Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften von der University of Michigan Einheit für Labortiermedizin etabliert durchgeführt.
1. Induce genetische Rekombination bei Mäusen
Hinweis: Die Gli1 tm3 (cre / ERT2) Alj / J - Maus - Stamm (Gli1-CreERT2) 13 ermöglicht Targeting von Tamoxifen-induzierte genetische Rekombination Epithelien TD. Überqueren Sie diesen Stamm mit B6.129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm1Sor / J Reporter - Mäuse (LacZ) 22 Gli1 zu erzeugen; LacZ Tiere TD Zellen sichtbar zu machen , indem ganze Montage unten Färbung.
- Bereiten tamoxifen Lösung auf eine Konzentration von 12,5 mg / ml in Maisöl.
- In einem 1,5-ml-Röhrchen, in den 20 mg kristallines Tamoxifen, und dann 1 ml Maisöl. Fest mit Klebeband um das Rohr zu einem Wirbelmischer und Wirbel kontinuierlich bei der höchsten Einstellung bei RT, bis die Tamoxifen vollständig (2-4 h) gelöst hat, alsbestätigt durch das Rohr unter einem Binokular auf die Abwesenheit von Tamoxifen-Partikel zu untersuchen.
- Die Lösung wird in einem 15 ml-Röhrchen und verdünne die Tamoxifen auf eine Endkonzentration von 12,5 mg / ml mit zusätzlichem Maisöl. Mischen durch Vortexen die viskose Lösung für weitere 30 sec. Bewahren Sie diese Lösung für bis zu 1 Woche bei 4 ° C im Dunkeln.
- Injizieren der Tamoxifen - Lösung intraperitoneal in Gli1; LacZ Mäusen in einem Volumen von 200 & mgr; l pro 20 g Mauskörpergewicht, für eine wirksame tamoxifen Dosis von 2,5 mg pro 20 g Mausgewicht.
2. Ernte Hautproben
Hinweis: Je nach Experiment Ernte Hautbiopsien mehrere Tage bis Wochen nach einer Tamoxifen-Induktion. Für alle Operationen, folgen Standardprotokolle zur Bekämpfung von Nagetieren Chirurgie, einschließlich sterile Handschuhe verwenden, eine chirurgische Maske oder Haarnetz tragen, und bedeckt das Tier mit einem sterilen Operationstuch während des Verfahrens.
- Bereiten Sie 10fach Betäubungslösung durch Mischen von 90 mg / ml Ketamin und 6,5 mg / ml Xylazin in Wasser. Verdünnen dieser Stammlösung 01.10 in sterile PBS unmittelbar vor der Verwendung und Speicherung bei RT im Dunkeln für bis zu 8 Monaten.
- Alternativ anästhesieren Mäusen durch Isofluran-Inhalations, mit einer Gaskonzentration von 4% mit Sauerstoff beginnen vollständig das Tier zu betäuben, und dann anschließend das für die Dauer des Verfahrens auf 1-2% zu senken.
- Injizieren Sie die Anästhesielösung intraperitoneal bei einer Dosis von 200 & mgr; l pro 20 g Körpergewicht der Maus. Überprüfen Sie, ob das Tier die richtige Ebene der Sedierung durch Zehe Prise Test erreicht hat, und bestätigen, dass die Herz- und Atemfrequenz sind normal (etwa 600 Schläge und 160 Atemzüge pro Minute, jeweils).
- Verwenden Sie einen elektrischen Klipper das Haar von der Stelle der Biopsie an der dorsalen Rückenhaut, wobei darauf geachtet, nicht zu nick oder beschädigen die darunter liegende Haut zu entfernen.
- Bereiten Sie die Operationsstelle durch die Rasur Abwischend Bereich in einer anterioren-to-posterior mit Betadine und Alkoholtupfer. Sicherstellen, dass alle Haarabschnitte von der Website entfernt werden.
- Skizzieren Sie die Biopsiestelle eine schwarze Markierung, legen Sie das Tier auf eine wärmende Unterlage in einem aseptischen OP-Bereich mit und decken mit einem sterilen Operationstuch (zu Demonstrationszwecken wurde sterile Abdeckung weggelassen Sichtbarkeit zu erhöhen).
Hinweis: Um die Längsschnitte der Haarfollikel zu erhalten, die längere Kante der Biopsie (die Kante werden für die Histologie geschnitten, ~ 1 cm) in einer anterior-posterioren Richtung laufen soll (parallel zur Richtung der Haarfollikel), parasagital zu der dorsalen Mittellinie (1A). - Verwenden Sie eine sterile # 11 Skalpell eine vollständige Dicke Exzision entlang des markierten Bereichs zu machen, ohne die zugrunde liegende Muskelfaszie zu beschädigen.
Hinweis: Die ausgeschnittene Hautgewebe enthält die Epidermis, Dermis, subkutanes Fett und panniculus carnosus. Bluten ist in der Regel minimal. - Flatten ter Hautprobe auf einem trockenen Papiertuch ausgeschnitten, Seite Dermis nach unten, schneiden Sie das überschüssige Papiertuch, und speichern Sie die Probe in kaltem PBS für bis zu 1 Stunde weg, wenn andere Proben gesammelt werden müssen. Wenn Sie fertig sind, gehen Sie zu den Schritten 3.1 oder 3.2 Proben für die Histologie zu verarbeiten, oder Schritt 4 für ganze Montage β-Galactosidase (LacZ) Färbung.
- Suture schließen Sie die Biopsiestelle mit 6-0 Nylonnaht, in einem einfachen unterbrochenen Muster etwa 3 mm voneinander entfernt.
- Rückkehr nicht Mäuse, die Chirurgie in den gleichen Käfig wie andere Tiere durchlaufen, bis nach vollständiger Genesung haben.
- Überwachen Tiere unmittelbar nach der Operation, bis sie wieder zu Bewusstsein, und auch täglich, bis die OP-Bereich verheilt ist, in der Regel innerhalb von 1 Woche. Verwenden Sie Analgetika entsprechend bezeichneten institutionellen Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung, wenn Mäuse Anzeichen von Schmerzen oder Leiden aufweisen. Entfernen Nähte innerhalb von 7-10 Tagen nach der Operation.
Hinweis: Bei Bedarf vorbereiten Analgetikum Lösung von Carprofen Verdünnung (50 mg / ml Stamm solutIon) 1: 100 in sterilem Wasser. Injizieren Sie die Lösung subkutan zwischen die Schulterblätter in der Nähe der Genick, in einer Dosis von 200 & mgr; l pro 20 g Körpergewicht (5 mg / kg Maus Körpergewicht).
3. Verfahren Die Proben für die Histologie
Hinweis: Um das zu beheben und verarbeiten, um die ausgeschnittenen Gewebe, entweder Methode unten, je nach Anwendung.
- Um in Paraffin eingebettete histologische Proben, fixieren Sie die Haut in 3,7% Formalin in PBS O / N bei RT und Speicher in 70% Ethanol für bis zu 2 Wochen generieren. Entfernen Sie das Papiertuch, bevor sie in Paraffin eingebettet wird.
- Für gefrorene histologischen Proben zu erzeugen, um das Gewebe in kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS versenken und sanft für 1 Stunde schütteln. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Probe mit 3 Änderungen von PBS, etwa jeweils 5 Minuten. Als nächstes wird die Probe in 30% Saccharose in PBS überschwemmen das Gewebe ( "Sucrose Versenken") zu cryoprotect.
- Inkubieren unter leichtem O / N bei 4 ° C schütteln. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Papier Schlepptauel und überschüssiges Fettgewebe von der Hautseite der Haut wegschneiden. Einbetten des Gewebes direkt in Oktober und lagern Sie den gefrorenen Block bei -80 ° C.
Hinweis: Nach dem Schneiden, entweder Paraffin oder gefrorenen Proben können durch Immunhistochemie gefärbt werden TDs zu identifizieren, Merkel - Zellen und Nerven Antikörper gegen Keratin 17, Keratin 8 und Neurofilament mit jeweils wie vorstehend beschrieben 5,19.
4. Visualize Proben von Whole-mount LacZ-Färbung
- Bereiten Sie X-gal-Färbung Lösung.
- Kombinieren 0,94 g monobasisches Natriumphosphat und 2,6 g dibasisches Natriumphosphat in 250 ml sterilem Wasser. Der pH-Wert auf 7,3. Dazu werden 0,5 ml 1 M Magnesiumchlorid, 0,528 g Kalium-Ferrocyanid und 0,412 g Kaliumferricyanid. In 250 ul octylphenyl-Polyethylenglykol und 125 mg Deoxycholat. Die Basislösung kann für bis zu 6 Monate im Dunkeln bei 4 ° C gelagert werden.
- Bereiten 50x Lager X-gal solution von Dimethylformamid zur X-gal Vorratsflasche Zugabe einer 50 mg / ml Lösung zu erzeugen. Bewahren Sie diese Lösung bei -20 ° C im Dunkeln.
- Unmittelbar vor der Verwendung, Lager X-gal-Lösung 01.50 in X-gal Basenlösung verdünnen Färbelösung zu erzeugen. Für kleinere Biopsien (<1 cm 2), aliquoten 1-2 ml Färbelösung pro Probe.
- Befestigen Sie die Hautprobe in Schritt gesammelt 2,7 in einer Lösung, die 2% Paraformaldehyd / 0,2% Glutaraldehyd in kaltem PBS für 30 min auf Eis sanft schütteln. Für kleinere Biopsien (<1 cm 2), 1-2 ml Fixierungslösung pro Probe verwenden.
Hinweis: Alternativ fixieren Proben in 2-4% Paraformaldehyd nur, oder nur in 0,5% Glutaraldehyd. Optimale Fixierung Bedingungen hängen von dem Gewebe, dem Grad der LacZ-Expression und Anwendung. - Entfernen Sie die Fixierungslösung und Spülen Proben mit 3 Änderungen der PBS, 5 min jeweils auf einem Schüttler bei RT.
- Entfernen Sie das Papiertuch unterhalb der Probe und wegschneiden excess Fettgewebe von der dermalen Seite der Haut durch das Fett mit stumpfen Pinzette greifen und Trimmen mit Dissektionsscheren.
- Tauchen Sie die Probe in X-gal-Färbung Lösung und Inkubation bei 37 ° CO / N. LacZ - Expression wird als blauer Fleck unter einem Binokular (Abbildung 1B) sichtbar sein.
Hinweis: Wenn die Signalstärke schwach ist, ersetzen Sie die Färbelösung am nächsten Tag und wiederholen Sie die O / N Inkubation. Wenn die Hintergrundfärbung zu intensiv ist, reduzieren die Zeit der Färbung oder der Probe bei RT inkubieren anstelle von 37 ° C. - Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Proben in drei Änderungen von PBS für ca. 5 min 3% DMSO enthält, vorsichtig bei RT schütteln.
- Wasch Proben in 2-3 Änderungen von 70% Ethanol für jeweils 5 Minuten. Store Proben in 70% Ethanol.
5. Chirurgische Denervation
- Anesthetize das Tier, wie in Schritt 2.2 und rasieren die gesamte Rückenhaut.
- Bereiten Sie den OP-Bereich of der Rückseite Haut mit Betadine und Alkoholtupfer, und das Tier mit einem sterilen Operationstuch abdecken (zu Demonstrationszwecken wurde sterile Abdeckung zu erhöhen Sichtbarkeit weggelassen). Halten Sie das Tier warm und ein Heizkissen mit, während in einem aseptischen OP-Bereich arbeitet.
- Einen Einschnitt ein steriles Skalpell # 11 entlang der dorsalen Mittellinie von der Basis des Halses etwa 0,5 cm oberhalb des Schwanzes verwenden.
- Mit stumpfen Pinzette, reflektieren die Haut sanft auf der linken Seite von der Flanke entfernt das darunter liegende Gewebe aus den Skapulier Fettpolstern in der Nähe des Halses zu visualisieren über dem Hinterbein nur.
Hinweis: dorsale Hautnerven als weiße Stränge erscheinen , die kaudal durch die transluzente Faszie des Rumpfwand reisen , bevor scharfe Kurven machen und das lockere Bindegewebe unter der Haut eintritt (Abbildung 2). - Mit ultra-feinen Pinzette unter einem Lichtmikroskop seziert, entfernen Sie die Nerven ausschließlich von der linken Seite der Animal liegt an anatomischen Stellen T3-12 durch Zupfen von wo die Segmente Biegung an der Rumpfwand an ihren Eintrittsstellen in die Haut (Abbildung 2).
- Orient Zange vertikal und die Nerven zu entfernen um etwa 0,5 cm unterhalb ihrer bend Seiten Greifen und Ziehen nach oben, wodurch die Nerven zu dehnen und zu trennen von dem umgebenden Gewebe (2C - E). Achten Sie darauf, zu vermeiden benachbarte Blutgefäße zerreißen.
- Weiter, bis alle Nerven von der Rumpfwand an der Haut verlauf entfernt werden. Sie nicht die Nerven innerhalb der dichten Faszie des Rumpfwand stören. Halten Sie das Gewebe feucht während des gesamten Verfahrens durch periodisches Tropfen steriler 0,9% Salzlösung anwenden.
- Alternativ entfernen Nerven durch ihre proximalen Enden in der Nähe der Rumpfwand mit einer Pinzette greifen und schnippeln mit einer feinen Schere. Danach trennen die distalen Enden in der Nähe der Haut (2F - H). Schließlich entfernen Sie die intervening Nervensegmente (Abbildung 2i).
- Entfernen Sie alle Nerven von der Hautlappen ausgesetzt in Schritt 5.4. Diese Fasern umfassen , um die distalen Zweige der dorsalen Hautnerven und erscheinen als weiße verzweigenden Stränge angeordnet sporadisch im Bindegewebe auf der dermalen Seite der Haut Klappe (Figuren 2J - K).
- Um diese feinen Zweige zu entfernen, positionieren Sie die feinen Pinzette auf die Hautoberfläche in etwa parallel, greifen die Nerven und zupfen nach oben zu vermeiden, Blutgefäße zu stören und Stechen der Haut. Fortfahren, bis alle sichtbaren Nerven entfernt wurden.
- Mit stumpfen Dissektion, spiegeln die Haut auf der rechten Seite der Rückenmittellinie Schnitt, aber nicht entfernen Sie die Nerven. Dies wird als der Gegenscheinoperierten Kontrolle dienen.
- Suture entlang der dorsalen Mittellinie in einer einfachen unterbrochenen Muster den Schnitt zu schließen. Überwachen Sie das Tier während der Wiederherstellung und Post-opertiv wie zuvor gezeigt (Schritte 2,8-10). Entfernen Nähte innerhalb von 7-10 Tagen nach der Operation.
- Um funktionell beurteilen stabil Denervierung bis zu mehreren Wochen nach der Operation, entfernen Sie die Haare aus der Rückenhaut eine elektrische Klipper verwenden.
- stechen Sie vorsichtig die denervierten Hautbereich eine Injektionsnadel, und beachten Sie, ob das Tier, in der Regel durch Schaudern oder den Kopf drehen reagiert. Wenn der Hautbereich stabil denervierten wurde, wird das Tier zeigen wenig oder keine Antwort.
- Mit einem schwarzen Marker, umreißen die Fläche keine Antwort, sowie eine Fläche von ähnlicher Größe und Lage auf der Gegenseite Schein.
- Sammeln Sie Biopsien von diesen Seiten, wie in den Schritten 2.1-2.9 für die Analyse.
Hinweis: Alternativ kann die gesamte dorsale Rückenhaut, einschließlich denervierten und scheinoperierten Regionen können für ganze-mount-Färbung ähnlich wie ein einzelnes Blatt entfernt werden, wie in Schritt 4 beschrieben.
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Representative Results
Durch die Erzeugung von Mäusen Tamoxifen-induzierbare Gli1-CreERT2 und einem LacZ - Reporter - Allel exprimieren , ist es möglich , TD Epithelien und verfolgen das Schicksal dieser Zellen im Laufe der Zeit sichtbar zu machen. Das gesamte Denervierung Verfahren kann in der Regel innerhalb von 1 Stunde pro Maus abgeschlossen sein und minimal Qualen des Tieres verursachen sollte.
Unsere frühere Studien haben gezeigt , dass Nerven entscheidend sind für sowohl normale TDs sowie ihre zugehörigen Keratin 8 + Merkel - Zellen (3A - C) Aufrechterhalten 5,19. Nerves sind auch entscheidend für die Förderung Gli1 Expression in der TD (Figur 3D). Angesichts der relativ seltene Auftreten von TD - Clustern in der gesamten Haut (Abbildung 1B), ist es zwingend notwendig , mehrere gefrorene Abschnitte Probe genau TD Frequenz zu quantifizieren. Typischerweise beurteilen wir 15 nicht-consecutive Abschnitte (jeweils 10 & mgr; m dick und ca. 1 cm lang) aus sowohl Schein und denervierten Haut von jedem Tier. Folgende Denervierung, stabile Verlust von Nerven, sowohl an der TD und in der gesamten Haut, kann entweder in gefrorenem oder Paraffinschnitten (3A und 3C und wie zuvor durch das Fehlen von immunhistochemische Färbung für Standard pan-neurale Marker, wie Neurofilament bestätigt werden berichtet 5). Alternativ Nerven können auch durch Expression von β3-Tubulin oder PGP9.5 6,9 identifiziert werden.
Durch die Verwendung Gli1; LacZ - Mäusen, ist es auch möglich , sowohl die Anforderung für Nerven in aktivierenden Hedgehog - Signalisierung in der TD und TD bei der Aufrechterhaltung der Zellschicksal zu bestätigen , indem die Sequenz von Tamoxifen-induzierte Rekombination und Denervierung variiert. Wenn Denervation vor der Rekombination durchgeführt wird, zum Beispiel würde testen dies die Voraussetzung für die Nerven in den Hedgehog pathwa Aktivierungy, wie durch Cre - Rekombinase - Aktivität überwacht und Ebenen, die mit Gli1 Expression in diesen Tieren korreliert sind. Auf der anderen Seite, wenn Denervation nach der Rekombination durchgeführt wird, würde dies die Voraussetzung für Nerven bei der Aufrechterhaltung der Beurteilung bereits markierten Zellen in der TD.
Abbildung 1. Die Hautbiopsie und ganze-mount LacZ - Färbung von TD Epithelien. (A) (Top) Foto der Maus nach der Biopsie und vor dem Vernähen. (Unten links) vergrößertes Bild Biopsiestelle. (Unten rechts) Hautprobe aus Biopsie mit seiner Dermis Seite flach auf einem trockenen Papiertuch ausgebreitet erhalten. (B) insgesamt Montage LacZ Färbung der Haut von einem Gli1; LacZ Maus, 7 Tage nach einer Tamoxifen - Induktion, enthaart kurz vor der Biopsie der Haut Visualisierung zu verbessern. Gli1 + / LacZ + TDs sind so intensiv blau - Cluster bezeichnet.Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Zwei Ansätze für denervating Rückenhaut. (A) Cartoon Diagramm innervierten Mäusehaut. Rot gepunkteten Linien einen einzigen entlang der dorsalen Mittellinie gemacht Exzision die darunter liegende Muskulatur auf dem Kofferraumwand (lila) sowie der Dermis (grau, Sternchen) unter der Haut reflektiert zu belichten. Hautnerven Dorsaler kaudal erscheinen zu "bend" reisen, da sie die Rumpfwand (der schwarze Pfeil zeigt eine solche Kurve) verlassen. Nervensegmenten ausgeschnitten werden, sind durch schwarze gestrichelte Linien abgegrenzt. (B) Foto von intakten Nerven mit den Standorten der Biegung angegeben (Pfeile). Blaue Pfeile zeigen auf zwei Nervensegmente, die rem seinOved. (C - D) Fotografien Denervierung Technik zeigt. Mit ultra-feinen Pinzette, Griff die Nerven 0,5 cm unter ihren Websites Biegen und nach außen ziehen. (E) Foto zur Darstellung der Körperhöhle nach Entfernung von zwei Nervensegmente (blaue Pfeile) zeigt. Die übrigen Nerven müssen auch entfernt werden. (F - I) Ein alternativer Ansatz für die Nerven Entfernung dargestellt, wo die Nerven an ihren proximalen snipped Enden knapp unter , wo sie biegen (Pfeilspitzen) (G), und auch distal, in der Nähe ihrer Eintrittsstelle in die Haut (Pfeilspitzen) (H). Man beachte, dass die Mittellinienschnitt in diesen Bildern ist länger als typisch für die Zwecke der besseren Darstellung. (J) Fotografie der dermalen Seite des reflektierten Hautlappen auf einer Seite der Mittellinie. (K) Nerves skizziert (schwarze Linien), mit größeren Blutgefäße in rot angezeigt. Die Nerven auf der Dermis Seite des Skin Klappe müssen auch herausgeschnitten werden. Asterisk, Dermis von der reflektierten Hautlappen zu Grunde liegen. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Stabile Verlust von Nerven und eine Verschlechterung der TDs nach Denervation. (A) Immunhistochemie zeigt TD Epithelien mit Keratin 8 + Merkel - Zellen (K8, grün) und Neurofilament + Nerven (NF, rot) in scheinoperierten Haut. (B) Cartoon Darstellung, mit TD Epithelien in lila markiert, in grün Merkel - Zellen und sensorischen Nerven in blau. (C) Immunhistochemie zeigt denervierter Haut (den) Merkel - Zell-Neuritenkomplexen im TD - Bereich fehlt. Eine gestrichelte gelbe Linien, Haarfollikel Epithels. Asterisk, background Färbung. (D) insgesamt Montage LacZ Färbung der dorsalen Rückenhaut von Gli1 LacZ / + Maus von 2 Wochen nach einseitiger Haut Denervierung. In der Box auf der linken Seite des geheilten Mittelschnitt (Pfeil), sind reichlich beschriftet TD Epithelien scheinoperierten Haut beobachtet. Auf der rechten Seite der Mittellinie, TDs sind nicht sichtbar in denervierten Haut. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m für (A), (C); und 1 mm für (D). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Nerves dienen wichtige Funktionen nicht nur in der Empfindung, sondern auch in Säugetierorgan Entwicklung, Pflege und Regeneration 13,24-27. Wie Nerven kürzlich verwickelt in verschiedenen Hautkrankheiten haben, werden die hier beschriebenen Techniken kann die Anforderung für Innervation in einer Vielzahl von Tierkrankheitsmodellen zur Untersuchung verwendet werden. Tatsächlich erlaubt die einseitige Denervierung Technik für den direkten Vergleich der Haut mit entweder intakten oder gestört Nerven aus der gleichen Maus. Dies ist eine ideale interne Kontrolle für die zum Ausgleich von Tier zu Tier Unterschiede mit anschließender Datenanalysen Verwendung eines gepaarte t-Test zu machen.
Während die hier beschriebenen Verfahren weitgehend die LacZ - Reportergen verwenden, können diese Experimente angepasst werden , so dass das Gli1-CreERT2 Allel mit anderen fluoreszierenden Reporter oder bedingte Allele kombiniert Genexpression in der TD zu modifizieren. Zum Beispiel kann Gli1-CreERT2 Mäusen gekreuzt werden ,mit Tieren bedingte Allele Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 beherbergt , Mäuse zu erzeugen , die TD-abgeleiteten Tumoren nach einer Tamoxifen - Induktion 5 bilden. Es ist wichtig , dass die Gli1-CreERT2 Stamm Rekombination Haarfollikelstammzellen in einer Untergruppe von Gli1 + zu beachten , die physisch getrennt sind , 13 in der TD von denjenigen auch induziert.
Folgende Denervierung, Nerven in der Haut verbleiben mehrere Monate (3C) 5,19 stabil abgetragenen. In anderen Studien hat jedoch einige Reinnervation berichtet über die Zeit 6 auftreten. Die perdurance des denervierten Phänotyp kann auf der Gründlichkeit der Nerven Entfernung abhängen, da es absolut entscheidend ist Nervensegmente zwischen ihrem Austritt aus der Brustwand zu einem Punkt nahe den Orten der Einführung in die Dermis der Haut auszuschneiden.
komplett Removing das Haar von der Haut vor der Biopsie kann die Fähigkeit verbessern , um anschließend TDs durch ganze-mount - Färbung (Abbildung 1B) zu visualisieren. Dies wird für 2 Minuten durch die Anwendung Enthaarungscreme clipped Haut erreicht, und dann wischte das Haar in einer anterior-to-posterioren Richtung Wattebäusche verwenden. Bitte beachten Sie, dass Enthaarung kann durch die Förderung der Eintritt in die Anagen Wachstumsphase Haarzyklus Kinetik beeinflussen. Alternativ kann das Haar vollständig mit einer Rasierklinge entfernt werden. Außerdem montieren ganze Immunhistochemie kann von der Dermis getrennt TD und Merkel - Zellen auf Epithelschichten zu visualisieren, wie bereits zuvor 23 beschrieben , durchgeführt werden.
Es bleibt die Möglichkeit, dass die chirurgische Denervierung Entzündung an der Operationsstelle führen kann, die möglicherweise alle beobachteten Phänotypen Verwechselung. Nach unserer Erfahrung haben wir eine deutliche Entzündung nach Denervation nicht beobachtet, wahrscheinlich, weil die Sicherheiten Gewebe in der sk entstandenen Schadenin ist gering, wenn das Verfahren richtig gemacht wird. Um die Möglichkeit zu minimieren, dass die Entzündung Ergebnisse beeinflussen können, können zusätzliche Kontrollen in das Experiment einbezogen werden. So beobachteten wir , dass Denervierung TD-abgeleiteten Tumoren spezifisch gehemmt, aber nicht neben Haar Läsionen in der gleichen Hautproben Follikel-assoziierte, mit dem Argument , dass die Denervierung-und nicht eine allgemeine wundinduzierten Entzündungsreaktion-wahrscheinlich gehemmt tumorigenesis am TD - 5.
Es ist wichtig zu beachten , dass die chirurgische Denervierung alle Hautnerven abträgt, einschließlich sensorischen und sympathischen Fasern 5, und stellt somit eine allgemeine allgemeine Bewertung des Einflusses dieser Nerven auf entweder normal oder erkrankter Haut. Andere experimentelle Ansätze, zum Beispiel pharmacologics wie Botulinum Neurotoxin mit Neurotransmission zu blockieren, detailliertere mechanistische Erkenntnisse 7 kann ergeben, obwohl es unklar ist , ob diese Mittel rückläufig hemmenSekretion von Cytokinen, wie Hedgehog-Liganden. Alternativ können Verbindungen, wie 6-Hydroxydopamin verwendet wurden 9 sympathischen Nerven in der Haut abzutragen. Zusätzlich Nerven abgeleitete die Rezeptoren für das Targeting Faktoren wie Calcitonin - Gen-verwandtes Peptid und Substanz P kann zum Abfragen spezifischen Wechselwirkungen zwischen Nerven und den umgebenden Zellen innerhalb ihrer Nische 6 nützlich sein. zu identifizieren oder zumindest auszuschließen, potentielle Signalmechanismen letztlich können mehrere Strategien in Kombination verwendet werden.
Schließlich gezielte genetische Deletion von Nerven abgeleitete Faktoren in der neuronalen Linie entweder Wnt1-Cre oder Advillin-Cre kann den Goldstandard für die Aufklärung , die Signale repräsentieren , die 19 zwischen Nerven und ihre Nische ausgetauscht werden. Da weder dieser Stämme jedoch Tamoxifen-induzierbare sind, muss eine gewisse Vorsicht, dass eine Unterbrechung dieser Signale sichergestellt werden soll, nicht Nerven Entwicklung oder die richtige ta beeinträchtigenrgeting von neuralen Afferenzen. Die Verwendung einer Tamoxifen-induzierbare Cre wie Advillin-CreERT2 können diese Probleme 29 helfen umgehen.
Insgesamt beschriebenen Techniken hier-eine Kombination von Linienverfolgung, Zell Visualisierung und chirurgische Denervierung-Angebot leistungsstarke Ansätze für den Einfluss der Nerven auf normalen und erkrankten Haut studieren. Mit zunehmender Erfahrung können diese Verfahren durchgeführt werden routinemäßig und zuverlässig, während verursachen minimale Qualen des Tieres-oder des Prüfers.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
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