Protocol
Todos los procedimientos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las normas establecidas por la Universidad de Michigan Unidad de Medicina de Laboratorio Animal.
1. Inducir la recombinación genética en ratones
Nota: El Gli1 TM3 (CRE / ERT2) Alj / J cepa de ratón (Gli1-CreERT2) 13 permite la orientación de la recombinación genética inducida por tamoxifeno a TD epitelios. Cruzar esta cepa con B6.129S4-Gt (ROSA) reportero ratones 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 para generar Gli1; LacZ animales para visualizar las células TD por todo el montaje en la tinción de abajo.
- Preparar la solución de tamoxifeno a una concentración de 12,5 mg / ml en aceite de maíz.
- En un tubo de 1,5 ml, añadir hasta 20 mg de tamoxifeno cristalinas, y luego 1 ml de aceite de maíz. Firmemente con cinta adhesiva el tubo a un mezclador de vórtice, y agitar de forma continua a la configuración más alta a temperatura ambiente hasta que el tamoxifeno se ha disuelto completamente (2-4 h), comoconfirmado mediante el examen del tubo en un microscopio de disección por la ausencia de partículas tamoxifeno.
- Transferir la solución a un tubo de 15 ml y diluir el tamoxifeno a una concentración final de 12,5 mg / ml con aceite de maíz adicional. Mezclar mediante agitación la solución viscosa durante 30 sec adicional. Almacenar esta solución durante un máximo de 1 semana a 4 ° C en la oscuridad.
- Se inyecta la solución tamoxifeno por vía intraperitoneal en Gli1; ratones lacZ, en un volumen de 200 l por 20 g de peso corporal de ratón, para una dosis eficaz de tamoxifeno 2,5 mg por 20 g de peso del ratón.
2. Cosecha biopsias de piel
Nota: Dependiendo del experimento, las biopsias de piel cosecha de varios días o semanas después de la inducción tamoxifeno. Para todas las cirugías, seguir los protocolos estándar para la cirugía de roedores, incluyendo el uso de guantes estériles, con una máscara quirúrgica o el pelo red, y que cubre al animal con un paño quirúrgico estéril durante el procedimiento.
- Preparar la solución madre 10x anestesia mediante la mezcla de 90 mg / ml de ketamina y 6,5 mg / ml en agua xilacina. Diluir esta solución madre 1:10 en PBS estéril justo antes de su uso, y almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad durante un máximo de 8 meses.
- Alternativamente, anestesiar los ratones por inhalación de isoflurano, comenzando con una concentración de gas de 4% con el oxígeno para anestesiar completamente el animal, y, posteriormente, la reducción de este a 1-2% durante la duración del procedimiento.
- Se inyecta la solución anestésica por vía intraperitoneal a una dosis de 200 l por 20 g de peso corporal del ratón. Compruebe que el animal ha alcanzado el plano adecuado de sedación mediante el ensayo del dedo del pie de presión, y confirme que ritmo cardíaco y respiratorio son normales (aproximadamente 600 latidos y 160 respiraciones por minuto, respectivamente).
- Utilice una maquinilla eléctrica para eliminar el vello desde el sitio de la biopsia en la piel dorsal de nuevo, teniendo cuidado de no cortar ni dañar la piel subyacente.
- Preparar la zona quirúrgica limpiando la afeitadazona d en una dirección anterior-a-posterior utilizando Betadine y alcohol toallitas. Asegurar que todos los recortes de pelo se retiran del sitio.
- Esquema de la zona de la biopsia usando un marcador negro, colocar al animal en un cojín de calentamiento en un área quirúrgica aséptica, y cubrir con un paño quirúrgico estéril (con fines de demostración, se omitió campo estéril para aumentar la visibilidad).
Nota: Para obtener secciones longitudinales de los folículos pilosos, el borde más largo de la biopsia (el borde que se seccionó para histología, ~ 1 cm) debería correr en una dirección anterior-posterior (paralelo a la dirección de los folículos pilosos), parasagital a la línea media dorsal (Figura 1A). - Use un estéril # 11 bisturí para realizar una escisión de espesor total a lo largo del área marcada sin dañar la fascia muscular de subyacente.
Nota: El tejido de piel extirpada incluye la epidermis, dermis, grasa subcutánea y panículo carnoso. El sangrado suele ser mínima. - Acoplar tse escindió muestra de piel en una toalla de papel seca, la dermis lado negativo, recortar el exceso de papel de cocina, y almacenar la muestra en PBS frío para un máximo de 1 hora si otras muestras tienen que ser recogidos. Cuando esté listo, continúe con los pasos 3.1 o 3.2 para procesar las muestras para histología, o el paso 4 para β-galactosidasa tinción de todo el montaje (LacZ).
- Sutura cerrar el sitio de la biopsia usando suturas de nylon 6-0, en un patrón interrumpido sencilla espaciadas más o menos 3 mm.
- No devuelva los ratones que se han sometido a una cirugía en la misma jaula como los otros animales hasta después de la recuperación completa.
- Observar a los animales inmediatamente después de la cirugía hasta recuperar la conciencia, y también todos los días hasta el área quirúrgica se ha curado, por lo general dentro de 1 semana. Utilizar analgésicos de acuerdo con pautas para el cuidado y uso de animales institucionales designados si ratones muestran signos de dolor o angustia. Retirar las suturas dentro de 7-10 días después de la cirugía.
Nota: Si es necesario, preparar la solución analgésica mediante la dilución de carprofeno (50 mg / ml de solución madre solution) 1: 100 en agua estéril. Se inyecta la solución por vía subcutánea entre los omóplatos, cerca de la piel del cuello, a una dosis de 200 l por cada 20 g de peso corporal (5 mg / kg de peso corporal del ratón).
3. Las muestras de proceso para Histología
Nota: para fijar y procesar el tejido extirpado, utilice uno de estos métodos dependiendo de la aplicación.
- Para generar muestras histológicas embebidas en parafina, fijar la piel en el 3,7% de formalina en PBS O / N a temperatura ambiente y almacenar en un 70% de etanol durante un máximo de 2 semanas. Retire la toalla de papel antes de clavarse en parafina.
- Para la generación de muestras histológicas congeladas, sumergir el tejido en frío de paraformaldehído al 4% en PBS y agitar suavemente durante 1 hora. Retire la solución y se lava la muestra con 3 cambios de PBS, más o menos 5 minutos cada uno. A continuación, sumergir la muestra en 30% de sacarosa en PBS para cryoprotect el tejido ( "hundimiento sacarosa").
- Incubar con agitación suave O / N a 4 ° C. Al día siguiente, retire el papel o toallaEL y recorte el exceso de tejido adiposo de la cara dérmica de la piel. Incrustar el tejido directamente en PTU y almacenar el bloque congelado a -80 ° C.
Nota: Después de seccionar, ya sea de parafina o las muestras congeladas se pueden teñir mediante técnicas de inmunohistoquímica para identificar anotaciones, las células de Merkel y los nervios usando anticuerpos contra queratina 17, queratina 8 y neurofilamentos, respectivamente, como se describió previamente 5,19.
4. Las muestras Visualizar por Todo el montaje lacZ La tinción
- Preparar la solución de tinción X-gal.
- Combinar 0,94 g fosfato de sodio monobásico, y 2,6 g de fosfato de sodio dibásico en 250 ml de agua estéril. Ajustar el pH a 7,3. A esto, añadir 0,5 ml de cloruro de 1 M de magnesio, 0,528 g de ferrocianuro de potasio, y 0,412 g de ferricianuro de potasio. Añadir 250 ml de glicol de polietileno-octilfenılico y 125 mg de desoxicolato. La solución de base se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses en la oscuridad.
- Preparar 50x acciones soluti X-galen mediante la adición de dimetilformamida a la botella de X-gal de stock para generar una solución 50 mg / ml. Almacenar esta solución a -20 ° C en la oscuridad.
- Justo antes de usar, diluir la solución madre de X-gal 1:50 en solución de base X-gal para generar solución de tinción. Para biopsias más pequeños (<1 cm 2), alícuotas 1-2 ml de solución de tinción por muestra.
- Fijar la muestra de piel obtenidos en la etapa 2.7 en una solución que contiene 2% de paraformaldehído / 0,2% de glutaraldehído en PBS frío durante 30 minutos, agitando suavemente en hielo. Para biopsias más pequeños (<1 cm 2), utilizar 1-2 ml de solución de fijación por muestra.
Nota: Como alternativa, fijar las muestras en 2-4% de paraformaldehído solamente, o sólo en glutaraldehído al 0,5%. condiciones de fijación óptima dependen del tejido, el grado de expresión de LacZ y aplicación. - Eliminar la solución de fijación, y enjuagar las muestras con 3 cambios de PBS, 5 minutos cada uno, en un agitador a temperatura ambiente.
- Retire la toalla de papel debajo de la muestra y cortar exces tejido adiposo de la cara dérmica de la piel agarrando la grasa con unas pinzas romas y el recorte con las tijeras de disección.
- Sumergir la muestra en solución de tinción X-gal, y se incuba a 37 ° CO / N. La expresión de LacZ será visible como una mancha azul debajo de un microscopio de disección (Figura 1B).
Nota: Si la intensidad de la señal es débil, reemplace la solución de tinción al día siguiente y repetir la incubación O N /. Si la tinción de fondo es demasiado intenso, reducir el tiempo de tinción, o incubar la muestra a temperatura ambiente en lugar de 37 ° C. - Eliminar la solución de tinción y lavar las muestras en 3 cambios de PBS que contenía 3% de DMSO durante aproximadamente 5 min, agitando suavemente a TA.
- muestras de lavado de 2-3 cambios de etanol al 70% durante 5 minutos cada uno. Almacenar las muestras en etanol al 70%.
5. La denervación quirúrgica
- Anestesiar al animal como en el paso 2.2 y afeitar toda la piel dorsal.
- Preparar el área quirúrgica of la piel de la espalda usando Betadine y toallitas con alcohol, y cubrir al animal con un paño quirúrgico estéril (con fines de demostración, se omitió campo estéril para aumentar la visibilidad). Mantenga el animal caliente utilizando una almohadilla caliente mientras se opera en un área quirúrgica aséptica.
- Hacer una incisión con un escalpelo estéril # 11 a lo largo de la línea media dorsal de la base del cuello a aproximadamente 0,5 cm por encima de la cola.
- El uso de pinzas romas, reflejar suavemente la piel en el lado izquierdo de distancia desde el flanco de visualizar el tejido subyacente de las almohadillas de grasa escapular cerca del cuello a justo por encima de la extremidad posterior.
Nota: los nervios cutáneos dorsales aparecen como hebras blancas que viajan en sentido caudal a través de la fascia de la pared translúcida tronco antes de hacer curvas cerradas y entrar en el tejido conectivo suelto debajo de la piel (Figura 2). - El uso de pinzas ultrafinas con un microscopio de disección luz, quitar los nervios exclusivamente desde el lado izquierdo del ánimal situados en sitios anatómicos T3-12 Desplumando desde donde los segmentos de curva en la pared del tronco a sus sitios de entrada en la piel (Figura 2).
- Fórceps Orient verticalmente y eliminar los nervios agarrando aproximadamente 0,5 cm por debajo de sus sitios de flexión y tirando hacia arriba, haciendo que el nervio para estirar y separar del tejido circundante (Figura 2C - E). Tenga cuidado para evitar la ruptura de los vasos sanguíneos adyacentes.
- Continuar hasta que se eliminen todos los nervios que se extienden desde la pared del tronco a la piel. No alterar los nervios dentro de la densa fascia de la pared del tronco. Mantenga el tejido húmedo durante todo el procedimiento mediante la aplicación periódicamente gotas de solución salina estéril al 0,9%.
- Como alternativa, retire los nervios sujetando sus extremos proximal cerca de la pared del tronco con unas pinzas y cortando con unas tijeras finas. Después, cortar los extremos distales cerca de la piel (Figuras 2F - H). Por último, retire el intervening segmentos de nervio (figura 2I).
- Retire cualquier nervios del colgajo de piel expuesta en el paso 5.4. Estas fibras comprenden las ramas distales de los nervios cutáneos dorsales y aparecen como blancos hebras de ramificación situados de forma esporádica dentro del tejido conectivo en el lado dérmico de la tapa de piel (figuras 2J - K).
- Para eliminar estas ramas finas, se posicionan las pinzas finas más o menos paralelos a la superficie dérmica, agarran los nervios y arrancar hacia arriba para evitar la interrupción de los vasos sanguíneos y punción de la piel. Continúe hasta que todos los nervios visibles han sido eliminados.
- Utilizando disección roma, reflejar la piel en el lado derecho de la incisión en la línea media dorsal, pero no quite los nervios. Esto servirá como el control contralateral con operación simulada.
- Sutura a lo largo de la línea media dorsal en un patrón interrumpido sencilla para cerrar la incisión. Vigilar el animal durante la recuperación y post-opertivamente como se ha demostrado anteriormente (Pasos 2,8-10). Retirar las suturas dentro de 7-10 días después de la cirugía.
- Para evaluar funcionalmente estables denervación hasta varias semanas después de la cirugía, eliminar el vello de la piel dorsal usando una maquinilla eléctrica.
- pinchar suavemente la zona de piel denervado mediante una aguja hipodérmica, y tenga en cuenta si el animal responde, por lo general estremeciéndose o girar la cabeza. Si el área de la piel se ha denervado de forma estable, el animal exhibir poca o ninguna respuesta.
- El uso de un marcador negro, delinear el área de no respuesta, así como un área de tamaño y ubicación similar en el lado contralateral sham.
- Recoger las biopsias de estos sitios que en los pasos 2.1-2.9 para el análisis.
Nota: Como alternativa, toda la espalda dorsal de la piel, incluyendo las regiones sin nervios y con operación simulada, se puede quitar como una sola hoja para todo el montaje de la tinción, similar a como se describe en el paso 4.
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Representative Results
Por ratones que expresan la generación de tamoxifeno inducible Gli1-CreERT2 y un alelo reportero LacZ, es posible visualizar los epitelios TD y rastrear el destino de estas células en el tiempo. Todo el procedimiento de denervación normalmente se puede completar en 1 hr por ratón y debe causar angustia mínimo para el animal.
Nuestros estudios previos han indicado que los nervios son cruciales para el mantenimiento de ambas anotaciones normales, así como sus células asociadas de la queratina 8 + Merkel (Figuras 3A - C) 5,19. Los nervios también son fundamentales para promover la expresión Gli1 en el TD (Figura 3D). Dada la aparición relativamente poco frecuente de grupos TD a través de la piel (Figura 1B), es imperativo muestrear múltiples secciones congeladas para cuantificar con precisión la frecuencia de TD. Por lo general, evaluamos 15 no-contrasejecuti- secciones (cada una de 10 micras de espesor y aproximadamente 1 cm de largo) tanto de farsa y la piel denervado de cada animal. Después de la denervación, pérdida estable de los nervios, tanto en la TD y en toda la piel, puede ser confirmada por la ausencia de tinción inmunohistoquímica para los marcadores pan-neural estándar, tales como neurofilamentos, ya sea en secciones congeladas o de parafina (Figuras 3A y 3C, y como anteriormente informaron 5). Alternativamente, los nervios también pueden identificarse mediante la expresión de β3-tubulina o PGP9.5 6,9.
Mediante el uso de Gli1; ratones lacZ, también es posible para confirmar tanto la exigencia de los nervios en la activación de Hedgehog de señalización en el TD y en el mantenimiento del destino celular TD mediante la variación de la secuencia de recombinación y la denervación inducida por tamoxifeno. Si denervación se realiza antes de la recombinación, por ejemplo, esto podría probar el requisito de que los nervios en la activación de la pathwa Hedgehogy, tal como se comprueba por la actividad y los niveles de recombinasa Cre, que se correlaciona con la expresión Gli1 en estos animales. Por otro lado, si la denervación se lleva a cabo después de la recombinación, esto sería evaluar el requisito de los nervios en el mantenimiento de células marcadas ya en la TD.
Figura 1. La biopsia de la piel y todo el montaje-LacZ tinción de TD epitelios. (A) (Arriba) Fotografía del ratón después de la biopsia y antes de la sutura. (Inferior izquierda) imagen ampliada de la zona de la biopsia. (Inferior derecha) muestra la piel obtiene a partir de la biopsia con el lado de la dermis extendido sobre una toalla de papel seca. (B) tinción LacZ Todo el montaje de la piel de un Gli1; LacZ ratón, 7 días después de la inducción tamoxifeno, depilado justo antes de la biopsia de la piel para mejorar la visualización. Gli1 + / LacZ + DPF están etiquetados como racimos de color azul intenso.Barra de nivel = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Dos enfoques para la denervación piel dorsal. (A) Diagrama de dibujos animados de la piel inervado ratón. líneas de puntos rojos indican una sola escisión hecho a lo largo de la línea media dorsal para exponer la musculatura subyacente en la pared del tronco (púrpura), así como la dermis (gris, asterisco) debajo de la piel reflejada. Dorsal nervios cutáneos que viajan en sentido caudal parecen "doblar" cuando salen de la pared del tronco (la flecha negro indica una tal curva). segmentos de nervio a ser extirpados están delimitados por líneas de puntos negros. (B) Fotografía de nervios intactos con los sitios de flexión indicados (flechas). Las flechas azules indican los segmentos 2 nerviosas que serán remOved. (C - D) Fotografías que muestran la técnica de la denervación. El uso de pinzas ultrafinas, agarre los nervios de 0,5 cm por debajo de sus sitios de flexión y tire hacia fuera. (E) Fotografía que muestra la cavidad del cuerpo después de la eliminación de los 2 segmentos de nervio (flechas azules). Los nervios restantes también deben ser eliminados. (F - I) se representa un enfoque alternativo para la eliminación de nervio, donde los nervios se cortan con tijeras en sus extremos proximales justo debajo de donde se doblan (puntas de flecha) (G), y también en sentido distal, cerca de su sitio de entrada en la piel (puntas de flecha) (H). Tenga en cuenta que la incisión de línea media en estas imágenes es más largo de lo habitual para el propósito de una mejor visualización. (J) Fotografía del lado dérmico de la piel se refleja solapa a un lado de la línea media. (K) Los nervios se describen (líneas negras), con los vasos sanguíneos más grandes que se indican en rojo. Los nervios situados en el lado de la dermis de la estación de esquín colgajo también tienen que ser extirpado. Asterisco, que subyace en la dermis de la piel aleta reflejada. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Estable pérdida de los nervios y el deterioro de anotaciones después de la denervación. (A) La inmunohistoquímica que muestra epitelio TD con la queratina 8 + células de Merkel (K8, verde) y Neurofilamentos + nervios (NF, rojo) en la piel con operación simulada. (B) representación de dibujos animados, con epitelios TD destacado en las células de Merkel, púrpuras en verde, y los nervios sensoriales en azul. (C) La inmunohistoquímica muestra la piel denervado (den) que carecen de complejos de células de Merkel de axones dentro de la zona de TD. líneas amarillas discontinuas, epitelio del folículo piloso. Asterisco, background tinción. (D) Todo el montaje en la tinción de LacZ de dorsal hacia atrás la piel de Gli1 LacZ / + ratón 2 semanas después de la degeneración de la piel unilateral. En el cuadro a la izquierda de la línea media incisión curada (flecha), abundantes epitelios TD marcados se observan en la piel operación simulada. A la derecha de la línea media, anotaciones no son visibles en la piel denervado. Barra de escala = 10 m para (A), (C); y 1 mm para (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los nervios sirven para funciones cruciales no sólo en la sensación, sino también en el desarrollo de órganos de mamíferos, mantenimiento y regeneración 13,24-27. Como nervios recientemente se han implicado en diversos trastornos de la piel, las técnicas descritas aquí se pueden utilizar para estudiar el requisito de inervación en una variedad de modelos de enfermedad animal. De hecho, la técnica de denervación unilateral permite la comparación directa de la piel, ya sea con nervios intactos o alterados desde el mismo ratón. Esto permite un control interno ideal para compensar las diferencias de animales a los animales, con los datos de los análisis posterior haciendo uso de una prueba t pareada.
Mientras que los procedimientos descritos aquí utilizan en gran medida el gen reportero LacZ, estos experimentos pueden ser adaptados de tal manera que el alelo Gli1-CreERT2 se combina con otros alelos reportero fluorescente o condicionales para modificar la expresión génica en la TD. Por ejemplo, los ratones Gli1-CreERT2 se pueden cruzarcon los animales que albergan alelos condicionales de Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 para generar ratones que forman tumores derivados de TD-5 después de la inducción tamoxifeno. Es importante tener en cuenta que la cepa Gli1-CreERT2 también induce la recombinación en un subconjunto de células madre del folículo piloso Gli1 + que están separados físicamente de los de la TD 13.
Después de la denervación, los nervios en la piel se mantienen de forma estable separada por ablación durante varios meses (Figura 3C) 5,19. En otros estudios, sin embargo, algunos re-inervación se ha informado de la aparición en el tiempo 6. El perdurance del fenotipo denervado puede depender de la minuciosidad de la eliminación de los nervios, ya que es absolutamente crítico para escindir segmentos de nervio entre su salida de la pared del pecho a un punto cerca de los sitios de inserción en la dermis de la piel.
completamente quitar ang el pelo de la piel antes de la biopsia puede mejorar la capacidad de visualizar posteriormente TDs por todo el montaje de tinción (Figura 1B). Esto se logra mediante la aplicación de crema depilatoria a la piel recortada para 2 min, y después de limpiar el pelo en una dirección-anterior-posterior para el uso de bolas de algodón. Tenga en cuenta que la depilación puede afectar a la cinética del ciclo del cabello mediante la promoción de la entrada en la fase de crecimiento anágena. Alternativamente, el pelo puede ser eliminado por completo el uso de una hoja de afeitar. Además, todo el montaje se puede realizar inmunohistoquímica para visualizar anotaciones y las células de Merkel en láminas epiteliales separados de la dermis, como se ha descrito previamente 23.
Queda la posibilidad de que la denervación quirúrgica puede causar inflamación en el sitio quirúrgico, lo que podría confundir cualquier fenotipos observados. En nuestra experiencia, no hemos observado una inflamación significativa después de la denervación, probablemente debido a los daños colaterales al tejido efectúen en el sken es leve si el procedimiento se realiza correctamente. Para reducir al mínimo la posibilidad de que la inflamación puede afectar a los resultados, los controles adicionales se pueden incorporar en el experimento. Por ejemplo, se observó que la denervación inhibe específicamente tumores TD-derivada, pero no el cabello adyacente lesiones en las mismas muestras de piel folículo-asociado, con el argumento de que la denervación-y no una respuesta inflamatoria-probable tumorigénesis inhibido general de las heridas inducidas en el TD 5.
Es importante tener en cuenta que la denervación quirúrgica ablación de todos los nervios cutáneos, incluyendo fibras sensoriales y simpáticas 5, y por lo tanto proporciona una evaluación global general de la influencia de estos nervios en cualquiera de piel normal o enfermo. Otros enfoques experimentales, por ejemplo, utilizando pharmacologics como neurotoxina botulínica para bloquear la neurotransmisión, puede producir conocimientos mecánicos más detalladas 7, aunque no está claro si estos agentes inhiben retrógradala secreción de citoquinas tales como ligandos de hedgehog. Alternativamente, los compuestos tales como 6-hidroxidopamina se han utilizado para la ablación de nervios simpáticos en la piel 9. Además, la orientación de los receptores para factores nerviosas derivadas tales como calcitonina péptido relacionado con el gen y la sustancia P puede ser útil para interrogar a las interacciones específicas entre los nervios y las células circundantes dentro de su nicho 6. En última instancia, múltiples estrategias se pueden utilizar en combinación para identificar, o al menos descartan, posibles mecanismos de señalización.
Por último, la eliminación genética específica de factores nerviosas derivadas del linaje neuronal utilizando Wnt1-Cre o Advillin-Cre puede representar el estándar de oro para la aclaración de las señales que se intercambian entre los nervios y su nicho 19. Como ninguna de estas cepas son tamoxifeno inducible, sin embargo, una cierta precaución debe tomarse para asegurar que la interrupción de estas señales, no perjudica el desarrollo del nervio o adecuada targeting de los aferentes neurales. El uso de un Cre tamoxifeno inducible como Advillin-CreERT2 puede ayudar a evitar estos problemas 29.
En general, las técnicas descritas aquí, una combinación de rastreo de linaje, la visualización de células y denervación-ofrecen enfoques quirúrgicos poderosas para el estudio de la influencia de los nervios en la piel normal y enfermo. Con la experiencia, estos procedimientos se pueden realizar de forma rutinaria y fiable, mientras que causan malestar mínimo para el animal o el investigador.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
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