सेमी का प्रयोग, पकड़ नसों। (ई) 2 तंत्रिका खंडों (नीले तीर) को हटाने के बाद शरीर गुहा दिखा तस्वीर। शेष नसों भी हटा दिया जाना चाहिए। (एफ - मैं) तंत्रिका को हटाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, दिखाया गया है जहां उनकी नसों समीपस्थ पर कतरना कर रहे हैं बस के नीचे समाप्त होता है, जहां वे मोड़ (तीर) (जी), और भी distally, त्वचा में प्रवेश की अपनी साइट के लिए करीब (तीर) (एच)। ध्यान दें कि इन छवियों में midline चीरा बेहतर दृश्य के प्रयोजन के लिए ठेठ से अधिक है। (जे) midline के एक तरफ करने के लिए परिलक्षित त्वचा फ्लैप के चमड़े का पक्ष की तस्वीर। (कश्मीर) नसें बड़ा रक्त वाहिकाओं लाल रंग में संकेत दिया साथ, रेखांकित कर रहे हैं (काले लाइनों)। स्की के डर्मिस ओर स्थित तंत्रिकाओंn फ्लैप भी excised किए जाने की जरूरत है। Asterisk, परिलक्षित त्वचा फ्लैप से अंतर्निहित डर्मिस। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. नसों और वितंत्रीभवन के बाद टीडीएस की गिरावट के स्थिर नुकसान। (ए) Immunohistochemistry केरातिन 8 + मार्केल कोशिकाओं (K8, हरा) और दिखावा संचालित त्वचा में neurofilament + तंत्रिकाओं (एनएफ, लाल) के साथ टीडी epithelia दिखा। (बी) कार्टून चित्रण, टीडी epithelia हरे रंग में बैंगनी, मार्केल कोशिकाओं में प्रकाश डाला, और नीले रंग में संवेदी तंत्रिकाओं के साथ। (सी) Immunohistochemistry दिखा denervated त्वचा (Den) टीडी क्षेत्र के भीतर मार्केल सेल neurite परिसरों कमी। धराशायी पीले लाइनों, बाल कूप उपकला। Asterisk, पृष्ठभूमिडी धुंधला हो जाना। (डी) साबुत माउंट lacZ Gli1 lacZ से पृष्ठीय का धुंधला वापस त्वचा / + माउस 2 सप्ताह एकतरफा त्वचा वितंत्रीभवन के बाद। चंगा midline चीरा (तीर) के बाईं ओर बॉक्स में, प्रचुर मात्रा में लेबल टीडी epithelia दिखावा संचालित त्वचा में मनाया जाता है। midline के अधिकार के लिए, टीडीएस denervated त्वचा में दिखाई नहीं हैं। (ए), (सी) के लिए स्केल बार = 10 माइक्रोन; और (घ) 1 मिमी। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

नसों महत्वपूर्ण कार्यों न केवल सनसनी में, लेकिन यह भी स्तनधारी अंग विकास, रखरखाव और उत्थान 13,24-27 में सेवा करते हैं। नसों हाल ही में विविध त्वचा विकारों में फंसाया गया है के रूप में, तकनीक यहाँ वर्णित पशु रोग मॉडल की एक किस्म में तंत्रिका वितरण के लिए आवश्यकता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दरअसल, एकतरफा वितंत्रीभवन तकनीक ही माउस से या तो बरकरार या बाधित नसों के साथ त्वचा के प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है। बाद में डेटा के साथ एक बनती टी परीक्षण का इस्तेमाल कर रही विश्लेषण करती है यह, पशु-टु-पशु मतभेद के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए एक आदर्श आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है।

यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं काफी हद तक lacZ रिपोर्टर जीन का उपयोग करते हैं, इन प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि इस तरह के Gli1-CreERT2 एलील अन्य फ्लोरोसेंट रिपोर्टर या सशर्त alleles के साथ संयुक्त है टीडी में जीन की अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए। उदाहरण के लिए, Gli1-CreERT2 चूहों को पार किया जा सकताPatched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / जम्मू), 28 की सशर्त alleles शरण चूहों कि फार्म tamoxifen प्रेरण 5 के बाद टीडी व्युत्पन्न ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए जानवरों के साथ। यह ध्यान रखें कि Gli1-CreERT2 तनाव भी Gli1 + बाल कूप स्टेम कोशिकाओं है कि शारीरिक रूप से टीडी 13 में उन लोगों से अलग हो रहे हैं की एक सबसेट में पुनर्संयोजन लाती महत्वपूर्ण है।

वितंत्रीभवन के बाद त्वचा में नसों कई महीनों (चित्रा 3 सी) 5,19 के लिए स्थिरतापूर्वक ablated रहते हैं। अन्य अध्ययनों में, हालांकि, कुछ फिर से तंत्रिका वितरण समय पर 6 घटित होने की सूचना दी गई है। denervated phenotype के perdurance, तंत्रिका को हटाने की पूर्णता पर निर्भर हो सकता है, क्योंकि यह पूरी तरह से एक बिंदु त्वचा की dermis में प्रविष्टि की साइटों के लिए बंद करने के लिए छाती दीवार से उनके बाहर निकलने के बीच तंत्रिका खंडों आबकारी के लिए महत्वपूर्ण है।

पूरी तरह से removiबायोप्सी करने से पहले त्वचा से बाल एनजी बाद में पूरे माउंट धुंधला (चित्रा 1 बी) द्वारा टीडीएस कल्पना करने की क्षमता बढ़ा सकते हैं। यह 2 मिनट के लिए काटा गया त्वचा के लिए लोमनाशक क्रीम लगाने, और फिर कपास गेंदों का उपयोग कर एक पूर्वकाल के लिए पीछे दिशा में दूर बाल पोंछते द्वारा पूरा किया है। कृपया ध्यान दें कि बाल उड़ाना ऐनाजेन विकास के चरण में प्रवेश बढ़ावा देने के द्वारा बाल चक्र कैनेटीक्स प्रभावित कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, बाल पूरी तरह से एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर हटाया जा सकता है। इसके अलावा, पूरे माउंट गया है के रूप में पहले 23 में वर्णित किया गया immunohistochemistry, डर्मिस से अलग उपकला शीट पर टीडीएस और मार्केल कोशिकाओं कल्पना करने के लिए किया जा सकता है।

संभावना बनी हुई है कि शल्य वितंत्रीभवन शल्य साइट पर सूजन पैदा कर सकता है, संभवतः किसी भी मनाया phenotypes confounding। हमारे अनुभव में, हम वितंत्रीभवन के बाद महत्वपूर्ण सूजन, संभावना है क्योंकि जमानत के ऊतकों को नुकसान एस.के. में खर्च नहीं मनाया हैमें मामूली यदि प्रक्रिया ठीक से किया जाता है। संभावना है कि सूजन के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कम से कम करने के लिए, अतिरिक्त नियंत्रण प्रयोग में शामिल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हम ने कहा कि वितंत्रीभवन विशेष रूप से हिचकते टीडी व्युत्पन्न ट्यूमर, लेकिन नहीं सटे बाल कूप से जुड़े एक ही त्वचा के नमूनों में घावों, टीडी 5 से कम है कि वितंत्रीभवन-नहीं है और एक सामान्य घाव प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रिया की संभावना हिचकते tumorigenesis बहस।

यह ध्यान रखें कि शल्य वितंत्रीभवन संवेदी और सहानुभूति फाइबर 5 सहित सभी त्वचीय नसों, ablates महत्वपूर्ण है, और इस प्रकार या तो सामान्य या रोगग्रस्त त्वचा पर इन नसों के प्रभाव की एक सामान्य समग्र मूल्यांकन प्रदान करता है। ऐसे बोटुलिनम न्यूरोटॉक्सिन के रूप में अन्य प्रयोगात्मक दृष्टिकोण, उदाहरण के लिए pharmacologics का उपयोग कर न्यूरोट्रांसमिशन ब्लॉक करने के लिए, और अधिक विस्तृत यंत्रवत अंतर्दृष्टि 7 उपज हो सकती है, हालांकि यह स्पष्ट नहीं है कि क्या इन एजेंटों प्रतिगामी बाधितऐसे हाथी ligands के रूप में साइटोकिन्स का स्राव। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के 6 hydroxydopamine के रूप में यौगिकों त्वचा 9 में सहानुभूति नसों काटकर अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, इस तरह के कैल्सीटोनिन जीन संबंधी पेप्टाइड और पदार्थ पी के रूप में तंत्रिका व्युत्पन्न कारकों के लिए रिसेप्टर्स को निशाना बनाने के लिए अपने आला 6 के भीतर नसों और आसपास की कोशिकाओं के बीच विशेष बातचीत पूछताछ के लिए उपयोगी हो सकता है। अंत में, कई रणनीतियों की पहचान करने के संयोजन में उपयोग किया जा सकता है, या कम से कम बाहर, संभावित सिगनल तंत्र पर राज।

अंत में, या तो Wnt1-CRE या Advillin-CRE का उपयोग करते हुए संकेत है कि नसों और उनकी जगह 19 के बीच विमर्श कर रहे हैं elucidating के लिए स्वर्ण मानक का प्रतिनिधित्व कर सकते तंत्रिका वंश में तंत्रिका व्युत्पन्न कारकों के आनुवंशिक विलोपन को निशाना बनाया। इन नस्लों के न tamoxifen-inducible हैं, हालांकि, कुछ सावधानी तंत्रिका विकास या उचित टा ख़राब नहीं करता है इन संकेतों के उस व्यवधान सुनिश्चित करने के लिए उठाए जाने की जरूरत हैतंत्रिका afferents की rgeting। ऐसे Advillin-CreERT2 के रूप में एक tamoxifen-inducible Cre का उपयोग इन मुद्दों 29 को नाकाम करने में मदद कर सकता है।

कुल मिलाकर, तकनीक सामान्य और रोगग्रस्त त्वचा पर नसों के प्रभाव के अध्ययन के लिए यहां-एक वंश ट्रेसिंग, सेल दृश्य और शल्य वितंत्रीभवन प्रस्ताव शक्तिशाली दृष्टिकोण के संयोजन का वर्णन किया। अनुभव के साथ, इन प्रक्रियाओं को नियमित रूप से और मज़बूती जबकि पशु-या अन्वेषक के लिए कम से कम संकट पैदा किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol prep pads PDI B339
AnaSed (Xylazine) Lloyd NADA 139-236
Antibody, anti-Keratin 8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I rat antibody, use at 1:500 concentration
Antibody, anti-Keratin 17 Cell Signaling #4543 rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration
Antibody, anti-Neurofilament Cell Signaling C28E10 rabbit antibody, use at 1:500 concentration
Betadine prep pads Medline MDS093917
Carprofen (Rimadyl) Zoetis
Cordless rechargable clipper Wahl trimmer model 8900
Corn Oil Sigma-Aldrich C8267
Cryostat Leica CM1860
DAPI ThermoFisher Scientific D1306 use at 1:1,000 concentration
Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Depilatory Cream Nair N/A
Dimethylforamide Sigma-Aldrich 319937
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
ImmEdge Pen Vector Laboratories H-4000
Ketamine HCl Hospira NDC 0409-2051-05
Magnesium chloride Sigma M8266
Micro cover glass VWR 48404-454
Micro Slides VWR 48311-703
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-4LP
6-0 nylon sutures DemeTECH NL166012F4P
Octylphenyl-polyethylene glycol Sigma-Aldrich I8896
O.C.T. Compound Sakura Tissue-Tek 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Pottasium ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Pottasium ferricyanide Sigma-Aldrich 702587
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G
Ultra fine forceps Dumont 0103-5-PO
Vectashield Vector Laboratories H1000
X-gal Roche 10 651 745 001 Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use

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Peterson, S. C., Brownell, I., Wong, S. Y. Cutaneous Surgical Denervation: A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease. J. Vis. Exp. (112), e54050, doi:10.3791/54050 (2016).

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