Introduction
Närvarande att placera enskilda celler individuellt i ett odlingsutrymme uppnås vanligen genom användning av begränsande utspädning eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). För många laboratorier, begränsande utspädning är en lämplig metod, eftersom det endast kräver en pipett och vävnadsodlingsplattor, som är lätt tillgängliga. I detta fall är en cellsuspension serieutspäddes till en lämplig celldensitet, och placerades sedan i odlingsbrunnar med hjälp av en manuell pipett. Dessa fackindelade enstaka celler används sedan för cellanalys, såsom genetisk heterogenitet screening en och kolonibildning två. Emellertid är denna metod låg genomströmning och arbetsintensiv, utan att utnyttja en robotarm för hjälp, eftersom Poisson-fördelningen naturen hos den begränsande spädningsmetoden begränsar encelliga händelser till en maximal sannolikhet för 37% 3. FACS maskiner med en integrerad robotarmen kan övervinna begränsningen av Poisson fördelning av exakt placing en enda cell i en odlingsbrunn vid en tidpunkt 4. Emellertid den höga mekaniska skjuvspänning (sålunda, sänkte cellviabilitet) 5 och maskin inköp och driftskostnader har begränsat dess användning i många laboratorier.
För att övervinna ovanstående begränsningar, har mikroskala anordningar utvecklats till mycket effektivt ladda enstaka celler i mikrobrunnar 6. Emellertid inte mikrobrunnarna inte ge tillräckligt med utrymme för de laddade celler att proliferera, på grund av behovet av att göra storleken på varje mikrobrunn nära den för en enda cell för att maximera enkelcellbelastning sannolikhet. Som kulturanalyser krävs i många cellbaserad tillämpningar (t.ex., klonogena analys 7), större mikrobrunnar (90-650 | j, m i diameter eller i sidans längd) har också använts för att tillåta förlängda cellodlingar. Men liksom den begränsande utspädningsmetoden, de har också låga enkelcelllastningseffektivitet, som sträcker sig från 10 -. 30% 8, 9
Tidigare, har vi utvecklat en hög genomströmning mikroflödes plattform för att isolera enstaka celler i enskilda mikrobrunnar och demonstrerar dess tillämpning i klonogen analys av de isolerade cellerna. 10 Anordningen gjordes med poly-dimetylsiloxan (PDMS), och innefattar två uppsättningar av mikrobrunn arrayer med olika mikro storlekar som till stor del kan förbättra effektiviteten vid lastning en enda cell i en mikro vars storlek är betydligt större än cellen. Notably, ger detta "dual-well" -konceptet storleken på odlings område som ska flexibelt justeras utan att påverka den encelliga infångningseffektivitet, vilket gör det enkelt att justera utformningen av anordningen för att passa olika celltyper och applikationer. Detta högeffektiv metod bör vara användbara för långtidscellodlingsförsök för cell heterogenitet studier och monoklonal cellinje anläggning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs! Fotomask mönster för våra mikroflödessystem enhet tillverkning drogs med hjälp av en datorstödd konstruktion (CAD) programvara. De mönster sedan används för att tillverka krom fotomasker med hjälp av en kommersiell tjänst. PDMS-enheter gjordes med mjuka litografitekniker. 11
1. Tillverkning av master formar av Litografi
- Innan fotolitografi processen 12, använd 4-tums kiselskivor som substrat och dehydratisera de tunna skivorna i en konventionell ugn vid 120 ° C under 10 min.
- Rengöra de dehydratiserade kiselskivor genom användning av syreplasmabehandling vid 100 watt under 30 sekunder i en plasma renare.
- Värm två kokplattor vid 65 ° C och 95 ° C, respektive, för följande bakningen.
- Coat 5 g av negativ fotoresist (PR) på den rengjorda kiselskivor med en spinnbeläggnings; centrifugering vid 1200 varv per minut (SU-8 50) under 30 sekunder för att producera mikrokanalen skiktet.
- Placera PRbelagda skivan på en förvärmd värmeplatta vid 65 ° C under 12 min och överföra den till en annan förvärmd värmeplatta vid 95 ° C under 33 min (för 100 | im tjocka mönster) för att utföra en mjuk bake process.
- Efter bakning, placera PR belagda kiselskiva på innehavaren av ett halvautomatiskt mask Aligner och anpassa den till en dpi upplösning 25.400 öppenhet fotomasker.
- Exponera PR belagd kiselskiva för UV-ljus (365 nm) vid en dos av 500 mJ / cm 2 för att skapa PR mönster på kiselskivan.
- Ta bort skivan från riktan och placera den på en värmeplatta för post-bakning vid 95 ° C under 12 min.
- Blöt skivorna i SU-8 framkallare (propylenglykolmonometyleteracetat, PGMEA) lösning för att tvätta bort icke-tvärbunden PR för 12 min och försiktigt torrt med kvävgas för att exponera inriktningsmärkena.
- Återigen, päls 5 g av negativ fotoresist på skivorna genom en spinnbeläggare; centrifugering vid 700 varv per minut (SU-8 100) för 30 sek och 1200 varv per minut (SU-8 10) under 30 sekunder för 300 &# 181; m tjock mönster och 27 um tjocka mönster respektive att göra mikroskiktet.
- Placera PR belagda skivan på en värmeplatta vid 65 ° C under 4 min och vid 95 ° C under 8 min (för 27 | j, m djup capture-brunnskiktet); och vid 65 ° C under 40 min och vid 95 ° C under 110 min (för 300 | j, m djup kultur-källskikt).
- Efter kylning, placera PR belagda kiselskiva på masken Aligner utrustad med UV-ljus.
- Exponera PR belagd kiselskiva till UV-ljus (365 nm) i en dos av 250 mJ / cm 2 (för 27 ^ m tjock mönstret) och 700 mJ / cm 2 (för 300 ^ m tjock mönstret).
- Baka rånen vid 95 ° C under 5 min (27 ^ m tjock mönstret) och 30 min (300 | j, m tjockt mönster), respektive.
- Tvätta bort icke tvärbunden PR av PGMEA för 6 min (27 ^ m tjock mönster) och 25 minuter (300 um tjock mönster), respektive, och sedan torka dem med kvävgas.
- Mäta höjden på mönstret funktioner påskivan med en sveplaser profilometer genom att placera skivan på xy-stadiet av en scanning laser profilometer.
- Justera fokalplanet att tydligt visa mönstret funktioner på skivan genom att använda "kameravyn" observation läge under en 20X objektiv.
- Slå observationsläge från "kameravyn" till "laser view", och ställ in övre och nedre positionerna för funktioner.
- Ställ in mätläge, område, kvalitet, och z-pitch upp till transparent (överst), en linje (1024 x 1), med hög noggrannhet och 0,5 um, respektive, och sedan trycka på start botten för att starta mätningen.
2. Beredning av PDMS-enheter för enkelcellisolering
- Innan PDMS gjutning, silaniseras master formar med triklorsilan att skapa en hydrofob yta, vilket gör det lättare att skala bort PDMS repliker från master formarna.
- Placera master formar och en viktning båt innehållande200 pl triklorsilan i en exsickator och anbringa vakuum (-85 kPa) under 15 minuter.
- Stoppa vakuum och sedan lämna master formarna i torkapparaten för att silaniseras master formar vid rumstemperatur i minst 1 timme.
- Ta bort master formarna ur exsickatorn och placera varje mästare mögel i en 10 cm petriskål.
- Blanda en total mängd av 17,6 g PDMS polymer kit som innehåller en bas och en härdare i förhållandet 10: 1, och häll sedan PDMS på master mögel i petriskål.
- Placera petriskålen i en exsickator och anbringa vakuum (-85 kPa) under 1 h för att avlägsna luftbubblor i PDMS.
- Ta bort petriskål ur exsickatorn och placera den i en konventionell ugn vid 65 ° C under 3-6 timmar för att bota PDMS.
- Ta bort det härdade PDMS repliker från master formarna och punsch två hål som ett inlopp och ett utlopp vid de två ändarna av mikro på capture-väl array PDMS replik av en hålslag med innerdiameter på 0.75 mm för den fluidkanalen (Figur 2A).
- Använd tejp för att rengöra ytan av PDMS repliker, och sedan placera PDMS repliker i en plasma renare för kort syreplasmabehandling (100 watt för 14 sek).
- Ta bort PDMS repliker från syreplasmamaskin.
- Rikta en topp (innehållande infångningsmikro) och en botten PDMS (innehållande kulturmikro) replik hand under ett stereomikroskop och sätta dem i kontakt.
- Placera de inriktade PDMS repliker i en ugn vid 65 ° C under 24 h för att uppnå permanent bindning mellan PDMS repliker för att bilda den slutliga anordningen.
- Blöt PDMS anordningen i en avjonat (DI) -vatten fyllda behållaren och placera behållaren i en torkapparat under vakuum (-85 kPa) i 15 min för att avlägsna luft från mikrokanalen av PDMS-enheten.
- Placera DI-vatten-fyllda PDMS anordningen i en vävnadsodling huva och använda UV-ljus (våglängd av ljus: 254 nm) för att sterilisera av anordningen för 30 min.
- Ersätta DI-vatten i PDMS-enhet med en 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS-lösning och inkubera vid 37 ° C under 30 min för att förhindra celler från att fastna vid PDMS ytan.
Obs: BSA beläggningen är kritiskt för att förbättra överföringseffektiviteten av isolerade celler från infångnings brunnar till kultur-brunn. - Ersätta den BSA-lösning 5% i PDMS-enhet med steriliserad 1x PBS-lösning.
3. Beredning av encelliga suspension
- Kultur neurala stamcells KT98, och humant karcinomcellinje A549 och MDA-MB-435 vi i petriskål på konventionellt cellodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2 och 95% fuktighet) för att bereda celler för PDMS-enheten cellexperiment .
- Ta bort och kasta den förbrukade odlingsmedium (DMEM basalt medium matas med 10% fetalt bovint serum och 1% antibiotika) från odlingsskålen med celler odlade till 70 - 80% konfluens.
- Försiktigt tvätta cellerna med steriliserade PBS tre gånger. </ Li>
- Ta bort och kasta PBS och tillsätt 2 ml av en rekombinant enzymblandning med proteolytiska, kollagenolytiska och DNas aktiviteter (se materiallista för detaljerad information).
- Inkubera kulturen skålen vid rumstemperatur under 5 minuter, och sedan på kulturen skålen för att underlätta cell lossnar.
- Tillsätt 4 ml av steriliserad PBS för att dispergera celler, och sedan överföra cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera röret vid 300 xg under 3 min och avlägsna supernatanten.
- Försiktigt resuspendera cellpelleten i 1 ml sterilt PBS och räkna levande celler nummer med hjälp av standard trypanblått uteslutningsmetoden 13.
Obs: Denna resuspension steg är avgörande för att framställa väl dissocierade encelliga fjädring för att förbättra encelliga isolering effektivitet.
4. Single-cell isolering och Klon kultur
- Belastning 50 | il cellsuspension vid en koncentration av 2,2 till 2,5 x10
- Fyll ytterligare 50 pl cellsuspension genom inloppshålet jämnt fylla upp hela mikro med celler.
- Täta utloppshålet med en plugg (3 mm lång, 1 mm i diameter skära nylon lina) för att undvika flöde induceras av hydrostatiskt tryck från droppar på in- och utloppshålen.
Obs! Kontakten var UV steriliseras i en vävnadsodling huva före användning. - Fyll en 1 ml steril spruta med odlingsmedium, mata luftbubblor från det, och ställa upp på en sprutpump.
- Anslut medel laddade sprutan till inloppshålet i PDMS enheten via en 23 G trubbig nål och en poly-tetrafluoroethene (PTFE) slang.
- Ta bort pluggen från utloppshålet och allaow en 2-minuters tidsintervall för att tillåta cellerna att bosätta sig i de encelliga capture-brunnar av gravitationskraften.
- Tvätta bort ouppsamlade cellerna med 300 | il av odlingsmediet vid en flödeshastighet av 600 ul / min drivs av sprutpump.
- Vänta 2 min för att stabilisera enheten och försegla inlopps- och utloppshålen med pluggar för att bilda ett slutet system kultur.
- Vänd enheten för hand för att överföra de infångade enkel celler till odlingsmikro.
- Placera PDMS-enheten i en 100-mm vävnadsodlingsskål och tillsätt 10 ml steriliserat PBS runt enheten för att undvika odlingsmedium avdunstning från mikro.
- Flytta kulturen skålen till en konventionell cellodling inkubator (37 ° C, 5% CO2 och 95% fuktighet) för klonal odling av enkelcellerna.
5. Odlingsmedium Påfyllning
- Efter en d av kultur, ersätta odlingsmediet i PDMS-enheten med färskt medium för att förbättra cell proliferation.
- Placera två droppar av odlingsmedium ovanpå PDMS enheten nära inlopps- och utloppshålen områden för att undvika att införa luftbubblor i mikrokanalen när de utför nästa steg.
- Stansa två hål från toppen av PDMS enheten nära de två ändarna av mikrokanalen som ett inlopp och ett utlopp för mikrokanalen.
Obs! Ta inte slå igenom hela två skikt av PDMS-enheten; i stället, bara stansa genom det översta lagret av PDMS. - Ansluta en plastspruta 1 ml innehållande färskt medium till inloppet via en 23 G trubbig nål och PTFE-slang.
- Flöde 120 l färskt medium i enheten för 5 minuter att ersätta den gamla mediet.
- Sätt två pluggar för att täta inloppet och utloppshålen, och returnera enheten till cellodlingsinkubator.
- Uppdatera odlingsmediet varje 2 d under den period då kulturen genom avlägsnande av tätningspluggar, följt av att upprepa steg 5,4-5,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den mikroflödes plattform för encelliga isolering och odling innefattar en mikrokanal (200 | j, m i höjd) med två uppsättningar av mikrobrunn matriser (Figur 2A). De två uppsättningarna av mikrobrunn arrayer benämns som infångnings-brunn (25 | j, m i diameter och 27 um i djup) och kultur-brunn (285 | j, m i diameter och 300 ^ m i djup) för enkelcellisolering och odling, respektive, och var och en capture-brunn är placerad i centrum av en kultur-väl när sedd från toppen-view (Figur 2B). För enhetens funktion (den schematiska operationsflödet illustreras i figur 1), nödvändig utrustning (sprutpump, vävnadsodlingsinkubator och mikroskop) och tillbehör (spruta, pipett och slangar) är allmänt tillgängliga i biologiska laboratorier. Dessutom bärbarhet och öppenheten i plattformen får cellerna lätt kan observeras och analyseras i en anordning med en konventiontionell mikroskop under cellodlingsexperiment.
Uppsamlingskapacitet av celler i capture-brunnarna efter tvättsteget varierar från 67,80 ± 11,38% till 85,16 ± 1,91% (beroende på celltyp) (Figur 3A). Dessutom är de flesta av de capture-brunnarna innehålla endast en enda cell för alla tre celltyper (89,89% - 92,98%), vilket bekräftades genom att analysera antalet ankommande celler i odlingsbrunnar (Figur 3B). Den slutliga enkelcellisolering effektivitet i odlingsbrunnar var mer än 76% för KT98 och MDA-MB-435-celler, men endast 61% för A549-celler på grund av cellstorleksskillnader bland de testade celltyper.
För cancerforskning, kan klonogen analys av enstaka-celler användas för att testa läkemedelsresistens och förökningshastigheter hos individuella cellkolonier. Cellkulturen och klonogen analys av de isolerade enkel celler i vår platform genomfördes genom att uppdatera odlingsmediet varje 2 d. Denna demonstration belyser tillämpningen av denna enhet för att studera cellulära heterogenitet vid den enda cellnivå genom att mäta skillnaderna i cellöverlevnad och förökningshastigheter i enskilda celler.
Det cellulära heterogenitet och proliferationshastighet av de isolerade cellerna analyserades från daglig förvärvade bilder. Resultaten visade att de isolerade enskilda celler kunde odlas för 7 d och uppvisade olika tillväxtmönster. Till exempel, hade 13% av de isolerade cellerna ingen celldelning och förblev som en enda cell (Figur 4B), medan 17,5% av cellerna delas in i mer än 15 celler och bildade cellkolonier (Figur 4A) under odlingen. Cellular heterogenitet bland de celler som förökar också framgår av deras olika tillväxtmönster att bilda två celler (4,3%), tre celler (2,5%), och 4 - 14 celler(15%) i cellodlingsexperiment (Figur 4C).
Dessa resultat indikerade att plattformen kan användas för långsiktig cellodling, klonogena analyser och cellulära heterogenitet studier. Som har ett stort antal individuella cellkolonier odlade i en liten bänkyta också gör mikroskopisk analys av cellerna lättare.
. Figur 1. Schematisk illustration av operationsflödet för hög genomströmning encelliga isolering och odling i mikroflödessystem plattformen Hanteringen för encelliga isolering och klonal kultur omfattar 4 steg: i) lastceller in i mikro av en plastspets och manuell pipett; ii) tvätta bort de ouppsamlade celler med färskt odlingsmedium driven av en sprutpump; iii) Efter försegling av inlopps- och utloppsöppningar med pluggar, den ärolated celler överfördes från capture-brunnar till kultur-brunnar genom att vända enheten; och iv) utföra klon kultur (klonogen analys) i odlingsbrunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Foto och SEM bilder av mikroflödes encelliga isolering och odling plattform. (A) mikroflödessystem plattform laddad med röd färg som visar mikrokanal och mikrostrukturer för encelliga kultur. (B) En representativ bild som tas från ett snitt anordning, som visar den sidovy av tre encelliga isolering och klonal kultur enheter i mikroflödes plattformen. Skala bar: 100 nm. SEM-bilder av enkelcellkultur (C) och infångning (D Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. KT98, A549, och MDA-MB-435 singel-cellisolering effektivitet i mikroflödes plattform. (A) Effektivitet av KT98, A549, och MDA-MB-435-celler fångas i infångnings-brunnar efter att ha tvättat bort de ouppsamlade celler . Uppsamlingskapacitet av celler var från 67,80% till 85,16% i de tre celltyper. (B) Den encelliga förhållandet totalt odlingsbrunnar (slash bar) var mer än 76% för KT98 och MDA-MB-435, men 61,63% för A549. (C) En representativ bild av individuell KT98 enkel celler(Röd, färgas med cell tracker) isoleras i stora kultur-brunnar för klonal kultur. Skala bar: 300 um. (D) Cellantal i cell ockuperade kultur-brunnar i cellmodell KT98. Förhållandet av odlingsbrunnar var 77,3% med en single-cell, 16,31% med inga celler, 5,96% med två celler och 0,43% med mer än tre celler. Felstaplar representeras som ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Cellkultur, klonogen analys, och cellulär heterogenitet studie av isolerade A549-celler i mikroflödes plattform för 7 d. (A) En isolerad encelliga växte och prolifererade till en cellkoloni i kultur-brunn. (B) En isolerad encelliga levde, men inte dela, efter 7 dkultur. Skala bar: 100 nm. (C) De isolerade enkel celler uppvisade heterogena tillväxtmönster efter att ha odlats under 7 d. Felstaplar representeras som ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikro-baserade utrustningssystem 6,14 har använts för encelliga manipulation och analys, såsom storskaliga enda cell fånga 6 och enda hematopoetisk stamcellstransplantation proliferation 15. Men väl storlek, antal och form kan justeras för specifika tillämpningar, encelliga isolering effektivitet alltid äventyras när storleken av brunnen ökar. 9,15
För att övervinna denna begränsning, Park et al. Rapporterade en mikroflödeschip med triangulära mikrobrunnar som har en hög encelliga infångningshastighet (58,34%), under det att mikrostorlek är förstorad för att tillåta cellspridning och tillväxt. Däremot kan de mikro (med längden på en sida ~ 50 pm) endast stöder celltillväxt för upp till 2 d. 16 Vår dubbla brunnar strategi tillåter encelliga belastning i stora mikro att inte begränsas av sannolikheten för Poisson fördelning påträffas vid begränsande dilumetoder och öppna väl system 3, vilket framgår av att tillhandahålla hög encelliga isolering effektivitet (mer än 75%) i stora mikro vars storlek var tillräckligt för celltillväxt under minst 7 d (Figur 4A). På grund av sin förmåga att mycket effektivt utföra encelliga isolering och klonal kultur med en enkel anordning och tillvägagångs, föreställer vi att våra mikroflödes plattform skulle kunna utgöra ett användbart verktyg för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive cancer stamcells val genom klonogen analys 17 och hög genomströmning hjärtscreening av läkemedel 18,19.
En viktig begränsning av vår encelliga isolering och odling plattform är att det inte bildar individuellt slutna odlingsbrunnar för att förhindra överhörning mellan celler odlade i odlingsbrunnar. Därför kan beteendet hos cellerna att påverkas av den parakrina utsöndring av andra isolerade enstaka-celler i mikroflödessystem enhet. OThennes begränsning av vår plattform är behovet av att förbereda relativt hög densitet cellsuspension för hög effektivitet single-cellisolering. Denna höga cellförbrukning kan begränsa tillämpningarna av sällsynta cellisolering och odling, såsom vattenhaltiga humor celler.
Innan anordningen drift, är det viktigt att injicera DI vatten från inloppshålet för att fylla mikrokanalen och noga iaktta någon läckage från dessa bundna PDMS-enheten. Vätskeläckage påverkar flödet tillstånd i mikro därmed kan påverka infångningscellen och överföra resultatet. Dessutom, även om våra encelliga laddningseffektivitet studieresultat visar mycket låg cellförlust efter överföring av isolerade celler från infångnings-brunnar till kultur-brunnar, vilket tyder på att de flesta celler kan effektivt överföras genom att bläddra enheten är överföringseffektiviteten minskas om BSA blockeringssteget (2,12) är inte rätt sätt. Användare kan ändra BSA blockerande protokoll eller använd alnativa yta modifieringsmetoder för deras specifika cellexperiment behov (t.ex. ökande BSA koncentration eller beläggning då en mer vidhäftande celltyp används). Dimensionerna hos de cellinfångnings-brunnar är de dominerande faktorer, som måste optimeras för den bästa encelliga laddningseffektivitet i infångnings-brunnar, beroende på storleken av den specifika celltypen av intresse. Höga multipla celler-in-a-capture-väl händelser beror på att ha fånga väl storlek för stor för celltypen av intresse, medan låg cellbelastning effektivitet i avskiljning och är en indikation på storleken på fångst välbefinnande för liten. Det är också viktigt att minimera cellkluster i den framställda enda cellsuspension, som cellkluster kan minska effektiviteten av single-cellbelastning i de capture-brunnarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
