Introduction
À l'heure actuelle plaçant des cellules isolées individuellement dans un espace de culture est généralement réalisée en utilisant une dilution limitante ou une cellule activé par fluorescence (FACS). Pour de nombreux laboratoires, ce qui limite la dilution est une méthode commode, car il nécessite seulement une pipette et des plaques de culture de tissus, qui sont facilement disponibles. Dans ce cas, la suspension cellulaire est diluée en série jusqu'à une densité cellulaire appropriée, et ensuite placée dans des puits de culture à l'aide d'une pipette manuelle. Ces cellules isolées compartimentés sont ensuite utilisés pour l' analyse de cellules, telles que l' hétérogénéité génétique de dépistage 1 et 2 , la formation de colonies. Cependant, cette méthode est faible débit et la main-d'œuvre, sans avoir recours à un bras de robot d'assistance, car la nature de la distribution de Poisson de la méthode de dilution limitante limite d' événements monocellulaires à une probabilité maximale de 37% 3. machines FACS avec un bras robotisé intégré peuvent surmonter la limitation de la distribution de Poisson par précision placment une seule cellule dans une culture bien à un moment 4. Cependant, la contrainte de cisaillement mécanique élevée (ainsi, réduit la viabilité cellulaire) 5 et à l' achat des machines et les coûts opérationnels ont limité son utilisation dans de nombreux laboratoires.
Pour surmonter les limitations ci - dessus, les dispositifs micrométriques ont été développés pour charger très efficacement des cellules individuelles dans des micropuits 6. Cependant, les micropuits ne fournissent pas suffisamment d'espace pour les cellules chargées de proliférer, en raison de la nécessité de rendre la taille de chaque micro-puits proche de celle d'une cellule unique pour maximiser la probabilité de chargement unicellulaire. Que des analyses de culture sont nécessaires dans de nombreuses applications basées sur des cellules (par exemple, le dosage clonogénique 7), les grands micropuits (90-650 um de diamètre ou une longueur latérale) ont également été utilisées pour permettre les cultures cellulaires étendus. Cependant, comme la méthode de dilution limite, ils possèdent également de faibles rendements cellule de chargement unique, allant de 10 -. 30% 89
Auparavant, nous avons développé une plate - forme microfluidique à haut débit pour isoler des cellules uniques dans des micropuits individuels et démontrer son application dans le dosage clonogénique des cellules isolées. 10 Le dispositif a été fait avec poly-diméthylsiloxane (PDMS), et comprend deux ensembles de réseaux de micropuits avec différentes tailles de micropuits, qui peut largement améliorer l'efficacité dans le chargement d'une seule cellule dans un micropuits dont la taille est beaucoup plus importante que la cellule. En particulier, ce concept de «double puits» permet à la taille de la zone de culture pour être ajustée de manière flexible sans affecter l'efficacité de capture de cellule unique, ce qui rend facile d'ajuster la conception du dispositif en fonction de différents types de cellules et d'applications. Cette méthode à haut rendement devrait être utile pour des expériences de culture cellulaire à long terme pour les études d'hétérogénéité cellulaire et monoclonal établissement de la lignée cellulaire.
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Protocol
Remarque: Les modèles de photomasques pour notre fabrication de dispositif microfluidique ont été établis à l'aide d'un ordinateur de conception assistée (CAO). Les dessins ont ensuite été utilisés pour fabriquer des photomasques chrome en utilisant un service commercial. Les dispositifs PDMS ont été réalisés en utilisant des techniques de lithographie douce 11.
1. Fabrication de Maître Moisissures par Lithography
- Avant le processus de photolithographie 12, en utilisant les pastilles de silicium de 4 pouces en tant que substrat et déshydrater les pastilles dans un four conventionnel à 120 ° C pendant 10 min.
- Nettoyer les plaquettes de silicium déshydratées en utilisant un traitement par plasma d'oxygène à 100 watts pendant 30 secondes dans un filtre à plasma.
- Préchauffer deux plaques de cuisson à 65 ° C et 95 ° C, respectivement, pour le processus de cuisson suivant.
- Coat 5 g de résine photosensible négative (PR) sur les tranches de silicium nettoyées par une tournette; centrifuger à 1200 tours par minute (SU-8 50) pendant 30 secondes pour produire la couche de microcanaux.
- Placer le RPplaquette revêtue sur une plaque de cuisson préchauffé à 65 ° C pendant 12 min et le transférer à une autre plaque de cuisson préchauffé à 95 ° C pendant 33 min (pour 100 um d'épaisseur des modèles) pour effectuer un processus de cuisson douce.
- Après la cuisson, placez le PR enduit plaquette de silicium sur le support d'un masque d'alignement semi-automatique et l'aligner à une transparence photomasque 25400 dpi de résolution.
- Exposer le PR revêtu de plaquette de silicium à la lumière UV (365 nm) à une dose de 500 mJ / cm2 pour créer le motif de la PR sur la plaquette de silicium.
- Retirer la plaquette de l'alignement et le placer sur une plaque chauffante pour la post-cuisson à 95 ° C pendant 12 min.
- Faire tremper les tranches de SU-8 développeur (acétate d'éther monométhylique du propylène glycol, PGMEA) solution pour laver PR non réticulés pendant 12 min et doucement à sec avec de l'azote gazeux pour exposer les marques d'alignement.
- Encore une fois, le manteau 5 g de résine photosensible négative sur les tranches par une tournette; centrifuger à 700 tours par minute (SU-8 100) pendant 30 secondes et 1 200 tours par minute (SU-8 10) pendant 30 s à 300 &# 181; m motif d'épaisseur et 27 um d'épaisseur modèle respectivement pour rendre la couche de micropuits.
- Placez la tranche revêtue PR sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 4 minutes et à 95 ° C pendant 8 min (pour 27 um couche de capture-puits profond); et à 65 ° C pendant 40 min et à 95 ° C pendant 110 min (pour 300 um couche culture-puits profond).
- Après refroidissement, placer le PR revêtu plaquette de silicium sur le masque d'alignement équipé d'une lumière UV.
- Exposer le PR enduit plaquette de silicium à la lumière UV (365 nm) à une dose de 250 mJ / cm 2 (27 um d' épaisseur modèle) et 700 mJ / cm 2 (pour 300 um d' épaisseur motif).
- Cuire les tranches à 95 ° C pendant 5 min (27 um de motif d'épaisseur) et 30 min (300 um d'épaisseur motif), respectivement.
- Laver le PR non réticulé par le PGMEA pendant 6 min (27 um de motif d'épaisseur) et 25 min (300 um d'épaisseur motif), respectivement, puis les sécher avec de l'azote gazeux.
- Mesurer la hauteur du modèle figure surla tranche avec un profilomètre laser de balayage en plaçant la tranche sur la platine XY d'un profilomètre laser de balayage.
- Ajuster le plan focal pour montrer clairement le modèle figure sur la plaquette en utilisant le "vue de la caméra" mode d'observation sous un objectif 20X.
- Changez le mode d'observation de la "vue de la caméra" à "vue laser", et définir les positions supérieures et inférieures des caractéristiques.
- Réglez le mode de mesure, la zone, la qualité et z-hauteur jusqu'à transparent (en haut), 1 ligne (1,024 x 1), de haute précision et 0,5 um, respectivement, puis appuyez sur le bas de départ pour commencer la mesure.
2. Préparation des dispositifs PDMS pour l'isolement cellulaire unique
- Avant PDMS coulée, silaniser les moules de maître avec trichlorosilane pour créer une surface hydrophobe, ce qui le rend plus facile à décoller les PDMS répliques des moules maîtres.
- Placer les moules de maître et un bateau de pondération contenant200 pi de trichlorosilane dans un dessiccateur, et appliquer le vide (-85 kPa) pendant 15 min.
- Arrêtez le vide, puis laisser les moules maîtres dans le dessiccateur à silaniser les moules maîtres à la température ambiante pendant au moins 1 h.
- Retirer les moules de maître du dessiccateur et placer chaque moule maître dans un plat de 10 cm de Pétri.
- Mélanger une quantité totale de kit de polymère PDMS 17,6 g contenant une base et un agent de durcissement à un ratio de 10: 1, puis verser le PDMS sur le moule maître dans la boîte de Pétri.
- Placez la boîte de Petri dans un dessiccateur et appliquer le vide (-85 kPa) pendant 1 heure pour éliminer les bulles d'air dans les PDMS.
- Retirer la boîte de Pétri du dessiccateur et le placer dans un four conventionnel à 65 ° C pendant 3-6 heures pour guérir les PDMS.
- Retirer les répliques PDMS guéri des moules maîtres et de punch deux trous comme une entrée et une sortie aux deux extrémités du microcanal sur la matrice PDMS réplique de capture-bien par un perforateur avec diamètre intérieur de 0.75 mm pour le canal fluidique (figure 2A).
- Utilisez du ruban adhésif pour nettoyer la surface des répliques PDMS, puis placer les répliques PDMS dans un nettoyeur à plasma pour un bref traitement par plasma d'oxygène (100 watts pour 14 sec).
- Retirer les répliques PDMS de la machine à plasma d'oxygène.
- Alignez un sommet (contenant les micropuits de capture) et un PDMS de fond (contenant les micropuits de culture) réplique à la main sous un stéréomicroscope et les mettre en contact.
- Placez les PDMS répliques alignés dans un four à 65 ° C pendant 24 heures pour obtenir une liaison permanente entre les PDMS répliques pour former le dispositif final.
- Faire tremper le dispositif PDMS dans un désionisée (DI) récipient rempli -eau et placez le récipient dans un dessiccateur sous vide (-85 kPa) pendant 15 minutes pour éliminer l'air du microcanaux du dispositif PDMS.
- Placer le dispositif de PDMS rempli d'eau DI dans une hotte de culture tissulaire et en utilisant une lumière UV (longueur d'onde de la lumière: 254 nm) pour la stérilisation du dispositif de 30 min.
- Remplacer l'eau DI dans le dispositif de PDMS avec une albumine de sérum bovin à 5% (BSA) dans une solution 1 x PBS et on incube à 37 ° C pendant 30 min pour empêcher les cellules de se coller à la surface du PDMS.
Remarque: Le revêtement BSA est essentiel pour améliorer l'efficacité du transfert de cellules isolées de la capture-bien à la culture puits. - Remplacer la solution de BSA à 5% dans le dispositif PDMS avec stérilisée solution PBS 1x.
3. Préparation de la suspension unicellulaire
- Culture de souches neurales KT98 des cellules et un carcinome humain cellules A549 et MDA-MB-435 nous en boîte de Petri dans l' incubateur de culture cellulaire classique (37 ° C, 5% CO 2 et 95% d' humidité) pour préparer des cellules pour l'essai de cellules de dispositif PDMS .
- Retirer et jeter le milieu de culture usé (milieu de base DMEM fourni avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% des antibiotiques) à partir de la boîte de culture avec des cellules cultivées à 70 - 80% de confluence.
- Lavez délicatement les cellules avec stérilisées PBS trois fois. </ Li>
- Retirer et jeter le PBS, et ajouter 2 ml d'un mélange d'enzyme recombinante avec protéolytiques, et les activités de DNase collagénolytique (s'il vous plaît voir la liste des matériaux pour les informations détaillées).
- Incuber la boîte de culture à la température ambiante pendant 5 min, puis appuyez sur la boîte de culture pour faciliter le détachement des cellules.
- Ajouter 4 ml de PBS stérile pour disperser les cellules, puis transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml.
- Centrifuger le tube à 300 g pendant 3 min et retirer le surnageant.
- Resuspendre doucement le culot cellulaire dans 1 ml stérilisées PBS et compter le nombre de cellules vivantes en utilisant la méthode d'exclusion au bleu Trypan norme 13.
Remarque: Cette étape de remise en suspension est critique pour la préparation bien dissociées suspension à cellule unique pour améliorer l'efficacité de l'isolement de cellules isolées.
4. Isolation simple cellule et Culture clonale
- Charge 50 pi de suspension cellulaire à une concentration de 2,2 à 2,5 x10
- Chargez encore 50 pl de suspension cellulaire à travers le trou d'entrée pour remplir uniformément jusqu'à l'ensemble microcanaux avec des cellules.
- Sceller le trou de sortie d'un bouchon (une ligne de 3 mm de long, 1 mm de diamètre en nylon coupe pêche) afin d'éviter l'écoulement induit par la pression hydrostatique des gouttelettes sur entrée et de sortie des trous.
Remarque: Les bouchons ont été stérilisée par UV à l'intérieur d'une culture hotte de tissu avant utilisation. - Remplir une seringue stérile de 1 ml de milieu de culture, éjecter les bulles d'air, et le mettre en place sur une pompe à seringue.
- Branchez le moyen chargé seringue à l'orifice d'entrée du dispositif PDMS via une aiguille émoussée G 23 et une poly-tétrafluoroéthène (PTFE) tube.
- Retirer le bouchon du trou de sortie et toutow un intervalle de temps de 2 minutes pour permettre aux cellules de se déposer dans les unicellulaires capture des puits par la force gravitationnelle.
- Laver les cellules avec 300 pl non captées de milieu de culture à une vitesse de 600 pi / min entraîné par la pompe de la seringue d'écoulement.
- Attendre pendant 2 minutes afin de stabiliser l'appareil, et sceller les orifices d'entrée et de sortie avec des bouchons pour former un système de culture fermé.
- Retournez le périphérique à la main pour transférer les cellules mono-capturées dans les puits de culture.
- Placez le dispositif PDMS dans une boîte de culture de tissu de 100 mm, et ajouter 10 ml de PBS stérilisé autour du dispositif pour éviter le milieu de culture évaporation de la microcanaux.
- Déplacer la boîte de culture à un incubateur classique de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO 2 et 95% d' humidité) pour la culture clonale des cellules unique.
5. Culture moyenne reconstitution
- Après 1 d de la culture, remplacer le milieu de culture dans le dispositif PDMS avec du milieu frais pour améliorer pr cellulaireoliferation.
- Placer deux gouttes de milieu de culture au-dessus du dispositif PDMS à proximité des zones d'entrée et de sortie des trous pour éviter l'introduction de bulles d'air dans le micro-canal tout en effectuant l'étape suivante.
- Poinçonner deux trous de la partie supérieure du dispositif PDMS à proximité des deux extrémités du microcanal comme une entrée et une sortie pour le microcanal.
Note: Ne pas perforer la totalité des deux couches du dispositif de PDMS; à la place, il suffit de percer à travers la couche supérieure du PDMS. - Connecter une seringue en plastique de 1 ml contenant du milieu frais à l'entrée par l'intermédiaire d'une aiguille émoussée G 23 et PTFE tube.
- Débit moyen 120 pi frais dans l'appareil pendant 5 minutes pour remplacer l'ancien milieu.
- Insérez deux bouchons pour sceller l'entrée et de sortie des trous, et renvoyer l'appareil à l'incubateur de culture cellulaire.
- Rafraîchir le milieu de culture tous les 2 j au cours de la période de culture en enlevant les bouchons d'étanchéité, puis en répétant les étapes 05/04 à 05/05.
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Representative Results
La plate - forme microfluidique pour l' isolement et la culture de cellules isolées comprend un micro - canal (200 um de hauteur) avec deux ensembles de matrices de micro - puits (figure 2A). Les deux ensembles de réseaux de micropuits sont appelés comme la capture de puits (25 m de diamètre et 27 um de profondeur) et de la culture puits (285 m de diamètre et de 300 um de profondeur) pour l'isolement de cellules isolées et de la culture, respectivement, et chaque capture-puits est placé au centre d'une culture bien vu de la vue de dessus (figure 2B). Pour le fonctionnement de l' appareil (le flux de fonctionnement schématique est illustrée à la figure 1), l'équipement nécessaire (pompe à seringue, culture de tissu incubateur, et microscopes) et des fournitures (seringue, une pipette, et tubes) sont généralement disponibles dans les laboratoires biologiques. En outre, la portabilité et la transparence de la plate-forme a permis aux cellules d'être facilement observées et analysées dans un dispositif avec une convenMicroscope tionnel au cours de l'expérience de culture cellulaire.
L'efficacité de la capture des cellules dans les puits après capture les plages étape de lavage de 67,80 ± 11,38 ± 85,16% à 1,91% (selon le type cellulaire) (figure 3A). En outre, la plupart des captures puits contiennent seulement une seule cellule pour les trois types de cellules (89,89% de - 92,98%), qui a été confirmé par l' analyse du nombre de cellules chargées dans la culture des puits (figure 3B). L'efficacité de l'isolement unicellulaire finale dans la culture des puits était de plus de 76% pour KT98 et MDA-MB-435 cellules, mais seulement 61% pour les cellules A549 en raison des différences de taille des cellules entre les types cellulaires testés.
Pour la recherche sur le cancer, le dosage clonogénique des cellules individuelles peut être utilisé pour tester la résistance aux médicaments et les taux de colonies individuelles de cellules de prolifération. La culture cellulaire et le dosage clonogénique des cellules uniques isolées dans notre platform ont été effectuées en actualisant le milieu de culture tous les 2 jours. Cette démonstration met en évidence l'application de ce dispositif pour l'étude de l'hétérogénéité cellulaire au niveau d'une seule cellule en mesurant les différences dans la survie des cellules et des taux de cellules individuelles de prolifération.
L'hétérogénéité et la prolifération cellulaire taux des cellules isolées ont été analysées à partir d'images acquises par jour. Les résultats ont montré que les cellules uniques isolées ont pu être mises en culture pendant 7 jours et ont présenté différents modèles de croissance. Par exemple, 13% des cellules isolées avait pas de division cellulaire et est resté comme une seule cellule (figure 4B), tandis que 17,5% des cellules divisées en plus de 15 cellules et colonies de cellules formées (figure 4A) au cours de la culture. hétérogénéité cellulaire chez les cellules en prolifération a également été mis en évidence par leurs modes de former deux cellules (4,3%), les trois cellules (2,5%) et de 4 - 14 croissance différentes cellules(15%) dans l'expérience de culture cellulaire (figure 4C).
Ces résultats indiquent que la plate-forme peut être utilisée pour la culture cellulaire à long terme, les dosages clonogéniques et des études d'hétérogénéité cellulaire. Ayant un grand nombre de colonies de cellules individuelles cultivées dans une petite zone d'empreinte permet également une analyse microscopique des cellules plus facile.
. Figure 1. Représentation schématique de l' écoulement de l' opération pour l' isolement de cellules uniques à haut débit et de la culture dans la plate - forme microfluidique La procédure de fonctionnement pour l' isolement de cellules isolées et de la culture clonale comprend 4 étapes: i) des cellules de charge dans le microcanal par un embout en plastique et pipette manuelle; ii) laver les cellules non captées avec un milieu de culture frais entraînée par une pompe seringue; iii) après le scellement des ouvertures d'entrée et de sortie avec des bouchons, est lecellules olated ont été transférés de capture-puits à la culture des puits en retournant le dispositif; et iv) effectuer la culture clonale (dosage clonogénique) dans la culture des puits. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Photo et images MEB de la plate - forme d'isolement et de culture de cellules isolées microfluidique. (A) de la plate - forme microfluidique chargé avec un colorant rouge qui montre les microcanaux et micropuits structures pour la culture de cellules isolées. (B) Une image représentative tirée d'un dispositif de coupe, montrant la vue latérale de trois isolement et la culture clonale unités mono-cellulaires dans la plate - forme microfluidique. Barre d'échelle: 100 um. Images MEB de la culture une seule cellule (C) et la capture (D S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. KT98, A549, et MDA-MB-435 à cellule unique efficacité d'isolement dans la plate - forme microfluidique. (A) Efficacité des KT98, A549, et MDA-MB-435 cellules capturées dans la capture des puits après lavage loin des cellules non captées . L'efficacité de capture des cellules était de 67,80% à 85,16% sur les trois types de cellules. (B) Le rapport unicellulaire total culture-puits (barre oblique) était plus de 76% pour KT98 et MDA-MB-435, mais 61,63% pour les A549. (C) Une image représentative de cellules mono-KT98 individuelle(Rouge, taché de suivi cellulaire) isolé dans les grandes cultures puits pour la culture clonale. Barre d'échelle: 300 um. (D) nombre de cellules dans la cellule occupée culture des puits du modèle cellulaire KT98. Le rapport de la culture des puits était de 77,3% avec une seule cellule, 16,31% sans cellules, 5,96% avec deux cellules, et 0,43% de plus de trois cellules. Les barres d'erreur sont représentés comme ± SD. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Culture cellulaire, essai clonogénique, et l' étude de l' hétérogénéité cellulaire des cellules A549 isolées dans la plate - forme microfluidique pour 7 d. (A) Une seule cellule isolée a grandi et ont proliféré à une colonie de cellules en culture bien. (B) Une seule cellule isolée a survécu, mais n'a pas divisé, après 7 joursde la culture. Barre d'échelle: 100 um. (C) Les cellules-simples isolées présentaient des modèles de croissance hétérogènes après avoir été cultivées pendant 7 jours. Les barres d'erreur sont représentés comme ± SD. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Systèmes de dispositifs à base de micropuits-6,14 ont été utilisés pour la manipulation de cellules isolées et de l' analyse, comme à grande échelle cellule unique piégeage 6 et souches hématopoïétiques seule la prolifération des cellules 15. Bien que la taille bien, le nombre et la forme peut être ajustée pour des applications spécifiques, l'efficacité de l' isolement à cellule unique est toujours compromise lorsque la taille du puits est augmentée. 9,15
Pour contourner cette limitation, Park et al. A rapporté une puce microfluidique avec micropuits triangulaires qui ont un piégeage unicellulaire taux élevé (58,34%), tandis que la taille de micropuits est agrandie pour permettre l' étalement cellulaire et la croissance. Cependant, les micro - puits (avec la longueur d'un côté ~ 50 um) ne pouvaient supporter la prolifération des cellules pendant jusqu'à 2 jours. 16 Notre stratégie de double puits permet le chargement monocellulaire dans de grandes micropuits ne soit pas limitée par la probabilité de Poisson la distribution a rencontré dans la limitation de diluméthodes de tion et de systèmes de puits ouverts 3, comme le démontre en fournissant une haute efficacité à cellule unique isolement (plus de 75%) dans les grandes micropuits dont la taille était suffisante pour la prolifération des cellules pendant au moins 7 jours (figure 4A). En raison de sa capacité à exécuter très efficacement l' isolement de cellules isolées et de la culture clonale avec un dispositif simple et procédure de fonctionnement, nous prévoyons que notre plate - forme microfluidique pourrait constituer un outil utile pour un large éventail d'applications, y compris les tiges de cancer sélection de cellules par dosage clonogénique 17 et à haut débit cardiotoxicité criblage de médicaments 18,19.
Une limitation majeure de notre seule cellule d'isolement et de culture plate-forme est qu'il ne fait pas la culture des puits fermés individuellement pour éviter la diaphonie entre les cellules cultivées dans la culture des puits. Par conséquent, le comportement des cellules peut être affectée par la sécrétion paracrine d'autres cellules uniques isolées dans le dispositif microfluidique. Le otsa limitation de notre plate-forme est la nécessité de préparer relativement suspension de cellules à haute densité pour une haute efficacité isolement cellule unique. Cette consommation élevée de cellules peut limiter les applications d'isolement cellulaire rare et la culture, telles que les cellules de l'humeur aqueuse.
Avant l'opération de l'appareil, il est important d'injecter de l'eau DI à partir du trou d'entrée pour remplir le microcanal et observer attentivement toute fuite de fluide à partir du dispositif PDMS lié. Fuite de liquide affecte l'état de l'écoulement dans le microcanal ainsi pourrait nuire à la capture de cellules et les résultats de transfert. En outre, bien que nos résultats de l'étude unicellulaire efficacité de chargement montrent une très faible perte de cellule après le transfert des cellules isolées de capture-puits à la culture des puits, ce qui indique que la plupart des cellules pourraient être transférées efficacement en basculant l'appareil, l'efficacité de transfert est diminué si l'étape de blocage BSA (2.12) n'a pas été effectuée correctement. Les utilisateurs peuvent modifier le protocole de blocage de BSA ou d'utiliser alméthodes alter- de modification de surface pour leurs besoins d'expérimentation des cellules spécifiques (par exemple, l' augmentation de la concentration de BSA ou de revêtement moment où un type de cellule plus adhérente est utilisée). Les dimensions des cellules des puits de capture sont les principaux facteurs qui ont besoin d'être optimisé pour la meilleure efficacité de chargement unique de cellules dans des puits de capture, en fonction de la taille du type de cellule d'intérêt spécifique. plusieurs cellules-in-a-capture-bien élevés événements sont dus à avoir la taille de capture de bien trop grand pour le type cellulaire d'intérêt, alors que la faible efficacité cellule de charge dans le puits de capture est une indication de la taille de la capture du bien-être trop petit. Il est également important de réduire au minimum les agrégats de cellules dans la suspension préparée à une seule cellule, comme des amas de cellules peuvent diminuer l'efficacité de la cellule unique de chargement dans les puits de capture.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
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