Protocol
Alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll genomfördes i enlighet med föreskrifter som fastställts av University of Michigan enheten för försöksdjursmedicin.
1. Inducera genetisk rekombination hos möss
Obs: Den GLI1 TM3 (CRE / ERT2) Alj / J musstam (GLI1-CreERT2) 13 möjliggör inriktning av tamoxifen-inducerad genetisk rekombination till TD epitel. Korsa denna stam med B6.129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm1Sor / J reporter möss (LacZ) 22 för att generera GLI1, LacZ djur att visualisera TD-celler genom hela montering färgning nedan.
- Förbereda tamoxifen lösning till en koncentration av 12,5 mg / ml i majsolja.
- I en 1,5 ml rör, tillsätt upp till 20 mg av kristallina tamoxifen, och sedan 1 ml majsolja. Fast tejpa röret till en virvelblandare och virvel kontinuerligt vid den högsta inställningen vid RT tills tamoxifen har fullständigt upplösts (2-4 tim), sombekräftades genom att undersöka röret under ett dissektionsmikroskop för frånvaron av tamoxifen partiklar.
- Överför lösningen till en 15 ml rör och späd de tamoxifen till en slutlig koncentration av 12,5 mg / ml med ytterligare majsolja. Blanda genom att vortexa den viskösa lösningen under ytterligare 30 sek. Förvara lösningen i upp till en vecka vid 4 ° C i mörker.
- Injicera tamoxifen lösning intraperitonealt i GLI1; LacZ-möss, vid en volym av 200 | il per 20 g mus kroppsvikt, under en effektiv tamoxifen dos av 2,5 mg per 20 g mus vikt.
2. Harvest hudbiopsier
Obs: Beroende på försöket, skörd hudbiopsier flera dagar till veckor efter tamoxifen induktion. För alla operationer, följa standardprotokoll för gnagare kirurgi, inklusive användning av sterila handskar, bär en kirurgisk mask eller hårnät, och täcker djuret med en steril operationsduk under förfarandet.
- Förbereda 10x stock anestetisk lösning genom blandning av 90 mg / ml ketamin och 6,5 mg / ml xylazin i vatten. Späd denna stamlösning 1:10 i steril PBS precis före användning, och förvara vid rumstemperatur i mörker i upp till 8 månader.
- Alternativt, söva möss genom isofluran inandning, som börjar med en gas koncentration av 4% med syre till fullo söva djuret, och därefter sänka denna till 1-2% under hela förfarandet.
- Injicera den anestetiska lösningen intraperitonealt i en dos av 200 | il per 20 g muskroppsvikt. Kontrollera att djuret har nått rätt plan sedering av tå nypa analys och bekräftar att hjärta och andningsfrekvens är normala (ca 600 slag och 160 andetag per minut, respektive).
- Använd en elektrisk klippare att ta bort hår från platsen för biopsi på rygg tillbaka hud, försiktigt så att inte nick eller skada den underliggande huden.
- Förbereda den kirurgiska platsen genom att torka av rakningd område i en anterior till posterior riktning med hjälp av Betadine och spritkompresser. Se till att alla hår gräsklipp tas bort från platsen.
- Beskriv biopsi webbplats med hjälp av en svart markör, placera djuret på en värmande dyna i en aseptisk operationsområdet, och täck med en steril kirurgisk duk (i demonstrationssyfte, var steril duk underlåtit att öka synligheten).
Obs: För att få längdsnitt av hårsäckar, desto längre kanten av biopsi (till kanten sektioneras för histologi, ~ 1 cm) bör köras i en anterior-posterior riktning (parallell med riktningen av hårsäckarna), parasagital till ryggens mittlinje (Figur 1A). - Använd en steril # 11 skalpell för att göra en full tjocklek excision längs det markerade området utan att skada det underliggande muskel fascia.
Obs: Det utskurna hudvävnad omfattar epidermis, dermis, underhudsfett och panniculus carnosus. Blödning är vanligen minimal. - platta till than utskurna hudprov på en torr pappershandduk, dermis sida ner, klippa bort överflödigt pappershandduk, och förvara provet i kall PBS för upp till en timme om andra prover måste samlas in. När du är klar, gå vidare till steg 3,1 eller 3,2 för att bearbeta prover för histologi, eller Steg 4 för hela montering β-galaktosidas (LacZ) färgning.
- Sutur stänga biopsi webbplats med hjälp av 6-0 nylon suturer, i en enkel avbruten mönster avstånd ungefär 3 mm från varandra.
- Skicka inte tillbaka möss som har opererats i samma bur som andra djur förrän efter fullständig återhämtning.
- Övervaka djur omedelbart efter operationen tills de återfår medvetandet, och även dagligen tills operationsområdet har läkt, vanligtvis inom en vecka. Använd smärtstillande medel i enlighet med utsedda institutionens riktlinjer djurskötsel och använda om möss uppvisar tecken på smärta eller ångest. Ta bort suturer inom 7-10 dagar efter operationen.
Obs: Om det behövs, förbereda smärtstillande lösning genom att späda karprofen (50 mg / ml lager solution) 1: 100 i sterilt vatten. Injicera lösning subkutant mellan skulderbladen nära nackskinnet, vid en dos av 200 ul per 20 g kroppsvikt (5 mg / kg mus kroppsvikt).
3. Process Prover för histologi
Obs: För att fixa och bearbeta exciderade vävnaden, antingen använda metoden nedan beroende på applikation.
- För att generera paraffininbäddade histologiska prover, fixa huden i 3,7% formalin i PBS O / N vid RT och förvara i 70% etanol i upp till två veckor. Ta bort pappershandduk innan inbäddning i paraffin.
- För generering av frysta histologiska prover, dränka vävnaden i kall 4% paraformaldehyd i PBS och försiktigt skaka i 1 timme. Ta lösningen och tvätta provet med 3 byten av PBS, ungefär fem minuter vardera. Därefter dränka provet i 30% sackaros i PBS till cryoprotect vävnaden ( "sackaros förlisningen").
- Inkubera med försiktig skakning O / N vid 4 ° C. Nästa dag, ta bort papperet bogserael och trimma bort överflödigt fettvävnad från den dermala sidan av huden. Bädda vävnaden direkt i oktober och lagra det frusna blocket vid -80 ° C.
Obs: Efter snittning, kan antingen paraffin eller frysta prov färgas genom immunhistokemi för att identifiera TD, Merkel-celler och nerver med användning av antikroppar mot Keratin 17, Keratin 8 och neurofilament, respektive, såsom tidigare beskrivits 5,19.
4. Visualisera Prover från hela-fäste LacZ färgning
- Förbered X-gal-färgning lösning.
- Kombinera 0,94 g natriumfosfat monobasiskt, och 2,6 g natriumfosfat dibasisk i 250 ml sterilt vatten. Justera pH till 7,3. Sätt till detta 0,5 ml av 1 M magnesiumklorid, 0,528 g kaliumferrocyanid, och 0,412 g kaliumferricyanid. Lägg 250 pl oktylfenyl-polyetylenglykol och 125 mg deoxicholat. Baslösningen kan lagras vid 4 ° C i upp till 6 månader i mörker.
- Förbereda 50x stock X-gal-solutipå genom tillsats av dimetylformamid till den X-gal förrådsflaskan för att generera en 50 mg / ml lösning. Lagra denna lösning vid -20 ° C i mörker.
- Precis före användning, späd lager X-gal-lösning 1:50 in i X-gal baslösning för att generera färglösningen. För mindre biopsier (<1 cm 2), alikvot 1-2 ml färgningslösning per prov.
- Fixa hudprovet uppsamlas i Steg 2,7 i en lösning innehållande 2% paraformaldehyd / 0,2% glutaraldehyd i kall PBS under 30 min, försiktigt skaka på is. För mindre biopsier (<1 cm 2), använd 1-2 ml fixeringslösning per prov.
Obs! Du kan fixa prover 2-4% paraformaldehyd enbart eller i endast 0,5% glutaraldehyd. Optimala fixeringsbetingelser beror på den vävnad, grad av LacZ-uttryck och tillämpning. - Avlägsna fixeringslösning, och skölj prov med 3 byten av PBS, 5 min vardera, på en skakanordning vid RT.
- Ta bort pappershandduk under provet och skära bort excess fettvävnad från den dermala sidan av huden genom att greppa fett med trubbig pincett och trimning med dissekera sax.
- Dränka provet i X-gal-färgningslösning, och inkubera vid 37 ° CO / N. LacZ-uttryck kommer att vara synlig som en blå fläck under ett dissektionsmikroskop (Figur 1B).
Obs: Om signalstyrkan är svag, byt färglösningen nästa dag och upprepa O / N inkubation. Om bakgrundsfärgningen är för intensiv, minska tiden för infärgning eller inkubera provet vid RT i stället för 37 ° C. - Ta bort färglösningen och tvätta proverna i 3 byten av PBS innehållande 3% DMSO under ca 5 min, försiktigt skaka vid RT.
- Tvätta prov i 2-3 byten av 70% etanol för 5 min vardera. Lagra prover i 70% etanol.
5. Kirurgisk denervering
- Söva djuret som i steg 2,2 och raka hela rygghuden.
- Förbered operationsområdet of baksidan huden med Betadine och spritkompresser, och täcka djuret med en steril kirurgisk duk (i demonstrationssyfte, var steril duk underlåtit att öka synligheten). Håll djuret varmt med hjälp av en värmedyna under drift i en aseptisk operationsområdet.
- Göra ett snitt med en steril # 11 skalpell längs ryggens mittlinje från basen av halsen till ungefär 0,5 cm ovanför svansen.
- Med användning av trubbig pincett försiktigt reflektera huden på vänster sida bort från flanken för att visualisera den underliggande vävnaden från skulderblad fettkuddarna nära halsen till strax ovanför bakbenet.
Obs: Dorsal kutana nerver visas som vita trådar som reser kaudalt genom den genomskinliga fascia av stammen väggen innan skarpa kurvor och ange lös bindväv under huden (Figur 2). - Med hjälp av ultrafina pincett under ett dissekera ljusmikroskop, ta bort nerverna uteslutande från den vänstra sidan av animal ligger på anatomiska platser T3-12 genom plockning från där segmenten böja på stammen väggen de träder platser i huden (Figur 2).
- Orient pincett vertikalt och ta bort nerverna genom att ta tag ca 0,5 cm under sina böja platser och dra uppåt, vilket gör att mage att sträcka och separera från den omgivande vävnaden (figur 2C - E). Var noga med att undvika brista närliggande blodkärl.
- Fortsätt tills alla nerver som sträcker sig från stammen väggen på huden tas bort. Inte stör nerverna inom den täta fascia av stammen väggen. Håll vävnaden fuktig under hela förfarandet genom att periodiskt applicera droppar steril 0,9% saltlösning.
- Alternativt, ta bort nerver genom att greppa sina proximala ändar nära stammen väggen med pincett och klippa med fina sax. Efteråt avskilja de distala ändarna nära huden (figurerna 2F - H). Slutligen, ta bort intervening nerv segment (Figur 2i).
- Ta bort alla nerver från huden klaffen exponeras i steg 5,4. Dessa fibrer innefattar de distala grenar rygg kutana nerver och visas som vita förgrenings strängar placerade sporadiskt inom bindväv på dermala sidan av huden fliken (figurerna 2J - K).
- För att ta bort dessa fina grenar, placera fin pincett ungefär parallellt med huden ytan, ta tag i nerver och plocka upp för att undvika att störa blodkärl och punktera huden. Fortsätt tills alla synliga nerver har tagits bort.
- Med hjälp av dissektion, reflektera huden på den högra sidan av ryggens mittlinje snitt, men ta inte bort nerverna. Detta kommer att fungera som den kontralaterala skenopererade kontroll.
- Sutur längs ryggens mittlinje på ett enkelt avbruten mönster för att stänga snittet. Övervaka djuret under återhämtning och post-opertivt såsom tidigare visats (Steg 2,8-10). Ta bort suturer inom 7-10 dagar efter operationen.
- Att funktionellt bedöma stabil denervering upp till flera veckor efter operationen, ta bort hår från den dorsala huden med hjälp av en elektrisk klippmaskin.
- sticka försiktigt denerverade hudområdet med hjälp av en injektionsnål, och notera huruvida djuret svarar typiskt genom rysning eller vrida huvudet. Om det hudområde har stabilt denerverad kommer djuret uppvisar lite eller inget svar.
- Med hjälp av en svart markering, beskriva området inget svar, liksom ett område med liknande storlek och placering på den kontralaterala bluff sidan.
- Samla biopsier från dessa platser som i steg 2.1-2.9 för analys.
Obs: Alternativt kan hela rygg tillbaka hud, inklusive denerverade och skenopererade regioner, tas bort som ett enda ark för hel-mount färgning, liknande som beskrivs i steg 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att generera möss som uttrycker tamoxifen-inducerbara GLI1-CreERT2 och en LacZ reporter allel, är det möjligt att visualisera TD epitel och spåra öden dessa celler över tiden. Hela denervering förfarande typiskt kan slutföras inom en timme per mus och bör leda till minimal lidande för djuret.
Våra tidigare studier har indikerat att nerver är av avgörande betydelse för att bibehålla både normala TD samt deras associerade Keratin 8 + Merkel-celler (fig 3A - C) 5,19. Nerver är också avgörande för att främja GLI1 uttryck i TD (Figur 3D). Med tanke på den relativt ovanliga uppträdandet av TD kluster i hela huden (Figur 1B), är det absolut nödvändigt att sampla flera frysta snitt för att noggrant kvantifiera TD frekvens. Vanligtvis bedömer vi 15 icke-conshava ren sektioner (vardera 10 um tjock och ~ 1 cm långa) från både sham och denerverade hud från varje djur. Efter denervation, stabil förlust av nerver, både på TD och hela huden, kan bekräftas genom frånvaron av immunhistokemisk färgning för standard pan-neural markörer såsom neurofilament i antingen frysta eller paraffinsektioner (figurerna 3A och 3C, och som tidigare rapporterade 5). Alternativt kan nerver också identifieras genom uttryck av β3-tubulin eller PGP9.5 6,9.
Genom att använda GLI1; LacZ-möss, är det också möjligt att bekräfta både kravet på nerver vid aktivering av Hedgehog-signalering i TD och för att bibehålla TD cellöde genom att variera sekvensen av tamoxifen-inducerad rekombination och denervering. Om denervering utförs före rekombination, till exempel, skulle detta testa kravet på nerverna i aktivering av Hedgehog pathway, vilket övervakas av Cre-rekombinas-aktivitet och nivåer, vilka är korrelerade med GLI1 expression i dessa djur. Å andra sidan, om denervering utförs efter rekombination, skulle detta bedöma kravet på nerver i att upprätthålla redan-märkta celler i TD.
Figur 1. Hudbiopsi och hel-mount LacZ färgning av TD epitel. (A) (Top) Fotografera av mus efter biopsi och före suturering. (Nedre vänstra) Förstorad bild av biopsistället. (Nedre högra) Hud prov erhållet från biopsi med dess dermis sidan sprids platt på en torr pappershandduk. (B) Hela montering LacZ färgning av hud från en GLI1, LacZ mus, 7 dagar efter tamoxifen induktion, depilerades strax före biopsi för att förbättra hudens visualisering. GLI1 + / LacZ + TDs är märkta som intensivt blå kluster.Skala bar = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Två metoder för denervating rygghuden. (A) tecknad schema för innerverad mushud. Röda streckade linjerna indikerar en enkel excision görs längs ryggens mittlinje för att exponera den underliggande muskulaturen på stammen väggen (lila) samt dermis (grå, asterisk) nedanför den reflekterade hud. Rygg kutan nerver reser kaudalt verkar "böja" när de lämnar stammen väggen (den svarta pilen indikerar en sådan krök). Nervsegment som ska skäras ut avgränsas av svarta streckade linjer. (B) Ett fotografi av intakta nerver med platser för att böja anges (pilar). Blå pilarna pekar på två nervsegment som kommer att vara remOved. (C - D) Fotografier visar denervation teknik. Med hjälp av ultrafina pincett, grepp nerverna 0,5 cm under sina webbplatser för att böja och dra utåt. (E) fotografi som visar kroppskaviteten efter avlägsnande av 2 nervsegment (blå pilar). De återstående nerver måste också tas bort. (F - I) Ett alternativt tillvägagångssätt för nerv borttagning visas, där nerver klippt på deras proximala slutar strax nedanför där de böj (pilspetsar) (G), och även distalt, nära till deras webbplats för inträde i huden (pilspetsar) (H). Notera att medellinjesnitt i dessa bilder är längre än typisk i syfte att bättre visualisering. (J) Fotografi av dermala sidan av det reflekterade hudfliken till en sida om mittlinjen. (K) Nerver beskrivs (svarta linjer), med större blodkärl som anges i rött. De nerver som ligger på dermis sidan av skidn flik måste också skäras. Asterisk underliggande dermis från den reflekterade hudfliken. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Stabil förlust av nerver och försämring av TD efter denervering. (A) Immunohistokemi visar TD epitel med Keratin 8 + Merkel celler (K8, grön) och neurofilament + nerver (NF, röd) i skenopererade huden. (B) tecknad skildring, med TD epitel markerad i lila, Merkel celler i grönt, och sensoriska nerver i blått. (C) Immunohistokemi visar denerverad huden (den) saknar Merkel cell neurite komplex inom TD-området. Streckade gula linjer, hårsäcken epitel. Asterisk, background färgning. (D) Hela montering LacZ färgning av rygg tillbaka hud från GLI1 LacZ / + mus 2 veckor efter ensidig hud denervering. I rutan till vänster om den läkta mittlinjesnitt (pil) är rikligt märkta TD epitel observerats i skenopererade huden. Till höger om mittlinjen, TD är inte synliga i denerverad hud. Skalstreck = 10 | im för (A), (C); och en mm för (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nerver tjänar viktiga funktioner inte bara i känsla, men också i däggdjursorganutveckling, underhåll och förnyelse 13,24-27. Som nerver har nyligen varit inblandade i diverse hudsjukdomar, kan de metoder som beskrivs här användas för att studera kravet på innervationen i en mängd olika djursjukdomsmodeller. I själva verket kan det ensidiga denervering teknik för direkt jämförelse av huden med antingen intakta eller sprängda nerver från samma mus. Detta ger en idealisk intern kontroll för att kompensera för animal-to-djur skillnader, med efterföljande dataanalyser som använder sig av ett parat t-test.
Medan de förfaranden som beskrivs här utnyttjar i hög grad den LacZ-reportergenen, kan dessa experiment anpassas så att GLI1-CreERT2 allelen kombineras med andra fluorescerande reporter eller villkor alleler att modifiera genexpression i TD. Till exempel, kan GLI1-CreERT2 möss korsasmed djur härbärgerar villkor alleler av Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 för att generera möss som bildar TD-härledda tumörer efter tamoxifeninduktion 5. Det är viktigt att notera att GLI1-CreERT2 stammen inducerar också rekombination i en delmängd av GLI1 + hårsäcken stamceller som är fysiskt åtskilda från de i TD 13.
Efter denervation, nerver i huden förblir stabilt avlägsnad för flera månader (Figur 3C) 5,19. I andra studier har dock vissa re-innervation har rapporterats inträffa med tiden sex. Den perdurance av denerverade fenotyp kan bero på grundlighet av nerv bort, eftersom det är helt avgörande att skära nervsegment mellan deras utträde ur bröstkorgen till en punkt nära platserna för insättning i läderhuden.
helt ta borng håret från huden före biopsi kan förbättra förmågan att därefter visualisera TD från hel-mount färgning (Figur 1B). Detta åstadkoms genom att tillämpa hårborttagningskräm till klippt hud under 2 minuter, och sedan torka håret borta i en anterior till posterior riktning med hjälp av bomullstussar. Observera att hårborttagning kan påverka hår cykel kinetik genom att främja inträde i anagen tillväxtfas. Alternativt kan håret tas bort helt med användning av ett rakblad. Dessutom hela montera immunohistokemi kan utföras för att visualisera TD och Merkel-celler på epiteliala ark separerade från dermis, såsom tidigare har beskrivits 23.
Möjligheten kvarstår att kirurgisk denervering kan orsaka inflammation i operationsområdet, potentiellt confounding eventuella observerade fenotyper. Enligt vår erfarenhet har vi inte observerat signifikant inflammation efter denervering, troligen på grund av skador säkerheter vävnads uppstått i ski är liten om förfarandet görs på rätt sätt. För att minimera möjligheten att inflammation kan påverka resultaten, kan ytterligare kontroller införlivas i experimentet. Till exempel, observerade vi att denervering specifikt hämmade TD-härledda tumörer, men inte angränsande hårsäcken-associerade lesioner i samma hudprover, med argumentet att denervering-och inte en allmän sår-inducerade inflammatoriska responsen-sannolikt hämmade tumörbildning vid TD fem.
Det är viktigt att notera att kirurgisk denervering ablates alla kutana nerver, inklusive sensoriska och sympatiska fibrer 5, och ger därmed en övergripande bedömningen av påverkan av dessa nerver antingen normal eller sjuk hud. Andra experimentella metoder, till exempel med hjälp av pharmacologics såsom botulinumtoxin för att blockera neurotransmission, kan ge mer detaljerade mekanistiska insikter 7, även om det är oklart om dessa medel hämmar retrogradutsöndring av cytokiner, såsom Hedgehog-ligander. Alternativt har föreningar såsom 6-hydroxidopamin använts för att avlägsna sympatiska nerver i huden 9. Dessutom kan inriktnings receptorerna för nervhärledda faktorer såsom kalcitonin-gen-relaterad peptid och substans P att vara användbara för att förhöra specifika interaktioner mellan nerver och de omgivande cellerna inom deras nisch 6. Slutligen kan flera strategier utnyttjas i kombination för att identifiera, eller åtminstone utesluta, potentiella signalmekanismer.
Slutligen riktade genetisk deletion av nerv härledda faktorer i neurala härstamning med antingen Wnt1-Cre eller advillin-Cre kan representera den gyllene standarden för att belysa de signaler som utväxlas mellan nerver och deras nisch 19. Eftersom ingen av dessa stammar är tamoxifen-inducerbara måste dock viss försiktighet vidtas för att säkerställa att störningar av dessa signaler inte försämrar nerv utveckling eller korrekt targeting av neurala afferenter. Användning av en tamoxifen-inducible Cre såsom advillin-CreERT2 kan hjälpa kringgå dessa frågor 29.
Sammantaget teknikerna som beskrivs här, en kombination av härstamning spårning, cell visualisering och kirurgiska denervering-erbjuder kraftfulla metoder för att studera inverkan av nerver på normal och sjuk hud. Med erfarenhet, kan dessa förfaranden utföras rutinmässigt och tillförlitligt, samtidigt som de orsakar minimal lidande för djur eller utredaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
- Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
- Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
- Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
- Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
- Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
- Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
- Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
- Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
- Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
- Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
- Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
- Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
- Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
- Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
- Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
- English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
- Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
- Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
- Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
- Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
- Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
- Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).
