Protocol
이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 실험 동물 의학에 대한 미시간 단위의 대학 설립 규정에 따라 수행되었다.
1. 마우스의 유전자 재조합을 유도
참고 : Gli1 TM3 (CRE / ERT2) ALJ / J 마우스 변형 (Gli1-CreERT2) (13)는 상피를 TD하기 위해 타목시펜에 의한 유전자 재조합의 대상으로 할 수 있습니다. Gli1를 생성하는 B6.129S4-GT는 (ROSA) 26Sor tm1Sor / J 기자 마우스 (LacZ를) (22)이 변형 크로스, LacZ를 동물 전체 마운트 아래 염색에 의해 TD 세포를 시각화 할 수 있습니다.
- 옥수수 유 12.5 ㎎ / ㎖의 농도로 타목시펜 용액을 준비한다.
- 1.5 ML 튜브에서 결정 타목시펜의 20 ㎎, 옥수수 기름을 1 ml의까지 추가 할 수 있습니다. 타목시펜이 완전히 (2-4 시간)에 용해 될 때까지 단단히 같이 와류 믹서에 튜브 및 RT에서 가장 높은 설정에서 지속적으로 소용돌이를 테이프타목시펜 미립자의 부재에 대한 해부 현미경 튜브를 조사하여 확인 하였다.
- 15 ㎖의 튜브에 용액을 옮기고 추가의 옥수수 오일 용액 12.5 밀리그램 / 최종 농도로 희석 타목시펜. 추가로 30 초 동안 점성 용액을 볼 텍싱하여 혼합한다. 어둠 속에서 4 ° C에서 최대 1 주일이 솔루션을 저장합니다.
- Gli1로 복강 타목시펜 용액을 주입, LacZ를 쥐, 마우스 체중 20g 당 200 ㎕의 부피로, 20g 마우스 체중 당 2.5 밀리그램의 유효 타목시펜 복용량.
2. 수확 피부 생검
참고 : 타목시펜 유도 후 주에 실험에 따라 수확 피부 생검 몇 일. 모든 수술를 들어, 멸균 장갑을 사용하여 수술 용 마스크 또는 머리 그물을 착용하고, 절차를 수행하는 동안 무균 수술 드레이프와 동물을 다루는 포함 설치류 수술을위한 표준 프로토콜을 따르십시오.
- 물에 90 ㎎ / ㎖ 케타민 6.5 ㎎ / ㎖ 자일 라진을 혼합하여 10 배 스톡 마취 솔루션을 준비합니다. 그냥 사용하기 전에 멸균 PBS로이 원액 1:10 희석하고, 최대 8 개월 동안 어둠 속에서 실온에서 보관하십시오.
- 또는, 완전 동물을 마취 산소와 4 %의 가스 농도를 시작으로 이소 플루 란 흡입에 의해 마우스를 마취하고 후속 절차 기간 동안 1 ~ 2 %이 저하.
- 20g의 마우스 체중 당 200 μL의 용량으로 복강 내 마취 용액을 주입한다. 동물이 발가락 핀치 분석에 의한 진정 작용의 적절한면에 도달 한 것을 확인하고, 그 마음을 확인하고 호흡 속도는 (각각 약 600 비트와 분당 160 호흡) 정상입니다.
- , 지느러미 다시 피부에 생검의 사이트에서 머리를 제거하지 닉에주의하면서 또는 기본 피부를 손상 전기 클리퍼를 사용합니다.
- 면도를 닦아 수술 부위를 준비Betadine과 알코올 잎사귀를 사용하여 전방 대 후방 방향으로 D 영역. 모든 머리를 잘라낸 사이트에서 제거해야합니다.
- , 검은 색 마커를 사용하여 조직 검사 사이트 개요 무균 수술 영역에서 온난화 패드에 동물을 배치하고, 무균 수술 드레이프와 커버 (데모 목적을 위해, 무균 드레이프는 가시성을 높이기 위해 생략).
참고 : 모낭의 길이 방향의 부분을 얻기 위해 생검의 긴 가장자리에, 전방 - 후방 방향으로 parasagital를 (모낭의 방향에 평행)을 실행해야합니다 (가장자리가 ~ 1cm가, 조직학에 대한 구분한다) 지느러미 중간 선 (그림 1A). - 기본 근육의 근막을 손상시키지 않고 표시된 지역에 따라 전체 두께 절제술을 만들기 위해 멸균 # 11 메스를 사용합니다.
참고 : 적출 피부 조직은 표피, 진피, 피하 지방과 panniculus의 카르노 서스를 포함한다. 출혈은 일반적으로 최소이다. - t을 평평그는 마른 종이 타월에 피부 샘플을 적출, 진피, 아래로 옆 초과 종이 타월을 멀리 트림 및 기타 샘플을 수집해야 할 경우 최대 1 시간 동안 차가운 PBS에서 샘플을 저장합니다. 준비가되면 조직 검사를위한 샘플, 또는 전체 마운트 β - 갈 락토시다 제 (LacZ를) 염색을위한 4 단계를 처리하는 단계 3.1 또는 3.2로 진행합니다.
- 봉합사는 약 3mm 이격 간단한 인터럽트 패턴에 6-0 나일론 봉합사를 사용하는 생검 부위를 닫는다.
- 전체 복구 후까지 다른 동물과 같은 케이지에 수술을받은 쥐를 반환하지 않습니다.
- 수술 영역은 일반적으로 일주일 내, 치유 될 때까지 그들은 매일 또한 의식을 되 찾을 때까지 즉시 수술 후 동물을 모니터링합니다. 마우스는 통증이나 고통의 흔적을 나타내는 경우 지정 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 진통제를 사용합니다. 수술 후 7 ~ 10 일이 봉합사를 제거합니다.
주 : 필요한 경우, (50 ㎎ / ㎖ 스톡 오디오 솔루션 카프로 펜 희석하여 용액을 제조 진통이온) 1 : 멸균 100. 20g 체중 당 200 μL (5 ㎎ / ㎏의 마우스 체중)의 투여 량으로, 목 목덜미 근처 견갑골 사이의 용액을 피하 주사.
조직학 3. 프로세스 샘플
해결하려면 및 적출 조직을 처리, 응용 프로그램에 따라 아래의 방법 중 하나를 사용합니다.
- 파라핀 조직 학적 샘플을 생성하려면 최대 2 주 동안 70 % 에탄올에서 RT에서 PBS O / N에서 3.7 % 포르말린에 피부와 저장소를 수정합니다. 파라핀에 삽입하기 전에 종이 타월을 제거합니다.
- 냉동 조직 학적 샘플을 생성하기 위해, PBS 차가운 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직 잠수함 천천히 1 시간 동안 흔들어. 솔루션을 제거하고 PBS 3 변화, 약 5 분 각각에 샘플을 씻는다. 다음으로, ( "크로스 침몰") 조직을 cryoprotect하는 PBS 30 % 수크로오스에서 샘플 잠수함.
- 4 ° C에서 부드럽게 흔들어 O / N로 품어. 다음 날, 종이 견인을 제거EL은 피부의 진피 측으로부터 과량의 지방 조직을 잘라 내고. 직접 10월에 조직을 포함하고 -80 ° C에서 냉동 블록을 저장합니다.
참고 : 이전에 5,19을 설명한대로 절편 한 후, 파라핀 또는 냉동 샘플 중 하나는, TDs를, 메르켈 세포 각각 케라틴 17, 각질 8 신경 미세 섬유,에 대한 항체를 사용하여 신경을 식별하기 위해 면역 조직 화학 염색으로 염색 할 수 있습니다.
전체 마운트 LacZ를 염색 4. 시각화 샘플
- X-여자의 염색 액을 준비합니다.
- 멸균 수 250 mL에 0.94 g의 인산 나트륨 일 염기, 2.6 g 인산 나트륨을 결합한다. 7.3의 pH를 조정합니다. 여기에, 1 M 염화 마그네슘 0.5 ㎖, 페로 시안화 칼륨 0.528 g의 칼륨 페리시 아나이드의 0.412 g을 추가한다. 옥틸 - 폴리에틸렌 글리콜 250 μL 및 데 옥시 콜레이트 125 mg을 추가합니다. 염기 용액을 어둠 속에서 최대 6 개월 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
- 50 배 재고 X-여자의 soluti 준비50 ㎎ / ㎖ 솔루션을 생성하기 위해 X-여자의 재고 병에 디메틸 포름 아미드를 추가하여합니다. 어둠 속에서 -20 ° C에서이 솔루션을 저장합니다.
- 염색 솔루션을 생성하기 위해 X-여자 기반 솔루션에 재고의 X-여자 솔루션 1:50 희석 사용하기 직전에. 작은 생검 (<1cm 2), 샘플 당 염색 액의 나누어지는 1-2 ml의하십시오.
- 부드럽게 진탕 얼음 30 분 동안 차가운 PBS로 2 % 파라 포름 알데히드 / 0.2 % 글루 타르 알데히드를 함유하는 용액의 단계 2.7에서 수집 된 피부 샘플을 고정한다. 작은 생검 (<1cm 2)의 경우, 샘플 당 정착액 솔루션의 1-2 ml를 사용합니다.
참고 : 또는 만 2-4% 파라 포름 알데히드에 샘플을 수정, 또는 0.5 % 글루 타르 알데히드에서만. 최적의 정착 조건은 조직 LacZ를 발현 및 응용 정도에 의존한다. - 정착액 솔루션을 제거하고 실온에서 진탕에 PBS의 3 변경, 5 분마다로 샘플을 씻어.
- 샘플 아래에 종이 타월을 제거하고 exces를 절단무딘 집게로 지방을 파지 및 해부 가위 트리밍에 의해 피부의 진피 측면에서 지방 조직을이야.
- X-여자의 염색 액의 샘플 잠수함, 37 ° CO / N에 품어. LacZ를 발현은 해부 현미경 (그림 1B)에서 파란색 얼룩으로 표시됩니다.
주 : 신호 강도가 약한 경우에는 염색 액 다음날 교체 및 O / N 항온 처리를 반복한다. 백그라운드 염색이 너무 강한 경우에는, 염색의 시간을 줄이거 나, C ° 37 RT에서 샘플을 부화 대신. - 염색 액을 제거하고 PBS 부드럽게 RT 진탕, 약 5 분 동안 3 % DMSO를 포함하는 3 변경에 샘플을 씻는다.
- 5 분 각 70 % 에탄올 2-3 변화 워시 샘플. 70 % 에탄올에 보관 샘플.
5. 수술 탈 신경
- 단계 2.2에서와 같이 동물을 마취하고 전체 등쪽 피부를 면도.
- 수술 영역 (을)를 준비Betadine 및 알코올 잎사귀 및 무균 수술 드레이프와 동물 다루 사용하여 다시 피부 F (데모 목적을 멸균 드레이프는 가시성을 높이기 위해 생략). 무균 수술 영역에서 작동하는 동안 가열 패드를 사용하여 동물을 따뜻하게 유지.
- 꼬리 위의 약 0.5 cm에 목 기지에서 지느러미 중간 선을 따라 멸균 # 11 메스를 사용하여 절개를합니다.
- 무딘 집게를 사용하여 부드럽게 단지 뒷다리 위에서 목 근처 견갑골 지방 패드의 하부 조직을 시각화 떨어진 측면에서 좌측 피부를 반영한다.
참고 : 지느러미 피부 신경 (그림 2) 날카로운 굴곡을 피부 아래에 느슨한 결합 조직에 들어가기 전에 트렁크 벽의 반투명 밴드를 통해 꼬리 쪽 여행으로 흰색 가닥 나타납니다. - 해부 현미경 하에서 광 초미립자 집게를 사용하여 애니 왼쪽에서 독점적 신경 제거어디에서 따 버릴에 의해 해부학 사이트 T3-12에 위치한 리터 피부에 입국 사이트에 트렁크 벽 세그먼트 벤드 (그림 2).
- 동양 집게 수직 및 스트레칭과 주변 조직 (- E 그림 2C)에서 분리 신경을 일으키는 원인이 자신의 굴곡 사이트 아래 약 0.5 cm를 잡고 위쪽으로 잡아 당겨 신경을 제거합니다. 인접한 혈관을 파열 않도록주의하십시오.
- 피부에 트렁크 벽으로부터 연장 모든 신경이 제거 될 때까지 계속합니다. 트렁크 벽의 밀도 밴드 내에서 신경을 방해하지 마십시오. 주기적 멸균 0.9 % 식염수 용액의 방울을 적용하여 절차 내내 습윤 티슈 유지.
- 또한, 집게와 트렁크 벽 근처에 자신의 근위 끝을 잡고 미세 가위로 자르는 것은에 의해 신경을 제거합니다. 그 후, 피부에 가까운 말단부를 절단 (도 2F - H). 마지막으로, INT를 제거ervening 신경 세그먼트 (그림 2I).
- 단계 5.4에 노출 된 피부 플랩에서 모든 신경을 제거합니다. 이 섬유는 등쪽 피부 신경의 말단 가지를 포함하고, 피부 플랩의 피부 측 (도 2J - K)에 결합 조직 내에서 산발적으로 위치한 흰색 분기 가닥으로 나타납니다.
- 이 좋은 지점을 제거하려면 미세 집게이 약은 피부 표면에 평행 신경을 파악하고 혈관을 방해하고 피부를 천공 방지하기 위해 위쪽으로 뽑아 놓습니다. 보이는 모든 신경이 제거 될 때까지 계속합니다.
- 무딘 절개를 사용 등쪽 정중선 절개 오른쪽의 피부를 반영하지만, 신경 제거되지 않는다. 이 반대측 가짜로 작동하는 제어 될 것입니다.
- 간단한 중단 패턴에서 지느러미 중간 선을 따라 봉합은 절개를 닫습니다. 복구 및 사후 운영자 동안 동물을 모니터링atively로 이전 (단계 2.8-10) 보여 주었다. 수술 후 7 ~ 10 일이 봉합사를 제거합니다.
- 기능적으로 수술 후 몇 주 안정 탈 신경을 위로 평가하기 위해, 전기 클리퍼를 사용하는 등의 피부에서 머리를 제거합니다.
- 부드럽게 피하 주사 바늘을 사용하여 denervated 피부 영역을 찌를하고, 동물이 일반적으로 몸서리 또는 머리를 돌려, 응답 여부를 확인합니다. 피부 영역이 안정적 denervated 된 경우, 동물은 거의 또는 전혀 반응을 나타낼 것이다.
- 검정색 마커를 사용하여, 반응의 영역뿐만 아니라, 반대측 모의 측 유사한 크기 및 위치의 영역을 설명합니다.
- 단계 분석을위한 2.1-2.9에서 이러한 사이트에서 조직 검사를 수집합니다.
참고 : 또는 denervated 및 가짜로 작동하는 지역을 포함한 전체 지느러미 다시 피부를, 4 단계에 설명 된대로 유사한 전체 마운트 염색에 대한 한 장으로 제거 할 수 있습니다.
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Representative Results
생성 타목시펜 - 유도 Gli1 CreERT2 - 발현 생쥐와 LacZ를 리포터 대립함으로써, TD 상피를 시각화하고 시간이 지남에 따라 이들 세포의 운명을 추적 할 수있다. 전체 탈 신경 절차는 통상적으로, 마우스 당 1 시간 내에 완료 될 수 있고, 동물에게 최소의 고통을 야기한다.
5,19 - 우리의 이전 연구는 신경이 정상 TDs를뿐만 아니라 관련 각질 8 + 메르켈 세포 (C도 3a)을 모두 유지하기위한 중요한 것을 나타낼. 신경도 TD (그림 3D)에 Gli1 식을 촉진하기위한 중요하다. 피부 (그림 1B)에 걸쳐 TD 클러스터의 비교적 드문 모양을 감안할 때, 그것은 정확하게 TD 주파수를 정량하기 위해 여러 동결 절편을 샘플링하는 것이 필수적이다. 일반적으로, 우리는 15이 아닌 단점을 평가각 동물에서 모두 가짜 및 denervated 피부에서 (각 10 μm의 두께와 ~ 1cm 길이) ecutive 섹션. TD를시 피부에 걸쳐있는 다음 탈 신경 신경 안정 손실은 앞서 고정 된 파라핀 섹션 (도 3a 및도 3c에서 이러한 신경 미세 섬유와 같은 표준 팬 신경 마커에 대한 면역 조직 화학 염색의 부재에 의해 확인 될 수 있고, 보고 5). 대안 적으로, 신경도-β3 또는 튜 불린 PGP9.5 6,9- 발현에 의해 확인할 수있다.
Gli1 사용함으로써, LacZ를 쥐, 상기 TD에서 헤지 호그 신호를 활성화 및 타목시펜 - 유도 재결합 탈 신경의 순서를 변경함으로써 TD 세포의 운명을 유지하는 신경에 대한 요구를 모두 확인 가능하다. 탈 신경 전에 재결합이 수행되면, 예를 들면, 이는 헤지 호그 pathwa을 활성화하는 신경에 대한 요구를 테스트 할Y,이 동물에서 Gli1 식으로 상관 관계가 Cre 호텔의 재조합 효소의 활동 수준에 의해 모니터링으로. 탈 신경은 재결합 후에 행하면 한편,이 TD 이미 표지 된 세포를 유지하는 신경에 대한 요구 사항을 평가할 것이다.
그림 1. 피부 생검 및 TD 상피의 전체 마운트 LacZ를 염색. (A) 생검 후 마우스 (위) 사진 및 봉합하기 전에. (하단 왼쪽) 생검 사이트의 확대 이미지입니다. (오른쪽 아래) 피부 샘플은 건조 종이 타월에 평평하게 확산의 진피면 조직 검사에서 얻은. (B)는 Gli1에서 피부 전체 마운트 LacZ를 염색, LacZ를 마우스 7 일 타목시펜 유도 후는 피부의 시각화를 개선하기 위해 생검 직전를 면도. Gli1는 + / LacZ를 + TDs를이 강렬한 푸른 클러스터로 표시됩니다.스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 지느러미 피부를 denervating에 대한 두 가지 접근 방법. 신경 지배 마우스 피부 (A) 만화도. 빨간 점선은 트렁크 벽 (보라색)과 반사 피부 아래 진피 (회색, 별표)에 기본이되는 근육을 노출 지느러미 중간 선을 따라 만든 하나의 절제를 나타냅니다. 그들은 (검은 색 화살표가 하나의 굴곡을 나타냅니다) 트렁크 벽을 떠날 꼬리 쪽 여행 피부 신경은 "밴드"로 표시 지느러미. 신경 세그먼트는 검은 색 점선으로 경계가되는 절제한다. 표시 (화살표)를 절곡 부위와 손상 신경의 (B)의 사진. 파란색 화살표는 REM 수면이 될 것이 신경 세그먼트를 가리oved. 탈 신경 기법을 보여주는 - (C D) 사진. 굽힘 및 바깥쪽으로 당겨 자신의 사이트 아래에있는 신경을 그립, 0.5 cm를 초 미세 집게를 사용. (E)이 신경 세그먼트 (파란색 화살표)을 제거한 후, 체강을 보여주는 사진. 나머지 신경도 제거해야합니다. (F - 나는) 신경이 자신의 근위부에 냈다 곳 신경 제거를위한 다른 방법이 묘사되어 그냥 아래 끝 어디 벤드 (화살촉) (G), 또한 원심으로, 피부에 항목의 사이트에 가까운 (화살촉) (H). 이러한 이미지의 중간 선 절개가 더 나은 시각화의 목적에 대한 일반적인 이상 있음을 유의하십시오. 정중선의 일측에 반사 피변의 피부 측 (J)의 사진. (K) 신경은 빨간색으로 표시 큰 혈관으로, (검은 선) 설명되어 있습니다. 스키의 진피 측에 위치 신경n 개의 플랩은 절제해야합니다. 별표, 반사 된 피부 플랩에서 진피를 기본. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
신경과 탈 신경 후의 TDS 악화 그림 3. 안정 손실. (A) 면역이 가짜로 작동하는 피부 각질 8 + 메르켈 세포 (녹색 K8)과 신경 미세 섬유 + 신경 (NF, 빨간색)와 TD 상피을 표시합니다. (B) TD 녹색에서 보라색, 메르켈 세포에서 강조 상피, 청색의 감각 신경 만화 묘사. TD를 지역 내에서 메르켈 세포 신경 돌기 단지가없는 (C) 면역 보여주는 denervated 피부 (덴). 점선 노란색 라인, 모낭 상피. 별표, backgroun입니다D 염색. (D) Gli1 LacZ를에서 전체 마운트 LacZ를 백 등의 염색 피부 / + 마우스 이주 일방적 피부 탈 신경 후. 치유 정중선 절개 (화살표)의 왼쪽에있는 상자에 풍부한 표시 TD의 상피 세포가 가짜로 작동하는 피부에서 관찰된다. 정중선의 오른쪽에, TDs를가 denervated 피부에 표시되지 않습니다. (A), (C)에 대한 눈금 막대 = 10 μm의; 및 (D) 1 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
신경은 감각에서뿐만 아니라 포유류의 장기 개발, 유지 보수 및 재생 13,24-27에서뿐만 아니라 중요한 기능을 제공합니다. 신경 최근 다양한 피부 질환에 연루되어있는 바와 같이, 여기에 설명 된 기술은 동물 질병 모델의 다양한 신경 분포에 대한 요구 사항을 연구하는데 사용될 수있다. 사실, 일방적 탈 신경 기술은 동일한 마우스에서 손상 또는 파괴 신경 중 하나와 피부의 직접적인 비교를 할 수 있습니다. 후속 데이터가 짝 t 검정을 활용하여 분석이 동물 대 동물 차이를 보상하기 위해 이상적인 내부 제어를 제공한다.
여기에 설명 된 절차를 크게 LacZ를 리포터 유전자를 이용할 수 있지만, 이러한 실험은 Gli1-CreERT2 대립 유전자는 TD에서 유전자 발현을 변경하기 위해 다른 형광 리포터 또는 조건부 대립 유전자와 결합되도록 구성 될 수있다. 예를 들면 Gli1-CreERT2 생쥐 교차 할 수있다타목시펜 유도 오 후 TD-유도 된 종양을 형성 쥐를 생성 Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) (28)의 조건부 대립 유전자를 품고 동물. Gli1-CreERT2 균주는 물리적 TD 13에서와 분리 Gli1 + 모낭 줄기 세포의 서브 세트에서의 재결합을 유도하는 것이 중요하다.
탈 신경 후, 피부 신경은 몇 달 (그림 3C) 5,19에 대한 안정적 절제된 남아있다. 다른 연구에서, 그러나, 어떤 재 신경 분포가 6 시간에 걸쳐 발생하는 것으로보고되고있다. 그 피부의 진피층에 삽입 위치에 근접한 시점에 흉벽에서 자신의 출구 사이 신경 부분을 절제하는 것이 절대적으로 중요하다 같이 denervated 표현형의 perdurance은 신경 제거의 완전성에 의존 할 수있다.
완전히 removi이전 조직 검사로 피부에서 머리를 ng를하면 이후 전체 마운트 염색 (그림 1B)로 TDS 파일을 시각화 할 수있는 능력을 향상시킬 수 있습니다. 이 2 분 동안 클리핑 피부에 제모 크림을 적용하고 면봉을 사용하여 전방 대 후방 방향으로 떨어져 머리를 닦아하여 수행됩니다. 그 탈모는 성장기 성장 단계 진입을 촉진하여 머리 사이클 반응 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 대안 적으로, 모발이 완전히 면도날을 사용하여 제거 할 수있다. 또한, 이전에 전체 23 설명한 바와 같이 면역 조직이 진피로부터 분리 상피 시트에 TDs를하고 메르켈 세포를 시각화하기 위해 수행 될 수있는 탑재.
가능성은 수술 탈 신경이 잠재적으로 관찰 된 표현형을 교란, 수술 부위에 염증을 일으킬 수 있다는 것을 남아있다. 담보 조직 손상이 SK에서 발생하기 때문에 우리의 경험에서 우리는 가능성이 탈 신경 후 상당한 염증을 관찰하지 않은절차가 제대로 수행되는 경우에 약간입니다. 염증의 결과에 영향을 줄 수있는 가능성을 최소화하기 위해, 추가 제어는 실험에 혼입 될 수있다. 예를 들어, 우리는 탈 신경 구체적으로 TD-유도 된 종양을 억제 아니라 인접 헤어 TD를 5에서 그 탈 신경-아닌 일반 상처에 의한 염증 반응-가능성이 억제 종양을 주장 같은 피부 샘플에서 병변을 뿌리 관련된 것을 관찰했다.
수술 탈 신경은 감각 및 교감 신경 섬유 (5)를 포함한 모든 피부 신경을 절제한다주의하는 것이 중요하다, 따라서 두 정상 또는 병에 걸린 피부에 이러한 신경의 영향에 대한 일반적인 전반적인 평가를 제공합니다. 이러한 에이전트는 역행 억제 불분명하지만 이러한 보툴리눔 신경 독소로 pharmacologics를 사용하여 예를 들어 다른 실험 방법은, 더 자세한 기계론의 통찰력 (7)를 얻을 수 있으며, 신경 전달을 차단하는이러한 고슴도치 리간드와 같은 사이토 카인의 분비. 대안 적으로, 6-hydroxydopamine 같은 화합물은 피부 9 교감 신경 브레이션 사용되고있다. 또, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드와 물질 P 등의 신경 유도 인자 수용체를 표적으로하는 것은 그 틈새 (6) 내에서 신경 주변 세포 간의 상호 작용을 특정 질의에 유용 할 수있다. 결국 여러 전략이 식별하는 조합에서 이용 될 수 있고, 또는 적어도 잠재적 인 시그널링 메커니즘을 배제.
마지막으로, 신경과 틈새 (19) 사이에 교환되는 신호를 해명하기위한 황금 표준을 나타낼 수 Wnt1-Cre 호텔 또는 Advillin-Cre 호텔을 사용하여 신경 계통에 신경 유래 인자의 유전 삭제를 대상으로. 이들 균주 모두는 타목시펜 - 유도 한, 그러나 일부주의 신경 발달 또는 적절한 TA를 손상하지 않는 이들 신호의 중단하도록주의해야신경 구 심성의 rgeting. 이러한 Advillin-CreERT2으로 타목시펜 유도 Cre 호텔의 사용은 이러한 문제 29 회피하는 데 도움이 될 수 있습니다.
전반적으로, 기술은 정상과 병에 걸린 피부에 신경의 영향을 공부 혈통 추적, 휴대 시각화 및 수술 탈 신경-제공하는 강력한 접근 여기-조합을 설명했다. 경험이 절차는 동물 또는 연구자에 고통을 최소화시키면서, 일상적으로 안정적으로 수행 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
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