Introduction
Şu anda bir kültür alanı ayrı ayrı tek hücre yerleştirilmesi genellikle sınırlayıcı seyreltme veya floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak elde edilir. sadece kolayca elde edilebilir Bir pipet ve doku kültür plakaları, gereğine göre bir çok laboratuarlar için, sınırlayıcı seyreltme, uygun bir yöntemdir. Bu durumda, bir hücre süspansiyonu seri uygun bir hücre yoğunluğuna kadar seyreltilir ve daha sonra bir el ile bir pipet kullanarak kültür kuyu içine yerleştirilir. Bu bölmeli tek hücreler daha sonra, 1 ve koloni oluşumu 2 tarama genetik heterojenliğinin olarak, hücre analizi için kullanılmıştır. Sınırlayıcı seyreltme yöntemi Poisson dağılımı doğa% 37 3 maksimum olasılık tek hücreli olayları kısıtlar çünkü Ancak, bu yöntem yardım için bir robot kolu kullanarak olmadan düşük verimlilik ve emek-yoğun, olduğunu. entegre robot kol ile FACS makineleri doğru Plac tarafından Poisson dağılımının sınırlama üstesinden gelebilirBir anda 4 de hiç bir kültürde tek hücreli ing. Ancak, yüksek mekanik kayma gerilmesi 5 (böylece, hücre canlılığını indirdi) ve makine alım ve işletme maliyetleri çok laboratuvarda kullanımını sınırlıdır.
Çok verimli bir mikro 6 içine tek hücreler yüklemek için yukarıdaki sınırlamaları aşmak için, mikro cihazlar geliştirilmiştir. Ancak, mikro-yüklü hücreler nedeniyle tek hücreli yükleme olasılığını maksimize etmek için tek bir hücre olduğu yakın microwell her boyutunu yapma ihtiyacı, çoğalmaya için yeterli alan vermeyin. Kültür deneyleri daha büyük mikro-birçok hücre bazlı uygulamalar (örneğin, klonojenik analiz 7), gerekli olduğu için (90 - 650 um çapında ya da yan uzunluğunda), aynı zamanda uzun bir hücre kültürleri için izin vermek için kullanılmıştır. Ancak, sınırlayıcı seyreltme yöntemi gibi, onlar da 10 arasında değişen, düşük tek hücre yükleme verimliliği sahip -.% 30 89
Daha önce, 10 cihazı poli-dimetilsiloksan (PDMS) ile yapıldı. Ayrı ayrı mikro tek hücrelerin izole edilmesi ve izole edilmiş hücrelerin klonojenik deneyde uygulanmasını göstermek için yüksek verimli mikroakışkan platformu geliştirilmiş ve mikro dizilerinin iki grup ihtiva eder adres büyük ölçüde olan boyutu kuyucuklarda tek bir hücreyi yüklenirken verimliliğini artırabilir farklı mikro boyutlarda olan hücrenin önemli ölçüde daha büyüktür. Özellikle, bu "çift kuyu" kavramı kültür alanının büyüklüğü esnek o basit farklı hücre tiplerini ve uygulamalarına uygun cihazın tasarımını ayarlamak için yapım, tek hücreli yakalama verimliliği etkilemeden ayarlanmasına imkan verir. Bu yüksek verimli bir yöntem, hücre heterojenite çalışmaları ve monoklonal hücre çizgisi oluşturulması için uzun vadeli bir hücre kültür deneyleri için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bizim mikroakışkan cihaz imalatı için photomask tasarımları bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak çizildi. tasarımlar daha sonra ticari bir hizmeti kullanarak krom, fotoğraf maskeleri imal etmek yararlanılmıştır. PDMS cihazlar yumuşak litografi teknikleri kullanılarak yapılmıştır. 11
Litografi tarafından Usta Kalıpları 1. Fabrikasyon
- Fotolitografi işlem 12 önce, bir alt-tabaka 4-inç çaplı silisyum gofret kullanımı ve 10 dakika boyunca 120 ° C de, geleneksel bir fırında gofret dihidrat.
- Bir plazma temizleyici 30 saniye boyunca 100 watt oksijen plazma tedavisi ile susuz silikon gofret temizleyin.
- Aşağıdaki pişirme işlemi için, sırası ile 65 ° C 'de iki ocak ve 95 ° C, ön ısıtma.
- spin kaplayıcı ile temizlenir silikon gofret üzerinde olumsuz fotorezist (PR) Coat 5 g; 30 sn 1,200 rpm (SU-8 50) spin mikrokanal tabakası üretmek.
- PR yerleştirin12 dakika boyunca 65 ° C'de önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerine gofret kaplanmış ve yumuşak bir fırında işlemini gerçekleştirmek için (100 mikron kalınlığında desenler) 33 dakika boyunca 95 ° C'de bir ısıtılmış sıcak plaka aktarın.
- Pişirme sonrasında, bir yarı otomatik maske hizalama sahibinin PR kaplı silikon gofret yerleştirin ve bir 25400 dpi çözünürlük şeffaflık photomask onu hizaya getirin.
- Silikon gofret PR desen oluşturmak için 500 mJ / cm2 dozunda UV ışığı (365 nm) PR kaplı silikon gofret Açığa.
- hizalama gelen gofret çıkarın ve 12 dakika süreyle 95 ° C'de post-Pişirme için bir ocak üzerine yerleştirin.
- hizalama işaretlerini ortaya çıkarmak için 12 dakika ve azot gazı ile hafifçe kuru için çapraz bağlanmamış PR yıkayın SU-8 geliştirici (propilen glikol monometil eter asetat, PGMEA) çözeltide gofret bekletin.
- Yine, spin kaplayıcı tarafından gofret üzerinde olumsuz fotorezist ceket 5 g; 300 ve 30 sn için 30 saniye ve 1200 rpm'de (SU-8 10) 700 rpm'de (SU-8 100) spin# 181; m kalınlığında desen ve 27 mikron kalınlığında desen sırasıyla mikro katmanı yapmak.
- (27 um, derin çekme çukurlu katmanı), 4 dakika ve 8 dakika boyunca 95 ° C 'de 65 ° C' de bir sıcak plaka üzerinde PR kaplanmış gofret yerleştirin; 40 dakika boyunca 65 ° C 'de ve (300 um derin bir kültür çukurlu tabakası için), 110 dakika boyunca 95 ° C' de.
- Soğuduktan sonra, UV ışığı ile donatılmış maske hizalama PR kaplı silikon gofret yerleştirin.
- 250 mJ / cm 2 (27 mikron kalınlığında deseni) ve 700 mJ / dozunda cm 2 (300 mikron kalınlığında pattern) UV ışığı (365 nm) PR kaplı silikon gofret Açığa.
- sırasıyla 5 dakika boyunca (27 mikron kalınlığında deseni) ve 30 dakika (300 mikron kalınlığında kalıp) 95 ° C 'de gofret pişirilir.
- sırasıyla 6 dakika (27 mikron kalınlığında deseni) ve 25 dakika (300 mikron kalınlığında desen), için PGMEA tarafından çapraz bağlanmamış PR yıkayın ve sonra azot gazı ile kurulayın.
- desen özelliklerini yüksekliğini ölçmekBir tarayıcı lazer Profilometrenin xy-sahnede gofret koyarak tarama lazer profilometreyle gofret.
- açıkça desen 20X objektif mercek altında "kamera görüntüsü" gözlem modu kullanarak gofret özelliklerini göstermek için odak düzlemi ayarlayın.
- "Lazer görünüm" "kamera görüntüsü" dan gözlem moduna geçmek ve özellikleri üst ve alt pozisyonları ayarlayın.
- sırasıyla ölçüm modu, alanı, kalite ve saydam (üstte) kadar z-zift, 1 satır (1.024 x 1), yüksek doğruluk ve 0.5 mikron, ayarlayın ve ardından ölçüme başlamak için başlangıç altını basın.
Tek hücreli İzolasyon PDMS Cihazlarının 2. Hazırlık
- PDMS döküm önce, daha kolay ana kalıpları PDMS kopyaları kalkmasına yapar hidrofobik bir yüzey yaratmak için trichlorosilane ile ana kalıpları Silanize.
- usta kalıpları ve içeren bir ağırlık tekne yerleştirin200 kurutucuda trichlorosilane ul ve 15 dakika boyunca vakum (-85 kPa) uygulanır.
- vakumu durdurmak ve daha sonra en az 1 saat oda sıcaklığında ana kalıpları Silanize için desikatörde ana kalıpları bırakın.
- desikatöre master kalıpları çıkarın ve 10 cm Petri kabındaki her ana kalıp yerleştirin.
- bir taban ve 10 arasında bir oranda bir sertleştirme ajanı ihtiva eden 17.6 g PDMS polimer kitinin bir toplam tutarını karıştırın: 1, ve daha sonra Petri kabındaki ana kalıp PDMS dökün.
- desikatörde Petri kabı yerleştirin ve PDMS hava kabarcıklarını çıkarmak için 1 saat vakum (-85 kPa) uygulanır.
- desikatör Petri çanağı çıkarın ve 3 65 ° C sıcaklıkta, geleneksel bir fırında yer - PDMS tedavisi için 6 saat.
- ana kalıpları tedavi PDMS kopyaları çıkarın ve 0 iç-çapına sahip bir puncher'ait yakalama-kuyu dizi PDMS çoğaltma Mikrokanallı iki ucunda iki bir giriş olarak delikleri ve bir çıkış yumruk.Akışkan kanalının (Şekil 2A) için 75 mm.
- PDMS kopyaları yüzeyini temizlemek ve sonra kısa bir oksijen plazma tedavisi (14 sn için 100 watt) için bir plazma temizleyici PDMS kopyaları yerleştirmek için bant kullanın.
- oksijen plazma makineden PDMS kopyaları çıkartın.
- Bir stereomikroskop altında elle bir üst (yakalama mikro içeren) ve (kültür mikro içeren) bir alt PDMS çoğaltma hizalayın ve temas getirmek.
- Nihai cihaz oluşturmak PDMS yinelemeler arasında sürekli bir bağlantı sağlamak için 24 saat boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde hizalanmış PDMS yinelemeler yerleştirin.
- deiyonize (Di) -su doldurulmuş kapta PDMS cihaz ıslatın ve PDMS cihazın mikrokanaldan havayı çıkarmak için 15 dakika boyunca vakum altında (-85 kPa) bir desikatör içinde kap yerleştirmek.
- Bir doku kültürü kaputu DI su dolu PDMS cihaz yerleştirin ve UV ışığı (ışığın dalga boyu: 254 nm) kullanmak 30 mil için cihazın sterilize etmekn.
- 1X PBS çözeltisi içinde% 5 sığır serum albumin (BSA) ile PDMS cihazında distile su yerine ve PDMS yüzeye yapışmasını engellemek için hücrelerin 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
BSA kaplama izole hücre transferi verimini artırmak için kritik yakalama oyuklu kültür oyuklu: edin. - sterilize 1x PBS çözeltisi ile PDMS cihazın% 5 BSA çözüm değiştirin.
Tek hücreli Süspansiyon 3. hazırlanması
- Kültür Nöral hücre KT98 ve insan karsinoma hücre A549 ve MDA-MB-435, biz kök PDMS cihaz hücre deneyi için hücreler hazırlamak için geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) Petri kabındaki .
- Çıkarın ve geçirilerek kültür ortamı 70 yetiştirilen hücreler kültür kabı (% 10 fetal bovin serumu ve% 1 antibiyotik ile birlikte DMEM bazal ortamı) iptal -% 80 birleşir.
- Yavaşça sterilize PBS üç kez hücreleri yıkayın. </ Li>
- (Ayrıntılı bilgi için Malzeme Listesi bakınız) çıkarın ve PBS atmak ve proteolitik, kolajenolitik ve DNaz faaliyetleri ile rekombinant enzim karışımı 2 ml ekleyin.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kültürü çanak inkübe ve daha sonra hücre ayrılması için kültür çanağı dokunun.
- hücrelerin dağıtılması için steril PBS 4 ml ve sonra 15 ml konik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın.
- 3 dakika boyunca 300 xg'de tüp Santrifüj ve süpernatant kaldırmak.
- Yavaşça PBS sterilize 1 ml hücre pelletini ve standart Tripan Mavi dışlama yöntemi 13 kullanarak canlı hücre sayısını.
Not: Bu yeniden süspansiyon haline adımı tek hücre izolasyon verimini artırmak için iyi ayrışmış tek hücre süspansiyonu hazırlamak için kritik önem taşır.
4. Tek hücreli İzolasyon ve klonal Kültür
- 2.5 x10 - 2.2 arasında bir konsantrasyonda Yük hücresi süspansiyonu 50 ul
Not: Hücre süspansiyonu yükleme pipet Mikrokanallı içine hava kabarcıkları almaktan kaçınması durdu ve ilk durağı konumunda düzenlenecek gerekmektedir. - eşit hücreleri ile tüm Mikrokanallı doldurmak için giriş delikten hücre süspansiyonu başka bir 50 ul yükleyin.
- giriş ve çıkış delikleri damlacıklar gelen hidrostatik basınç ile uyarılan akışını önlemek için bir tıkaç (3 mm uzunluğunda, 1 mm çapında kesim naylon misina) ile çıkış deliği mühür.
Not: Fişler kullanmadan önce bir doku kültürü kaput içinde sterilize UV idi. - , Kültür ortamı ile 1 ml steril şırınga doldurun ondan hava kabarcıklarını çıkarmak ve bir şırınga pompası kurmak.
- Bir 23 G, kör bir iğne ve bir poli-tetrafluoroethene (PTFE) boru ile PDMS cihazın giriş deliğine orta yüklü şırınga bağlayın.
- çıkış deliği ve tüm prizden çıkarınow 2 dk zaman aralığı hücreleri yerçekimi kuvveti tarafından tek hücreli yakalama-kuyu içine yerleşmek için izin vermek.
- şırınga pompası tarafından tahrik edilen 600 | il / dk'lık bir akış oranında kültür ortamında 300 ul uncaptured hücreleri yıkamak.
- Cihazı stabilize etmek 2 dakika bekleyin ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için fişler ile giriş ve çıkış delikleri kapatın.
- kültür mikro yakalanan tek hücreleri aktarmak için el cihazı çevirin.
- 100 mm doku kültürü çanağı içinde PDMS cihaz yerleştirin ve mikrokanaldan kültür ortamı buharlaşmayı önlemek için cihaz etrafında steril 10 ml PBS ilave edin.
- Tek hücrelerinin klonal kültürü için geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) kültür çanağı hareket.
5. Kültür Orta Yenileme
- kültür 1 gün sonra, hücre pr geliştirmek için taze ortam PDMS cihazında bir kültür ortamı yerineoliferation.
- Bir sonraki adımı yaparken Mikrokanallı içine hava kabarcıkları almaktan kaçınması giriş ve çıkış delikleri alanların yakınında PDMS cihazın üstündeki kültür ortamının iki damlacıkları yerleştirin.
- Bir giriş olarak, mikrokanalın iki ucunun yakınındaki PDMS cihazın üst ve mikrokanal için bir çıkışı iki delikler.
Not: PDMS cihazın tam iki kat üzerinden yumruk etmeyin; Bunun yerine, sadece PDMS üst katmanı sayesinde yumruk. - Bir 23 G, kör bir iğne ve PTFE tüp vasıtasıyla girişe taze ortam ihtiva eden bir 1 ml'lik plastik bir şırınga bağlayın.
- eski orta yerine 5 dakika süreyle cihaza 120 ul taze orta akış.
- giriş mühür ve delikler çıkış ve hücre kültürü inkübatör cihazı geri dönmek için iki fişleri takın.
- 5.5 adımları 5.4 tekrarlayarak ardından sızdırmazlık tapaları, kaldırarak kültür ortamının kültürünün döneminde her 2 günde bir yenileyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek hücre izolasyonu ve kültürü için mikroakışkan platformu mikro dizileri iki set (Şekil 2A) ile bir mikrokanal (yükseklik 200 mm) içerir. Mikro dizilerin iki set yakalama oyuk (çapı 25 mm ve derinliği 27 mm), sırasıyla, tek hücreli izolasyonu ve kültürü için, kültür oyuk (çapı 285 mm ve derinlik 300 mm), ve her olarak adlandırılır üst görünümü (Şekil 2B) görüldüğü zaman yakalama-kuyu kültür-kuyu merkezinde konumlandırılmış. Cihaz işlemi (şematik işlem akışı Şekil 1'de gösterilmiştir), gerekli ekipman (şırınga pompası, doku kültürü inkübatör ve mikroskoplar) ve malzeme (şırınga, pipet ve tüp) biyolojik laboratuvarlarda yaygın olarak mevcuttur. Ayrıca, platformun taşınabilirliği ve şeffaflık hücreleri kolayca konvansiyonel olan bir cihaz gözlenen ve analiz edilmesine izinHücre kültürü deney sırasında tional mikroskobu.
85,16 ± 1.91% (hücre tipine bağlı olarak) (Şekil 3A) için 67.80 ± 11.38 den% yıkama aşaması aralıkları sonra yakalama kuyularda hücrelerin yakalama etkinliği. Kültür-deliklerin (Şekil 3B), yüklü hücrelerin sayısı analiz ile teyit edilmiştir, - Ayrıca, yakalama kuyuların çoğu tüm üç hücre (92,98% 89.89%), yalnızca bir tek hücre ihtiva eder. Kültür-kuyu son tek hücre izolasyon verimi KT98 ve MDA-MB-435 hücreleri için fazla% 76, ancak test edilen hücre tipleri arasında hücre boyutu farkları nedeniyle A549 hücreleri sadece% 61.
Kanser Araştırma için, tek hücre klonojenik analiz ilaç direnci ve tek tek hücre kolonilerinin çoğalmasının oranlarını test etmek için kullanılabilir. Bizim p izole tek hücrelerin hücre kültürü ve clonogenic tahlillatform kültür ortamı her 2 günde bir yenileyerek yürütülmüştür. Bu gösteri hücre canlılığı ve bireysel hücrelerin çoğalması oranlarındaki farklılıklar ölçerek tek hücre düzeyinde hücresel heterojenliği eğitim için bu cihazın uygulanabilirliğini vurgulamaktadır.
İzole hücrelerin hücresel heterojenite ve çoğalma oranı günlük edinilmiş görüntülerden analiz edildi. Sonuçlar izole tek hücreler 7 gün süreyle kültüre ve farklı büyüme modelleri sergilenecek olabileceğini gösterdi. Hücrelerin% 17.5 den fazla 15 hücre ve kültür sırasında oluşan hücre kolonileri (Şekil 4A) ayrılır ise, örneğin, izole edilmiş hücrelerin% 13 hücre-bölünmesi vardı ve tek bir hücre (Şekil 4B) olarak kaldı. 14 hücreleri - çoğalan hücreler arasındaki hücresel heterojenlik iki hücre (% 4.3), üç hücreye (% 2.5) ve 4 oluşturabilen Farklı büyüme modelleri kanıtladığıHücre kültürü deneyi (Şekil 4C) (15%).
Bu sonuçlar, bir platform uzun süreli hücre kültürü, klonojenik tahlilleri ve hücre heterojenite çalışmaları için kullanılabileceğini göstermiştir. az yer kaplayan bir bölgede yetiştirilen tek tek hücre kolonileri bir sayıda olması da hücrelerin kolay mikroskopik analizini yapar.
. Mikroakışkan platform yüksek hacimli tek hücreli izolasyonu ve kültürü için işlem akışı Şekil 1. şematik gösterimi tek hücre izolasyonu ve klonal kültürü için çalışma prosedürü 4 aşamaları içerir: plastik bir ucu ile mikrokanalın içine i) yük hücresi ve manuel pipet; ii) bir şırınga pompası tarafından tahrik edilen taze kültür ortamı ile uncaptured hücreleri yıkamak; iii) fişli giriş ve çıkış açıklıkları kapatıldıktan sonra, birolated hücreler cihazı saygısız kültür-kuyulara yakalama-kuyulardan transfer edildi; ve iv) kültür-kuyularda klonal kültürünü (clonogenic tahlil) gerçekleştirin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Fotoğraf ve mikroakışkan tek hücre izolasyonu ve kültürü platformu SEM görüntüleri. (A) Tek hücre kültürü için mikro ve mikro yapılarını gösterir kırmızı boya ile yüklenen mikroakışkan platformu. (B) mikroakışkan platformda üç tek hücre izolasyonu ve klonal kültür birimlerinin yan görünümünü gösteren, bir kesim cihazdan alınan bir temsilci görüntü. Ölçek çubuğu: 100 mikron. Tek hücreli kültürü (C) ve yakalama SEM görüntüleri (D bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. KT98, A549, ve MDA-MB-435 mikroakışkan platformda tek hücreli izolasyon verimi. (A) uncaptured hücreleri uzak yıkandıktan sonra yakalama kuyularda yakalanan KT98, A549, ve MDA-MB-435 hücreleri Etkinliği . Hücrelerin yakalama verimi üç hücre tiplerinde 85,16% ile 67,80% oldu. (B) toplam kültür kuyularda tek hücre oranı (çizgi bar) KT98 ve MDA-MB-435 daha fazla,% 76, fakat A549 için 61.63% idi. (C) tek tek KT98 tek bir hücre için temsili görüntüsüklonal kültürü için büyük kültür-kuyulardan izole (hücre izci ile boyanmış kırmızı). Ölçek çubuğu: 300 mikron. KT98 hücre modelinde hücre işgal kültürü kuyularda (D) hücre sayısı. kültür kuyularının oranı, tek hücreli% 77.3 idi, hücre bulunmayan 16.31%, iki hücre, ve en fazla üç hücreleri ile% 0,43 ile% 5.96. Hata çubukları ± SD olarak temsil edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Hücre kültürü, klonojenik analiz, ve 7 gün için mikroakışkan platformda izole A549 hücrelerinin hücresel heterojenlik çalışması. (A), izole edilmiş bir tek hücre büyüme ve Kültür oyuklu bir hücre kolonisi için çoğalmıştır. (B) bir izole tek hücreli 7 gün sonra, hayatta, ama bölmek vermedikültür. Ölçek çubuğu: 100 mikron. (C) 7 gün boyunca kültüre edildikten sonra heterojen büyüme modelleri sergilendi izole tek hücre. Hata çubukları ± SD olarak temsil edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikro-tabanlı bir aygıt sistemleri 6,14 örneğin 6 yakalama geniş çaplı tek bir hücre tek kök hücre çoğalması 15 gibi tek hücre manipülasyonu ve analiz için kullanılmıştır. De boyut, sayı ve şekil olsa da, özel uygulamalar için ayarlanabilmektedir kuyunun boyutu artar olduğunda tek hücre izolasyon verimi, her zaman ele almaktadır. 9,15
Mikro boyutu hücre yayılması ve büyümesi için izin vermek için büyütülür ise bu sınırlamayı aşmak için, Park ve ark., Yüksek tek hücreli yakalama oranı (58.34%) sahip üçgen mikro bir mikroakışkan çip bildirdi. Bununla birlikte, (bir tarafı ~ 50 um uzunluğunda) mikro-olduğunda, en fazla 2 gün için hücre çoğalmasını destekleyebilir. 16 Dual-çukurlu stratejisi, büyük mikro tek-hücre yükleme Poisson olasılığı ile sınırlı değildir sağlar dağıtım Dilu sınırlama karşılaşılanyon yöntem ve büyüklüğü en az 7 gün (Şekil 4A), hücre çoğalması için yeterli geniş mikro yüksek tek hücre izolasyon etkinliği (% 75'den daha fazla) sağlanması ile gösterildiği gibi, açık yanı sistemleri 3. Çok verimli bir basit cihaz ve işlem prosedürü ile tek hücreli izolasyonu ve klonal kültürünü gerçekleştirmek için kabiliyetinden dolayı, bizim mikroakışkan platformu clonogenic tahlil 17 kanser kök hücre seçimi de dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi için yararlı bir araç teşkil ki tasavvur ilaçların 18,19 ve yüksek verimli kardiyotoksisite tarama.
Bu tek-hücreli izolasyonu ve kültürü platformun önemli bir sınırlama kültürün-kuyu kültür hücreleri arasındaki çapraz karışmayı önlemek için tek tek kapalı kültür kuyu oluşturmayan olmasıdır. Bu nedenle, hücre davranışını mikroakışkan cihazda diğer izole edilmiş tek-hücre parakrin salgılanmasıyla etkilenebilir. otplatformumuzun onu sınırlaması yüksek verimlilik tek hücre izolasyonu için göreceli olarak yüksek yoğunluklu hücre süspansiyonu hazırlamak için ihtiyaç vardır. Bu yüksek hücre tüketimi gibi sulu mizah hücreleri gibi nadir hücre izolasyonu ve kültürü, uygulamalarını sınırlayabilir.
Cihaz işlemi başlamadan önce, bağlı PDMS cihazdan herhangi bir sıvı sızıntısı Mikrokanallı doldurmak ve dikkatli gözlemlemek giriş deliğinden distile su enjekte etmek için önemlidir. Sıvı kaçağı olumsuz hücre yakalama ve aktarımı sonucu etkileyebilecek böylece mikrokanalda akış durumunu etkiler. Bizim tek hücreli yükleme verimliliği çalışmanın sonuçları cihazı saygısız çoğu hücreleri etkin bir şekilde transfer edilebileceğini belirten kültür-kuyulara yakalama-kuyu izole hücreler aktardıktan sonra çok düşük hücre kaybı gösterir, ancak ek olarak, transfer verimi ise azalır BSA engelleme adımı (2.12) düzgün gerçekleştirilmez. Kullanıcılar BSA engelleme protokolü değiştirebilir veya al kullanabilir(Daha yapışık hücre tipi kullanıldığında BSA konsantrasyonu veya kaplama süresini arttırmak, örneğin) kendi özel hücre deneyi ihtiyaçları için ternatif yüzey modifikasyonu yöntemleri. hücre yakalama-deliklerin boyutları ilgi hücre türüne boyutuna bağlı olarak, yakalama-Wells iyi tek hücre yükleme verimliliği optimize edilmesi gerekir baskın faktör vardır. Yüksek çoklu hücre-in-a-yakalama-kuyu olayları ilgi hücre tipi için çok büyük yakalama kuyu boyutuna sahip nedeniyle, yakalama kuyuda düşük hücre yükleme verimliliği refahı yakalama boyutunun göstergesidir oysa çok küçük. Hücre kümeleri yakalama kuyularda tek hücreli yükleme etkinliğini azaltabilir gibi hazırlanan tek hücre süspansiyonu, hücre kümeleri en aza indirmek için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
