Protocol
Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été effectués conformément aux règles établies par l'Université du Michigan Unité de médecine de laboratoire animal.
1. Provoquer Recombinaison génétique chez la souris
Note: La Gli1 tm3 souche de souris Alj / J (/ ERT2 cre) (Gli1-CreERT2) 13 permet le ciblage de la recombinaison génétique tamoxifène induite par TD épithéliums. Traverser cette souche avec B6.129S4-Gt (ROSA) des souris rapporteurs 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 pour générer Gli1; animaux LacZ pour visualiser les cellules de TD par l' ensemble du montage coloration ci - dessous.
- Préparer une solution de tamoxifène à une concentration de 12,5 mg / ml dans de l'huile de maïs.
- Dans un tube de 1,5 ml, ajouter jusqu'à 20 mg de tamoxifène cristallins, puis on ajoute 1 ml d'huile de maïs. collez fermement le tube à un mélangeur à vortex, et le vortex en continu à la valeur la plus élevée à la température ambiante jusqu'à ce que le tamoxifène a complètement dissous (2-4 h), commeconfirmé par l'examen du tube sous un microscope à dissection pour l'absence de particules tamoxifène.
- Transférer la solution dans un tube de 15 ml et diluer le tamoxifène à une concentration finale de 12,5 mg / ml avec de l'huile de maïs supplémentaire. Mélanger par tourbillonnement la solution visqueuse pour un supplément de 30 sec. Conserver cette solution pendant 1 semaine à 4 ° C dans l'obscurité.
- Injecter la solution tamoxifène par voie intraperitoneale dans Gli1, les souris lacZ, à un volume de 200 pl par 20 g de poids corporel de la souris, pour une dose efficace de tamoxifène 2,5 mg par 20 g de poids de souris.
2. Les biopsies cutanées de récolte
Remarque: En fonction de l'expérience, des biopsies de peau de récolte plusieurs jours à quelques semaines après l'induction du tamoxifène. Pour toutes les chirurgies, suivre les protocoles standards pour la chirurgie des rongeurs, y compris en utilisant des gants stériles, portant un masque ou filet de cheveux chirurgicale, et couvrant l'animal avec un champ opératoire stérile pendant la procédure.
- Préparer 10x solution mère anesthésique en mélangeant 90 mg / ml de kétamine et 6,5 mg / ml de xylazine dans l'eau. Diluer cette solution stock 1:10 dans du PBS stérile juste avant l'utilisation, et stocker à température ambiante dans l'obscurité pendant jusqu'à 8 mois.
- En variante, anesthésier les souris par inhalation d'isoflurane, en commençant avec une concentration de 4% de gaz avec de l'oxygène pour anesthésier complètement l'animal, puis abaissant ensuite ce à 1-2% pendant toute la durée de la procédure.
- Injecter la solution anesthésique par voie intraperitoneale à une dose de 200 pl par 20 g de poids corporel de la souris. Vérifiez que l'animal a atteint le bon plan de la sédation par dosage toe de pincement, et confirmer que le cœur et les taux respiratoires sont normaux (environ 600 battements et 160 respirations par minute, respectivement).
- Utilisez une tondeuse électrique pour enlever les poils à partir du site de la biopsie sur la peau dorsale en arrière, en faisant attention de ne pas entailler ou endommager la peau sous-jacente.
- Préparer le site chirurgical en essuyant le rasaged zone dans une direction antérieure à postérieure en utilisant bétadine et alcool lingettes. Assurer que toutes les coupures de cheveux sont retirés du site.
- Outline le site de biopsie à l'aide d'un marqueur noir, placez l'animal sur un coussin chauffant dans une zone chirurgicale aseptique, et couvrir avec un drap chirurgical stérile (à des fins de démonstration, champ stérile a été omis pour augmenter la visibilité).
Remarque: Pour obtenir des sections longitudinales des follicules pileux, le bord plus de la biopsie (le bord d'être sectionnée pour l'histologie, ~ 1 cm) devrait fonctionner dans une direction antéro-postérieur (parallèle à la direction des follicules pileux), parasagital à la ligne médiane dorsale (figure 1A). - Utilisez un stérile # 11 scalpel pour faire une excision de pleine épaisseur le long de la zone marquée sans endommager le fascia musculaire sous-jacent.
Remarque: Le tissu excisé de la peau comprend l'épiderme, le derme, graisse sous-cutanée et pannicule carnosus. Bleeding est généralement minime. - Aplatir til excisé échantillon de peau sur une serviette en papier, derme côté vers le bas, rogner la serviette en papier en excès, et de stocker l'échantillon dans du PBS froid jusqu'à 1 h si d'autres échantillons doivent être prélevés. Lorsque vous êtes prêt, passer aux étapes 3.1 ou 3.2 pour traiter des échantillons pour l'histologie, ou l'étape 4 pour β-galactosidase (LacZ) coloration toute monture.
- Suture fermer le site de biopsie en utilisant 6-0 sutures en nylon, dans un motif d'interruption simple, espacées d'environ 3 mm.
- Ne retournez pas les souris qui ont subi une chirurgie dans la même cage que d'autres animaux jusqu'à ce que la récupération complète.
- Surveillez les animaux immédiatement après la chirurgie jusqu'à ce qu'ils reprennent conscience, et aussi tous les jours jusqu'à ce que la zone chirurgicale a guéri, généralement à moins de 1 semaine. Utilisez des analgésiques en conformité avec le soin des animaux et de l'utilisation des lignes directrices institutionnelles désignées si les souris présentent des signes de douleur ou de détresse. Retirer les sutures dans les 7-10 jours après la chirurgie.
Remarque: Si nécessaire, préparer une solution analgésique en diluant carprofène (50 mg / ml Stock solution) 1: 100 dans de l'eau stérile. Injecter la solution par voie sous- cutanée entre les omoplates à proximité de la peau du cou, à une dose de 200 pl par 20 g de poids corporel (5 mg / kg de poids corporel de souris).
3. Les échantillons de procédé pour histologie
Remarque: Pour fixer et traiter le tissu excisé, utilisez la méthode ci-dessous en fonction de l'application.
- Pour générer des échantillons histologiques paraffine, fixer la peau dans 3,7% de formaline dans du PBS O / N à la température ambiante et de stocker dans 70% d'éthanol pendant 2 semaines. Retirer la serviette en papier avant de l'intégrer dans la paraffine.
- Pour générer des échantillons histologiques congelés, plonger le tissu dans le froid paraformaldéhyde 4% dans du PBS et agiter doucement pendant 1 h. Retirer la solution et laver l'échantillon avec 3 changements de PBS, environ 5 minutes chacun. Ensuite, plonger l'échantillon dans 30% de saccharose dans du PBS pour cryoprotect le tissu ( "naufrage saccharose").
- Incuber avec douceur O secouant / N à 4 ° C. Le lendemain, retirez le câble de papierel et rogner l'excès de tissu adipeux du côté dermique de la peau. Intégrer le tissu directement dans OPO et stocker le bloc congelé à -80 ° C.
Remarque: Après la coupe, soit la paraffine ou les échantillons congelés peuvent être colorés par immunohistochimie pour identifier TDs, les cellules de Merkel et les nerfs en utilisant des anticorps contre la kératine 17, kératine 8 et Neurofilament, respectivement, comme décrit précédemment 5,19.
4. Visualiser les échantillons par Whole-mount LacZ Coloration
- Préparer une solution de coloration X-gal.
- Combiner 0,94 g de phosphate monosodique et 2,6 g de phosphate dibasique de sodium dans 250 ml d'eau stérile. Ajuster le pH à 7,3. Pour ce faire, on ajoute 0,5 ml de 1 M de chlorure de magnésium, 0,528 g de ferrocyanure de potassium et 0,412 g de ferricyanure de potassium. Ajouter 250 ul de polyéthylène-glycol-octylphényle et de 125 mg de désoxycholate. La solution de base peut être stocké à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois à l'obscurité.
- Préparer 50x actions X-gal solutipar l'ajout de diméthylformamide à la X-gal bouteille de réserve pour générer un / ml, solution à 50 mg. Conserver cette solution à -20 ° C dans l'obscurité.
- Juste avant l'utilisation, une solution diluée stocks X-gal 1:50 dans la solution de base X-gal pour produire une solution de coloration. Pour de plus petites biopsies (<1 cm 2), aliquoter 1-2 ml de solution de coloration par échantillon.
- Fixer l'échantillon de peau recueillis à l'étape 2.7 dans une solution contenant 2% de paraformaldéhyde / 0,2% de glutaraldéhyde dans du PBS froid pendant 30 minutes, en secouant doucement sur la glace. Pour de plus petites biopsies (<1 cm 2), en utilisant 1 à 2 ml d' une solution de fixation par échantillon.
Remarque: Vous pouvez également fixer des échantillons dans 2-4% paraformaldéhyde seulement, ou 0,5% de glutaraldéhyde seulement. conditions de fixation optimales dépendent du tissu, le degré d'expression et de l'application LacZ. - Retirer la solution de fixateur, et rincer les échantillons avec 3 changements de PBS, 5 minutes chacun, sur un agitateur à température ambiante.
- Retirer la serviette en papier sous l'échantillon et couper excess le tissu adipeux du côté du derme de la peau en saisissant la graisse avec une pince de coupe émoussés et avec des ciseaux de dissection.
- Immerger l'échantillon dans une solution de coloration X-gal, et incuber à 37 ° CO / N. Expression LacZ sera visible comme une tache bleue sous un microscope à dissection (figure 1B).
Remarque: Si l'intensité du signal est faible, remplacer la solution de coloration le jour suivant et répéter l'O / N incubation. Si la coloration de fond est trop intense, réduire le temps de coloration, ou incuber l'échantillon à température ambiante au lieu de 37 ° C. - Retirer la solution de coloration et laver les échantillons en 3 changements de PBS contenant 3% de DMSO pendant environ 5 minutes, en secouant doucement à la température ambiante.
- Laver les échantillons à 2-3 changements de 70% d'éthanol pendant 5 minutes chacun. Conserver les échantillons dans 70% d'éthanol.
5. dénervation chirurgicale
- Anesthetize l'animal comme à l'étape 2.2 et de se raser la peau du dos entier.
- Préparer la zone chirurgicale of la peau du dos en utilisant Betadine et tampons imbibés d'alcool, et couvrir l'animal avec un champ opératoire stérile (à des fins de démonstration, champ stérile a été omis pour augmenter la visibilité). Gardez la chaleur animale au moyen d'un coussin chauffant tout en opérant dans une zone chirurgicale aseptique.
- Faire une incision en utilisant un scalpel stérile # 11 le long de la ligne médiane dorsale de la base du cou, à environ 0,5 cm au-dessus de la queue.
- En utilisant des pinces émoussées, reflètent la peau en douceur sur le côté gauche du flanc pour visualiser le tissu sous-jacent des coussinets adipeux scapulo près du cou juste au-dessus du membre postérieur.
Remarque: les nerfs cutanés dorsaux apparaissent brins comme blancs qui voyagent caudale à travers le fascia translucide de la paroi du coffre avant de prendre les virages serrés et en entrant le tissu conjonctif lâche sous la peau (Figure 2). - En utilisant des pinces ultra-fines sous un microscope à lumière dissection, enlever les nerfs exclusivement à partir du côté gauche de l'animal situés sur des sites anatomiques T3-12 par la plumaison d'où la courbure des segments à la paroi du coffre à leurs sites dans la peau d'entrée (Figure 2).
- Forceps Orient verticalement et enlever les nerfs en saisissant environ 0,5 cm en dessous de leurs sites de pliage et en tirant vers le haut, ce qui provoque le nerf à étirer et à séparer les tissus environnants (figure 2C - E). Soyez prudent pour éviter la rupture des vaisseaux sanguins adjacents.
- Continuez jusqu'à ce que tous les nerfs s'étendant à partir de la paroi du coffre à la peau sont enlevés. Ne pas perturber les nerfs dans le fascia dense de la paroi du coffre. Maintenir le tissu humide tout au long de la procédure en appliquant périodiquement des gouttes de solution saline stérile à 0,9%.
- Alternativement, enlever les nerfs en saisissant leurs extrémités proximales à proximité de la paroi du tronc avec une pince et coupant avec des ciseaux fins. Ensuite, couper les extrémités distales près de la peau (figures 2F - H). Enfin, retirez le intervening segments nerveux (Figure 2I).
- Retirez tous les nerfs du lambeau de peau exposée à l'étape 5.4. Ces fibres comprennent les branches distales des nerfs cutanés dorsaux et apparaissent sous forme de poils de ramification blancs situés de façon sporadique dans le tissu conjonctif sur le côté dermique du lambeau cutané (Figures 2J - K).
- Pour supprimer ces fines branches, positionner les pince fine à peu près parallèles à la surface cutanée, saisir les nerfs et cueillent vers le haut pour éviter de perturber les vaisseaux sanguins et la perforation de la peau. Continuez jusqu'à ce que tous les nerfs visibles ont été enlevés.
- Utilisation de dissection, refléter la peau sur le côté droit de la dorsale incision médiane, mais ne pas enlever les nerfs. Ce sera le contrôle de la pseudo-opérées controlatéral.
- Suturer le long de la ligne médiane dorsale selon un motif interrompu simple pour fermer l'incision. Surveiller l'animal lors de la récupération et de post-opertivement comme démontré précédemment (étapes 2,8-10). Retirer les sutures dans les 7-10 jours après la chirurgie.
- Pour évaluer fonctionnellement stable dénervation jusqu'à plusieurs semaines après la chirurgie, enlever les poils de la peau du dos en utilisant une tondeuse électrique.
- piquez délicatement la zone de peau dénervé utilisant une aiguille hypodermique, et notez si l'animal répond, généralement en frissonnant ou en tournant la tête. Si la zone de la peau a été stable dénervé, l'animal va présenter peu ou pas de réponse.
- L'utilisation d'un marqueur noir, délimiter la zone de non-réponse, ainsi que d'une zone de la taille et l'emplacement similaire sur le côté factice controlatéral.
- Collecter des biopsies de ces sites dans les étapes 2.1-2.9 pour l'analyse.
Remarque: Vous pouvez également l'ensemble du dos dorsale la peau, y compris les régions dénervés et opérés de manière fictive, peut être retiré en une seule feuille pour toute monture coloration, semblable à la manière décrite à l'étape 4.
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Representative Results
Par souris exprimant le tamoxifène générant inductible Gli1-CreERT2 et un allèle LacZ rapporteur, il est possible de visualiser les épithéliums de TD et de suivre les destins de ces cellules au cours du temps. La procédure de dénervation entière peut généralement être achevée dans 1 heure par souris et devrait causer de la détresse minimale à l'animal.
Nos études antérieures ont montré que les nerfs sont cruciales pour le maintien des deux TDs normales ainsi que leurs cellules associées kératine 8 + Merkel (figures 3A - C) 5,19. Les nerfs sont également essentiels pour la promotion de l' expression Gli1 dans le TD (Figure 3D). Compte tenu de l'aspect relativement peu fréquente des grappes de TD à travers la peau (figure 1B), il est impératif de goûter à des coupes congelées multiples pour quantifier avec précision la fréquence de TD. En règle générale, nous évaluons 15 non contre-indicationsections EXÉCUTIVE (chaque 10 um d'épaisseur et ~ 1 cm de long) à la fois factice et la peau dénervé de chaque animal. À la suite de la dénervation, la perte stable de nerfs, tant au niveau du TD et à travers la peau, peut être confirmée par l'absence de coloration immunohistochimique des marqueurs pan-neuronal standard tels que des neurofilaments dans les deux sections congelées ou en paraffine (figures 3A et 3C, et , comme précédemment rapporté 5). En variante, les nerfs peuvent également être identifiées par l' expression de la tubuline ou β3-PGP9.5 6,9.
À l'aide Gli1, les souris LacZ, il est également possible de confirmer à la fois l'exigence de nerfs dans l' activation de la signalisation Hedgehog dans la TD et TD à maintenir le destin des cellules en faisant varier la séquence de recombinaison et la dénervation induite par le tamoxifène. Si la dénervation est effectuée avant recombinaison, par exemple, il testera l'exigence de nerfs dans l'activation du pathwa Hedgehogy, comme contrôlé par l' activité et au niveau de la recombinase Cre, qui sont corrélés avec l' expression Gli1 chez ces animaux. D'autre part, si la dénervation est effectuée après la recombinaison, cela d'évaluer la nécessité de nerfs dans le maintien des cellules déjà marquées dans le TD.
Figure 1. La biopsie de la peau et l' ensemble du montage LacZ coloration des épithéliums TD. (A) (Top) Photographie de souris après biopsie et avant suturer. (En bas à gauche) Image agrandie du site de biopsie. échantillon (Lower right) de la peau obtenue à partir de la biopsie avec son côté derme se propager à plat sur une serviette en papier. (B) Le total-mount coloration LacZ de la peau à partir d' un Gli1; LacZ souris, 7 jours après l' induction du tamoxifène, épilé juste avant la biopsie pour améliorer la visualisation de la peau. Gli1 + / LacZ + TDs sont étiquetés comme des grappes bleu intense.Barre d' échelle = 1 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Deux approches pour denervating peau dorsale. (A) Diagramme de bande dessinée de la peau innervée de la souris. lignes en pointillés rouges indiquent une seule excision faite le long de la ligne médiane dorsale pour exposer la musculature sous-jacente sur la paroi du coffre (violet), ainsi que le derme (gris, astérisque) sous la peau réfléchie. Dorsaux nerfs cutanés voyageant caudale semblent "bend" comme ils quittent la paroi du coffre (la flèche noire indique un tel virage). segments de nerf à être excisées sont délimitées par des pointillés noirs. (B) Photographie de nerfs intacts avec des sites de pliage indiqués (flèches). Les flèches bleues indiquent les segments 2 nerveuses qui seront removed. (C - D) photographies montrant la technique de dénervation. En utilisant une pince ultra-fine, saisir les nerfs de 0,5 cm en dessous de leurs sites de pliage et tirer vers l'extérieur. (E) photographie montrant la cavité corporelle après le retrait de 2 segments de nerf (flèches bleues). Les nerfs restants doivent également être éliminés. (F - I) Une approche alternative pour l' élimination des nerfs est représenté, où les nerfs sont ciselée à leurs extrémités proximales juste au- dessous où ils bend (flèches) (G), et aussi distalement, près de leur site d'entrée dans la peau (pointes de flèches) (H). A noter que l'incision médiane dans ces images est plus longue que la normale dans le but d'une meilleure visualisation. (J) Photographie du côté dermique du lambeau cutané réfléchi sur un côté de la ligne médiane. (K) Les nerfs sont décrits (lignes noires), avec de plus grands vaisseaux sanguins indiqués en rouge. Les nerfs situés sur le côté du derme du ski,n rabat doivent également être excisée. Asterisk, qui sous-tend le derme du lambeau de peau réfléchi. Barre d' échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Perte stable des nerfs et la détérioration des TDs après dénervation. (A) immunohistochimie montrant épithéliums TD avec kératine 8 + cellules de Merkel (K8, vert) et neurofilaments + nerfs (NF, rouge) dans la peau d'opération fictive. (B) représentation de bande dessinée, avec TD épithéliums mis en évidence dans les cellules violettes, Merkel en vert, et les nerfs sensoriels en bleu. (C) immunohistochimie montrant la peau dénervé (den) manque complexes de cellules-neurites Merkel dans la zone de TD. lignes jaunes pointillées, follicule pileux épithélium. Asterisk, background coloration. (D) Le total de montage LacZ coloration de la peau à partir dorsale Gli1 LacZ / + souris 2 semaines après dénervation unilatérale de la peau. Dans la boîte à la gauche de l'incision médiane guéri (flèche), épithéliums TD marqués abondantes sont observées dans la peau d'opération fictive. A droite de la ligne médiane, TDs ne sont pas visibles dans la peau dénervé. Barre d'échelle = 10 pm pour (A), (C); et 1 mm pour (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nerfs remplissent des fonctions cruciales non seulement dans la sensation, mais aussi dans le développement des organes de mammifères, la maintenance et la régénération 13,24-27. Comme les nerfs ont récemment été impliqués dans les troubles de la peau diverses, les techniques décrites ici peuvent être utilisées pour étudier la nécessité d'innervation dans une variété de modèles de maladies animales. En effet, la technique de dénervation unilatérale permet la comparaison directe de la peau avec soit des nerfs intactes ou lysées provenant de la même souris. Cela fournit un contrôle interne idéal pour compenser les différences animal à l'animal, avec des analyses de données ultérieures faisant usage d'un test t apparié.
Bien que les procédures décrites ici utilisent en grande partie du gène rapporteur LacZ, ces expériences peuvent être adaptées de telle sorte que l'allèle-Gli1 CreERT2 est combiné avec d' autres rapporteurs fluorescents ou conditionnels allèles pour modifier l' expression génique dans le TD. Par exemple, les souris Gli1-CreERT2 peuvent être croiséesavec des animaux hébergeant des allèles conditionnels de Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 pour générer des souris qui forment des tumeurs TD dérivées après l' induction du tamoxifène 5. Il est important de noter que la souche Gli1-CreERT2 induit également une recombinaison dans un sous - ensemble de Gli1 + cellules souches de follicules pileux qui sont physiquement séparées de celles du 13 TD.
Après dénervation, les nerfs de la peau restent stable ablatée pendant plusieurs mois (figure 3C) 5,19. Dans d' autres études, cependant, certains réinnervation a été signalée au cours du temps 6. Le perdurance du phénotype dénervé peut dépendre de la rigueur de l'élimination des nerfs, car il est absolument essentiel pour exciser des segments nerveux entre leur sortie de la paroi thoracique à un point proche des sites d'insertion dans le derme de la peau.
Complètement retrait dng les cheveux de la peau avant une biopsie peut améliorer la capacité de visualiser ultérieurement touchés par toute monture coloration (figure 1B). Ceci est réalisé en appliquant une crème dépilatoire sur la peau écrêté pendant 2 min, puis en essuyant les cheveux loin dans une direction antérieure à postérieure à l'aide de boules de coton. S'il vous plaît noter que dépilation peut affecter la cinétique du cycle capillaire en favorisant l'entrée dans la phase de croissance anagène. En variante, les cheveux peuvent être complètement éliminé à l'aide d'une lame de rasoir. En outre, toute monture immunohistochimie peut être effectuée pour visualiser TDs et les cellules de Merkel sur des feuilles épithéliales séparés du derme, comme cela a été décrit précédemment 23.
La possibilité demeure que la dénervation chirurgicale peut provoquer une inflammation au niveau du site chirurgical, potentiellement confondant toutes les phénotypes observés. Dans notre expérience, on n'a pas observé une inflammation importante après dénervation, probablement parce que les lésions tissulaires collatéraux encourus dans le sken est légère si la procédure est faite correctement. Pour minimiser la possibilité que l'inflammation peut affecter les résultats des contrôles supplémentaires peuvent être incorporés dans l'expérience. Par exemple, nous avons observé que la dénervation inhibée spécifiquement les tumeurs TD dérivés, mais les lésions dans les mêmes échantillons de peau pas les cheveux adjacents folliculo-associé, en faisant valoir que la dénervation-et non pas une réponse inflammatoire-probable tumorigenèse générale induite par blessure inhibée au TD 5.
Il est important de noter que la dénervation chirurgicale ablation toutes nerfs cutanés, y compris des fibres sensitives et sympathiques 5, et fournit ainsi une évaluation globale générale de l'influence de ces nerfs soit sur la peau normale ou malade. D' autres approches expérimentales, par exemple en utilisant Pharmacologics tels que la neurotoxine botulinique pour bloquer neurotransmission, peut donner des idées mécanistes plus détaillées 7, bien qu'il soit difficile de savoir si ces agents inhibent rétrogradela sécrétion de cytokines telles que des ligands Hedgehog. En variante, des composés tels que la 6-hydroxydopamine ont été utilisés pour l' ablation des nerfs sympathiques dans la peau 9. De plus, le ciblage des récepteurs pour des facteurs nerveux dérivées telles que la calcitonine gene-related peptide et la substance P peut être utile pour interroger des interactions spécifiques entre les nerfs et les cellules environnantes dans leur créneau 6. En fin de compte, plusieurs stratégies peuvent être utilisées en combinaison pour identifier, ou tout au moins exclure, les mécanismes de signalisation potentiels.
Enfin, ciblé suppression génétique des facteurs nerveuses dérivées de la lignée de neurones en utilisant soit Wnt1-Cre ou Advillin-Cre peut représenter l'étalon-or pour élucider les signaux qui sont échangés entre les nerfs et leur niche 19. Comme aucune de ces souches sont tamoxifène-inductible, cependant, une certaine prudence doit être prise pour assurer que la perturbation de ces signaux ne porte pas atteinte au développement des nerfs ou la bonne targeting des afférences neuronales. Utilisation d'un Cre tamoxifène-inductible tel que Advillin-CreERT2 peut aider à contourner ces problèmes 29.
Dans l'ensemble, les techniques décrites ici-une combinaison de traçage de la lignée, la visualisation des cellules et des approches puissantes dénervation-offre chirurgicales pour étudier l'influence des nerfs sur la peau normale et malade. Avec l'expérience, ces procédures peuvent être effectuées régulièrement et de manière fiable, tout en causant une détresse minimale à l'animal ou l'enquêteur.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
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