Protocol
Alle in dit protocol beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de door de Universiteit van Michigan Unit Laboratory Animal Medicine regelgeving.
1. Laten genetische recombinatie in Muizen
Opmerking: De Gli1 TM3 (CRE / ERT2) Alj / J muizenstam (Gli1-CreERT2) 13 maakt de gerichtheid van tamoxifen geïnduceerde genetische recombinatie te epitheel TD. Steek deze stam met B6.129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm1Sor / J reporter muizen (LacZ) 22 tot Gli1 te genereren; LacZ dieren TD cellen door whole-mount kleuring hieronder te visualiseren.
- Bereid tamoxifen oplossing tot een concentratie van 12,5 mg / ml in maïsolie.
- In een 1,5 ml buis, op tot 20 mg kristallijn tamoxifen, en vervolgens 1 ml maïsolie. Stevig tape de buis een vortex mixer en vortex continu de hoogste stand bij KT totdat de tamoxifen volledig is opgelost (2-4 uur), zoalsbevestigd door onderzoek van de buis onder een stereomicroscoop voor de afwezigheid van tamoxifen deeltjes.
- Breng de oplossing aan een 15 ml buis en verdunnen tamoxifen tot een eindconcentratie van 12,5 mg / ml met extra maïsolie. Meng door vortexen de viskeuze oplossing gedurende nog 30 sec. Bewaar deze oplossing gedurende 1 week bij 4 ° C in het donker.
- Injecteer de tamoxifen oplossing intraperitoneaal in Gli1; LacZ muizen, met een volume van 200 ul per 20 g lichaamsgewicht van de muis, een effectieve dosis van tamoxifen 2,5 mg per 20 g muis gewicht.
2. Harvest Huidbiopten
Opmerking: Afhankelijk van het experiment, huid oogst biopten enkele dagen tot weken na tamoxifen inductie. Voor alle operaties, volg standaardprotocollen voor knaagdieren een operatie, inclusief het gebruik van steriele handschoenen, het dragen van een chirurgisch masker of het haar net, en die het dier met een steriele chirurgische laken tijdens de procedure.
- Bereid 10x voorraad verdoving oplossing door het mengen van 90 mg / ml ketamine en 6,5 mg / ml xylazine in water. Verdun deze voorraadoplossing 1:10 in steriele PBS juist voor gebruik en bewaar bij kamertemperatuur in het donker tot 8 maanden.
- Alternatief verdoven muizen met isofluraan inhalatie, beginnend met een gasconcentratie van 4% met zuurstof volledig verdoven van het dier, en dit vervolgens laten zakken tot 1-2% voor de duur van de procedure.
- Injecteer het anestheticum intraperitoneaal in een dosis van 200 pl per 20 g lichaamsgewicht van de muis. Controleer of het dier de juiste vlak van sedatie door teen knijpen assay heeft bereikt, en bevestigen dat het hart en de luchtwegen tarieven zijn normaal (ongeveer 600 beats en 160 ademhalingen per minuut, respectievelijk).
- Gebruik een elektrische tondeuse om het haar van de plaats van biopsie op de rug rug huid te verwijderen, en let niet te nick of beschadiging van de onderliggende huid.
- Bereid de chirurgische plaats door het afvegen van de scheerbeurtd gebied in een anterior-to-posterior richting het gebruik van Betadine en alcohol doekjes. Zorg ervoor dat alle haren knipsels zijn van de site verwijderd.
- Schets de biopsie site met behulp van een zwarte marker, plaats het dier op een warming pad in een aseptische chirurgische gebied, en dek af met een steriele chirurgische laken (voor demonstraties, werd steriel laken weggelaten om de zichtbaarheid te verhogen).
Opmerking: Om langsliggers haarfollikels te verkrijgen, de lange kant van de biopsie (de rand te coupes voor histologie, ~ 1 cm) liggen, een anterieure-posterieure richting run (parallel aan de richting van de haarfollikels), parasagital aan de dorsale middellijn (figuur 1A). - Gebruik een steriele # 11 scalpel tot een volledige dikte van excisie langs de gemarkeerde gebied te maken zonder schade aan de onderliggende spieren fascia.
Opmerking: De uitgesneden huidweefsel omvat de epidermis, dermis, onderhuids vet en panniculus carnosus. Bloeden is meestal minimaal. - plat thij uitgesneden monster huid op een droge papieren handdoek, dermis kant naar beneden, trim weg de overtollige papieren handdoek, en bewaar het monster in koude PBS voor maximaal 1 uur als andere monsters moeten worden verzameld. Als u klaar bent, ga dan naar stap 3.1 of 3.2 om monsters voor histologie of Stap 4 voor de hele-mount β-galactosidase (LacZ) vlekken te verwerken.
- Hechtdraad sluiten de biopsieplaats via 6-0 nylon hechtingen op eenvoudige onderbroken patroon afstand ongeveer 3 mm.
- Niet muizen die een operatie in dezelfde kooi als andere dieren hebben ondergaan, tot na volledig herstel terugkeren.
- Monitor dieren onmiddellijk na de operatie tot ze het bewustzijn terug te krijgen, en ook dagelijks tot de chirurgische gebied is genezen, meestal binnen 1 week. Gebruik analgetica in overeenstemming met de aangewezen institutionele dierlijke zorg en het gebruik richtlijnen als muizen tekenen van pijn of angst vertonen. Verwijderen hechtingen binnen 7-10 dagen na de operatie.
Opmerking: Indien nodig, voor te bereiden pijnstillende oplossing door het verdunnen van carprofen (50 mg / ml voorraad solution) 1: 100 in steriel water. De injectie subcutaan tussen de schouderbladen nabij het nekvel, met een dosis van 200 pl per 20 g lichaamsgewicht (5 mg / kg lichaamsgewicht muis).
3. Proces Monsters voor histologie
Opmerking: Om vast te stellen en het verwerken van het weggesneden weefsel, gebruikt u onderstaande methode afhankelijk van de toepassing.
- Om in paraffine ingebedde histologische monsters te genereren, bevestig de huid in 3,7% formaline in PBS O / N bij kamertemperatuur en op te slaan in 70% ethanol voor maximaal 2 weken. Verwijder de papieren handdoek voor het integreren paraffine.
- Voor het opwekken van bevroren histologische samples, dompel het weefsel in koud 4% paraformaldehyde in PBS en schud gedurende 1 uur. Verwijder de oplossing en was het monster met 3 veranderingen van PBS, ongeveer 5 minuten elk. Vervolgens onderdompelen monster in 30% sucrose in PBS om het weefsel cryoprotect ( "sucrose zinken").
- Incubeer onder zacht schudden O / N bij 4 ° C. De volgende dag, verwijder de papieren hael af en snijd overtollig vetweefsel van de huid kant van de huid. Insluiten het weefsel direct in oktober en opslaan van de bevroren blok bij -80 ° C.
Opmerking: Na het snijden, kan ofwel paraffine of ingevroren monsters gekleurd door immunohistochemie met TD, Merkel-cellen en zenuwen met behulp van antilichamen tegen respectievelijk keratine 17, Keratine 8 en Neurofilament identificeren, zoals eerder beschreven 5,19.
4. Visualiseer Monsters door Whole-mount LacZ kleuring
- Bereid X-gal kleuroplossing.
- Combineer 0.94 g monobasisch natriumfosfaat en 2,6 g natriumfosfaat dibasisch in 250 ml steriel water. Stel de pH tot 7,3. Voeg hieraan druppelsgewijs 0,5 ml van 1 M magnesiumchloride, 0,528 g kalium ferrocyanide, en 0,412 g kalium ferricyanide. Voeg 250 gl octylfenyl-polyethyleenglycol en 125 mg deoxycholaat. De basische oplossing kan maximaal 6 maanden in het donker worden opgeslagen bij 4 ° C.
- Bereid 50x voorraad X-gal solutidoor toevoeging dimethylformamide om de X-gal voorraadfles een 50 mg / ml oplossing te genereren. Bewaar deze oplossing bij -20 ° C in het donker.
- Vlak voor gebruik, verdunnen stock X-gal oplossing 1:50 in X-gal oplossing base kleuroplossing genereren. Voor kleinere biopsies (<1 cm 2), aliquot 1-2 ml kleuroplossing per monster.
- Bevestig de huid monster wordt in stap 2,7 in een oplossing die 2% paraformaldehyde / 0,2% glutaraldehyde in koude PBS gedurende 30 minuten voorzichtig schudden op ijs. Voor kleinere biopten (<1 cm 2), gebruik maken van 1-2 ml fixeeroplossing per monster.
Let op: Als alternatief fix monsters in 2-4% paraformaldehyde alleen of in slechts 0,5% glutaaraldehyde. Optimale fixatie zijn afhankelijk van het weefsel, mate van LacZ expressie en toepassing. - Verwijder het fixeermiddel en spoel monsters met 3 veranderingen van PBS, 5 minuten elk, op een shaker bij kamertemperatuur.
- Verwijder de papieren handdoek onder het monster en weggesneden excess vetweefsel van de dermale kant van de huid door het vastgrijpen van het vet met stompe pincet en trimmen met ontleden schaar.
- Dompel het monster in X-gal kleuroplossing en incubeer bij 37 ° CO / N. LacZ expressie zichtbaar als een blauwe vlek onder een dissectie microscoop (Figuur 1B) zijn.
Let op: Als de intensiteit van het signaal zwak is, vervang de kleuroplossing de volgende dag en herhaal de O / N incubatie. Als de achtergrondkleuring te intens is, minder tijd van kleuring of incuberen van het monster bij kamertemperatuur in plaats van 37 ° C. - Verwijder de kleuroplossing en was de monsters 3 veranderingen van PBS dat 3% DMSO gedurende ongeveer 5 minuten voorzichtig schudden bij kamertemperatuur.
- Spoelmonsters 2-3 veranderingen van 70% ethanol gedurende 5 minuten elk. WINKEL monsters in 70% ethanol.
5. Chirurgische denervatie
- Verdoven van het dier als in stap 2.2 en scheer het gehele dorsale huid.
- Bereid de chirurgische gebied of de rug huid met behulp van Betadine en alcohol doekjes, en bedek het dier met een steriele chirurgische laken (voor demonstraties, werd steriel laken weggelaten om de zichtbaarheid te verhogen). Houd het dier warm met behulp van een verwarmingselement terwijl de bedrijfslasten in een aseptische chirurgische gebied.
- Een insnijding met een steriele scalpel # 11 langs de dorsale middellijn van de basis van de nek tot ongeveer 0,5 cm boven de staart.
- Middels stompe tang voorzichtig weerspiegelen de huid aan de linkerzijde vanaf de flank aan het onderliggende weefsel van de scapular vetkussentjes zichtbaar bij de nek tot net boven de achterste ledematen.
Opmerking: dorsale cutane zenuwen verschijnen als witte strengen die caudaal reizen door de doorschijnende fascia van de romp muur alvorens scherpe bochten en het invoeren van de losse bindweefsel onder de huid (figuur 2). - Met behulp van ultra-fijne pincet onder een dissectie lichtmicroscoop, verwijder de zenuwen uitsluitend uit de linkerkant van de animal zich op anatomische plaatsen T3-12 door plukken van waaruit de segmenten bocht de lichaamswand zij van plaatsen in de huid (figuur 2).
- Orient tang verticaal en verwijder de zenuwen door grijpen ongeveer 0,5 cm onder de bocht sites en omhoog te trekken, waardoor de zenuw te rekken en te scheiden van het omliggende weefsel (Figuur 2C - E). Wees voorzichtig om te voorkomen dat scheuren aangrenzende bloedvaten.
- Zijn alle zenuwen uitstrekt vanaf de buikwand op de huid verwijderd. Laat de zenuwen niet verstoren binnen de dichte fascia van de buikwand. Houd het weefsel vochtig gedurende de hele procedure door het periodiek aanbrengen van druppels steriele 0,9% zoutoplossing.
- Als alternatief, verwijder de zenuwen door grijpen hun proximale einden in de buurt van de romp muur met een pincet en knippen met een fijne schaar. Daarna sever de distale einden in de buurt van de huid (figuren 2F - H). Ten slotte wordt de intervening zenuw segmenten (Figuur 2I).
- Verwijder eventuele zenuwen van de huid flap blootgesteld in stap 5.4. Deze vezels omvatten het distale takken van de dorsale zenuwen en huid verschijnen wit vertakking strengen sporadisch gelegen in het bindweefsel van de dermale kant van de huidflap (figuren 2J - K).
- Om deze fijne takken te verwijderen, plaatst u de fijne tang ongeveer parallel aan de huid oppervlak, pak de zenuwen en plukken omhoog om te voorkomen dat het verstoren van de bloedvaten en het doorprikken van de huid. Ga door tot alle zichtbare zenuwen zijn verwijderd.
- Middels stompe dissectie, weerspiegelen de huid aan de rechterkant van de dorsale middellijn incisie, maar de zenuwen niet verwijderen. Dit zal dienen als de contralaterale schijn-geopereerde controle.
- Hechtdraad langs de dorsale middellijn eenvoudige onderbroken patroon om de incisie te sluiten. Bewaken van de dieren tijdens het herstel en de post-opertief zoals eerder aangetoond (Stappen 2,8-10). Verwijderen hechtingen binnen 7-10 dagen na de operatie.
- Functioneel beoordelen stabiel denervatie tot enkele weken na de operatie, verwijder het haar van de dorsale huid met behulp van een elektrische tondeuse.
- Voorzichtig prik in de gedenerveerde huid met behulp van een injectienaald, en let op of het dier reageert, meestal door huiverend of het draaien van zijn hoofd. Als de huid gebied stabiel is gedenerveerde, zal het dier weinig of geen reactie vertonen.
- Met een zwarte marker schetsen het gebied zonder reactie, en een gebied van gelijkaardige grootte en locatie aan de contralaterale zijde sham.
- Verzamel biopten van deze sites als in de stappen 2,1-2,9 voor analyse.
Let op: U kunt het gehele dorsale terug huid, met inbegrip gedenerveerde en schijn-geopereerde regio's, worden verwijderd als een blad voor whole-mount kleuring, vergelijkbaar met zoals beschreven in stap 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door het genereren van muizen die tamoxifen-induceerbare Gli1-CreERT2 en LacZ reporter allel, kan men TD epithelia visualiseren en volgen het lot van deze cellen in de tijd. De gehele denervatie procedure meestal binnen 1 uur per muis kan worden ingevuld en moet een minimale nood aan het dier te veroorzaken.
Onze vorige studies hebben aangetoond dat zenuwen cruciaal voor het handhaven van zowel normale TD en bijbehorende keratine 8 + Merkel-cellen (figuren 3A - C) 5,19. Zenuwen zijn ook van cruciaal belang voor de bevordering van Gli1 expressie in de TD (Figuur 3D). Gezien de relatief infrequente verschijning van TD clusters gehele huid (figuur 1B), is het noodzakelijk om meerdere ingevroren secties monster nauwkeurig kwantificeren TD frequentie. Typisch, beoordelen we 15 non-consecutive secties (elk 10 micrometer dik en ~ 1 cm lang) van zowel sham en gedenerveerde huid van elk dier. Na denervatie, stabiele verlies van zenuwen, zowel de TD en in de huid kan worden bevestigd door het ontbreken van immunohistochemische kleuring voor standaard pan-neuronale merkers zoals Neurofilament in zowel bevroren of paraffine secties (figuren 3A en 3C, en zoals eerder gerapporteerde 5). Als alternatief kan de zenuwen ook worden geïdentificeerd door expressie van β3-tubuline of PGP9.5 6,9.
Via Gli1; LacZ muizen, is het ook mogelijk om zowel de vereiste zenuwen bevestigen activeren Hedgehog signalering in de TD en ter handhaving TD lot van de cel door verandering van de sequentie van tamoxifen geïnduceerde recombinatie en denervatie. Als denervatie wordt uitgevoerd vóór recombinatie, bijvoorbeeld, zou het vereiste zenuwen testen activeren van de Hedgehog pathway, zoals gemeten door Cre recombinase activiteit en niveaus die correleren met Gli1 expressie in deze dieren. Aan de andere kant, als denervatie wordt uitgevoerd na recombinatie, zou het vereiste zenuwen beoordelen handhaven reeds gelabelde cellen in de TD.
Figuur 1. Huidbiopsie en hele-mount LacZ kleuring van TD epitheel. (A) (Top) Foto van de muis na biopsie en voorafgaand aan hechten. (Neder-links) vergrote afbeelding van biopsie. (Rechtsonder) Skin monster verkregen van biopsie met zijn dermis kant verspreid plat op een droge papieren handdoek. (B) Whole-mount LacZ kleuring van de huid tegen een Gli1; LacZ muis, 7 dagen na tamoxifen inductie, onthaard net voor biopsie van de huid zichtbaar te verbeteren. Gli1 + / LacZ + TD's worden aangeduid als intens blauw clusters.Schaal bar = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Twee benaderingen voor denerverende dorsale huid. (A) diagram van het beeldverhaal van geprikkeld muis huid. Rode stippellijnen geven een uitsnede gemaakt langs de dorsale middellijn aan de onderliggende spieren van de lichaamswand (paarse) en de dermis (grijs, asterisk) onder de gereflecteerde huid bloot. Dorsale cutane zenuwen caudaal reizen lijken te "buigen", zoals ze de romp muur te verlaten (de zwarte pijl geeft aan een dergelijke bocht). Zenuw segmenten worden uitgesneden worden afgebakend door zwarte stippellijnen. (B) Foto van intacte zenuwen met vestigingen van het buigen aangegeven (pijlen). Blauwe pijlen wijzen naar 2 zenuw segmenten die zal zijn remOved. (C - D) foto's waarop denervatie techniek. Met behulp van ultra-fijne tang, pak de zenuwen van 0,5 cm onder hun sites van het buigen en trek naar buiten. (E) Foto die de lichaamsholte na verwijdering van zenuw- 2 segmenten (blauwe pijlen). De resterende zenuwen moeten ook worden verwijderd. (F - I) Een alternatieve aanpak voor zenuw verwijderen is afgebeeld, waar de zenuwen zijn geknipt bij hun proximale eindigt net onder de plaats waar ze buigen (pijlpunten) (G), en ook distaal, in de buurt van hun plaats van binnenkomst in de huid (pijlpunten) (H). Merk op dat de middellijn incisie in deze beelden is langer dan normaal met het oog op een betere visualisatie. (J) foto dermale zijde van de gereflecteerde huidflap aan één zijde van de middellijn. (K) Zenuwen worden beschreven (zwarte lijnen), met grotere bloedvaten in rood aangegeven. De zenuwen gelegen aan de dermis zijde van de skin flap moeten ook worden weggesneden. Asterisk, onderliggende dermis van de gereflecteerde huidflap. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Stabiele verlies van zenuwen en verslechtering van de TD's na denervatie. (A) Immunohistochemie toont TD epitheel met Keratin 8 + Merkel cellen (K8, groen) en Neurofilament + zenuwen (NF, red) in schijn-geopereerde huid. (B) voorstelling van het beeldverhaal, met TD epithelia paars gemarkeerd, Merkel cellen in het groen, en sensorische zenuwen in het blauw. (C) Immunohistochemie toont gedenerveerde huid (den) ontbreekt Merkel cell-neuriet complexen binnen de TD gebied. Binnen de gele lijnen, haarfollikel epitheel. Asterisk, background kleuring. (D) Whole-mount LacZ kleuring van dorsale terug huid tegen Gli1 LacZ / + muis 2 weken na de eenzijdige huid denervatie. In het vak aan de linkerkant van de genezen middellijn incisie (pijl), zijn er in overvloed gelabeld TD epitheel waargenomen in schijn-geopereerde huid. Rechts van de middellijn, TDS zijn niet zichtbaar in gedenerveerde huid. Schaal bar = 10 urn voor (A), (C); en 1 mm voor (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zenuwen cruciale functies dienen niet alleen in gevoel, maar ook in zoogdier orgaanontwikkeling, onderhoud en regeneratie 13,24-27. Zoals zenuwen zijn onlangs betrokken bij diverse huidaandoeningen, kan de hier beschreven technieken worden gebruikt om de vereiste innervatie bestuderen verschillende dierlijke ziektemodellen. Inderdaad, de eenzijdige denervatie techniek maakt de directe vergelijking van de huid met hetzij intacte of verstoord zenuwen van dezelfde muis. Dit is een ideale interne controle compenseren dieren per dier verschillen, gevolgd data-analyse met gebruikmaking van een gepaarde t-test.
Hoewel de hier beschreven procedures grotendeels LacZ reportergen te gebruiken, kunnen deze experimenten worden aangepast zodat de Gli1-CreERT2 allel gecombineerd met andere fluorescerende reporter of conditionele allelen genexpressie wijzigen in de TD. Zo kan Gli1-CreERT2 muizen worden gekruistmet dieren herbergen conditionele allelen van Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 tot en met muizen die TD-afgeleide tumoren na tamoxifen inductie 5 vormen te genereren. Het is belangrijk op te merken dat de Gli1-CreERT2 induceert ook recombinatie in een subset van Gli1 + haarfollikel stamcellen die fysiek gescheiden zijn van die in de TD 13.
Na denervatie, zenuwen in de huid blijven stabiel geablateerd voor enkele maanden (figuur 3C) 5,19. In andere studies echter enige reïnnervatie is beschreven dat na verloop van tijd 6. De perdurance van de gedenerveerde fenotype kan afhangen van de grondigheid van zenuw verwijderd, is het absoluut essentieel zenuw segmenten tussen hun vertrek uit de borstwand naar een punt dichtbij de plaatsen van insertie in de dermis van de huid te snijden.
volledig removing het haar van de huid voorafgaand aan biopsie kan het vermogen om vervolgens te visualiseren TD door whole-mount kleuring (Figuur 1B) te verbeteren. Dit wordt bereikt door toepassing ontharingscrème te geschoren huid gedurende 2 min, en vervolgens vegen het haar weg in een anterior naar posterior richting behulp watten. Houdt u er rekening mee dat het ontharen kan invloed hebben op haar cyclus kinetiek door het bevorderen van de toegang tot de anagene groeifase. Als alternatief kan haar volledig worden verwijderd met behulp van een scheermesje. Bovendien ganse berg immunohistochemie kan worden uitgevoerd om TDS Merkelcellen visualiseren op epitheelvellen gescheiden van de dermis, zoals eerder beschreven 23.
De mogelijkheid blijft dat chirurgische denervatie een ontsteking kan veroorzaken van de operatiewond, potentieel verstorende elke waargenomen fenotypes. In onze ervaring, hebben we niet waargenomen significante ontsteking na denervatie, waarschijnlijk omdat het onderpand weefsel schade in de skin gering als de procedure goed uitgevoerd. De mogelijkheid dat ontsteking invloed kan minimaliseren, kunnen aanvullende controles in het experiment opgenomen. Zo zagen we dat denervatie specifiek remde-TD afgeleide tumoren, maar niet naast haarfollikel-geassocieerde laesies in dezelfde huid monsters, met het argument dat de denervatie-en niet een algemene wond geïnduceerde ontstekingsreactie-waarschijnlijk geremd ontstaan van tumoren bij de TD 5.
Het is belangrijk op te merken dat chirurgische denervatie ablates alle huidzenuwen, zoals sensorische en sympathische vezels 5, en verschaft derhalve een algemene algehele beoordeling van de invloed van deze zenuwen normale of zieke huid. Andere experimentele benaderingen, bijvoorbeeld met behulp pharmacologics zoals botulineneurotoxine neurotransmissie blokkeren, kunnen nadere mechanistische inzichten opleveren 7, hoewel het onduidelijk is of deze middelen remmen retrogradeafscheiding van cytokinen zoals Hedgehog liganden. Als alternatief hebben verbindingen zoals 6-hydroxydopamine gebruikt om sympathische zenuwen ablatie in de huid 9. Bovendien richten de receptoren voor zenuw afgeleide factoren zoals calcitonine-gen gerelateerd peptide en Substantie P kan nuttig zijn voor het ondervragen specifieke interacties tussen zenuwen en het omliggende cellen in hun niche 6 zijn. Uiteindelijk kan meerdere strategieën worden gebruikt in combinatie te identificeren, of althans uitsluiten, mogelijke signaaltransductiemechanismen.
Tenslotte gerichte genetische deletie van zenuw afgeleide factoren bij het neurale lijn behulp van Cre-Wnt1 of Advillin-Cre kan de gouden standaard voor het ophelderen van de signalen die worden uitgewisseld tussen zenuwen en de niche 19 vertegenwoordigen. Aangezien geen van deze stammen zijn tamoxifen-induceerbare echter enige voorzichtigheid moet worden genomen om verstoring van deze signalen zorgen niet schadelijk zenuw ontwikkeling of juist targeting van neurale afferenten. Gebruik van een tamoxifen-induceerbare Cre zoals Advillin-CreERT2 kan helpen omzeilen deze kwesties 29.
Over het algemeen, de technieken die hier beschreven-een combinatie van lineage tracing, mobiele visualisatie en chirurgische denervatie-aanbod krachtige aanpak voor het bestuderen van de invloed van de zenuwen op de normale en zieke huid. Met ervaring, kunnen deze procedures routinematig en betrouwbaar worden uitgevoerd, terwijl het veroorzaken van een minimale nood aan het dier-of de onderzoeker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
- Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
- Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
- Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
- Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
- Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
- Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
- Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
- Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
- Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
- Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
- Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
- Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
- Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
- Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
- Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
- English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
- Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
- Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
- Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
- Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
- Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
- Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).
