Introduction
В настоящее время размещения отдельных клеток по отдельности в ферментационной пространстве обычно достигается за счет использования ограниченного разведения или флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS). Для многих лабораторий, предельное разведение является удобным методом, так как он требует только пипеткой и тканевые культуры пластины, которые легко доступны. В этом случае суспензию клеток серийно разводили до соответствующей плотности клеток, и затем помещают в культуральные лунки с помощью ручной пипетки. Эти отдельные клетки , разделенные на отсеки, затем используются для анализа клеток, таких как генетической гетерогенности скрининг 1 и колонии образование 2. Тем не менее, этот метод является низкой пропускной способностью и трудоемкий, без использования роботизированную руку за помощью, так как распределение Пуассона характер методом серийных разведений ограничивает события одноклеточных до максимальной вероятностью 37% 3. FACS машины с интегрированной роботизированной рукой может преодолеть ограничение распределения Пуассона путем точного НОАКING один для одной ячейки в культуре также одновременно 4. Тем не менее, высокие механические напряжения сдвига (таким образом, снижение жизнеспособности клеток) 5 и машина покупка и эксплуатационные расходы ограничили его использование во многих лабораториях.
Чтобы преодолеть вышеуказанные ограничения, микромасштабные устройства были разработаны с высокой эффективностью загрузки отдельных клеток в лунках 6. Тем не менее, Микролунки не обеспечивают достаточное пространство для нагруженные клетки к пролиферации, из-за необходимости делать размер каждого микропланештным, близкой к одной ячейке, чтобы максимизировать вероятность загрузки одноклеточных. Как Анализы культуры необходимы во многих приложениях , основанных на клетках (например, клоногенности 7), более крупные Микролунки (от 90 - 650 мкм в диаметре или по длине боковой) также были использованы для обеспечения расширенных клеточных культур. Тем не менее, как и методом серийных разведений, они также обладают низкой эффективностью одноклеточ- погрузочных, в пределах от 10 -. 30% 8, 9
Ранее мы разработали высокой пропускной микрожидкостных платформу для выделения отдельных клеток в отдельных лунках и демонстрируют свое применение в клоногенности из изолированных клеток. 10 Устройство было сделано с поли-диметилсилоксан (PDMS), и включает в себя два набора микролуночные массивов с различными размерами микролуночные, которые могут в значительной степени улучшить эффективность при загрузке одной ячейки в микропланшета размер которого значительно больше, чем клетки. Следует отметить, что это понятие "двойного хорошо" позволяет размер области культуры, чтобы гибко регулироваться без влияния на эффективность улавливания одноклеточных, что делает его простым для регулировки конструкции устройства в соответствии с различными типами клеток и приложений. Этот метод высокой эффективности должно быть полезным для долгосрочных экспериментов на культуре клеток для исследования клеточной гетерогенности и моноклональное создании клеточной линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Конструкции фотошаблонов для изготовления нашей микрожидком устройства были сделаны с использованием системы автоматизированного проектирования программного обеспечения (САПР). Проекты были затем использованы для изготовления фотошаблонов хромовые с использованием коммерческих услуг. Эти PDMS устройства были сделаны с использованием мягких методов литографии. 11
1. Изготовление пресс-форм Мастер литографией
- До начала процесса 12 фотолитографии используют 4- х дюймовых кремниевых пластин в качестве подложки и обезвоживают пластин в обычной печи при 120 ° С в течение 10 мин.
- Очистите обезвоженные кремниевых пластин с помощью плазменной обработки кислорода при 100 Вт в течение 30 секунд в очистителя плазмы.
- Разогреть две конфорки при 65 ° C и 95 ° C, соответственно, для последующего процесса выпечки.
- Coat 5 г негативного фоторезиста (PR) на очищенную кремниевых пластин спиновой для нанесения покрытий; спина при 1200 оборотов в минуту (SU-8 50) в течение 30 секунд, чтобы произвести Микроканал слой.
- Поместите PRс покрытием пластины на предварительно нагретую плитке при 65 ° С в течение 12 мин, и передать его на другой предварительно разогретой конфорке при 95 ° С в течение 33 мин (за толщиной 100 мкм узоров), чтобы выполнить мягкий процесс выпечки.
- После выпечки, поместите PR покрытием кремниевой пластины на держателе полуавтоматической маски выравнивателя и выровнять его фотошаблона прозрачности в 25400 точек на дюйм разрешение.
- Проэкспонируйте PR покрытием кремниевой пластины , УФ - излучения (365 нм) в дозе 500 мДж / см 2 , чтобы создать шаблон PR на кремниевой пластине.
- Удалите пластину из выравнивателя и поместите его на плитке для пост-термообработки при температуре 95 ° С в течение 12 мин.
- Замачивание вафель в СУ-8 разработчик раствора (монометилового эфира пропиленгликоля, ацетат PGMEA), чтобы смыть несшитый PR в течение 12 мин и осторожно сухой газообразным азотом, чтобы выставить меток выравнивания.
- Опять же, пальто 5 г негативного фоторезиста на пластинах спиновой для нанесения покрытий; спина при 700 оборотах в минуту (SU-8 100) в течение 30 сек и 1200 оборотов в минуту (SU-8 10) в течение 30 секунд на 300 &# 181; м толстый образец и 27 мкм соответственно модели, чтобы сделать микролуночные слой.
- Поместите пластину PR, нанесенными на плитке при 65 ° С в течение 4 мин и при 95 ° С в течение 8 мин (в течение 27 мкм глубокий слой снимаемого хорошо); и при температуре 65 ° С в течение 40 мин и при 95 ° С в течение 110 мин (для глубокого слоя культуры, а 300 мкм).
- После охлаждения поместите PR покрытием кремниевой пластины на маске выравнивателя, оборудованного УФ-светом.
- Проэкспонируйте PR покрытием кремниевой пластины для УФ - света (365 нм) в дозе 250 мДж / см 2 (для 27 мкм толщиной образца) и 700 мДж / см 2 (для 300 мкм толщиной образца).
- Испечь вафли при температуре 95 ° С в течение 5 мин (27 мкм толщиной образца) и 30 мин (300 мкм толщиной образца), соответственно.
- Смыть несшитый PR в PGMEA в течение 6 мин (27 мкм толщиной образца) и 25 мин (300 мкм толщиной образца), соответственно, а затем высушить их газообразным азотом.
- Измерьте высоту модели функции навафля с помощью сканирующего лазерного профилометра путем размещения пластины на ху стадии сканирующего лазерного профилометра.
- Регулировка фокальной плоскости, чтобы четко показать рисунок особенности на пластине с помощью режима наблюдения "обзора камеры" под 20X объектива.
- Переключение режима наблюдения с "точки зрения" камеры для "лазерного зрения", и установить верхние и нижние положения особенностей.
- Установите режим измерения, площадь, качество и Z-поле вплоть до прозрачного (сверху), 1 линия (1,024 х 1), высокой точностью и 0,5 мкм соответственно, а затем нажмите нижнюю Старт, чтобы начать измерение.
2. Подготовка PDMS устройств для изоляции одноклеточные
- Перед тем как литье PDMS, silanize мастер-формы с трихлорсилана, чтобы создать гидрофобную поверхность, что делает его легче слезть PDMS реплики из основных форм.
- Поместите мастер-формы и весовой лодку, содержащую200 мкл трихлорсилана в эксикаторе и применять вакуум (-85 кПа) в течение 15 мин.
- Прекратить вакуум, а затем оставить мастер формы в эксикаторе до silanize мастер-формы при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
- Удалите мастер-формы из эксикаторе и поместить каждую основную форму в 10 см чашку Петри.
- Смешайте общее количество 17.6 г ПДМС полимерного комплекта, содержащего основание и отвердитель в соотношении 10: 1, а затем залить PDMS на мастер-формы в чашке Петри.
- Поместите чашку Петри в эксикаторе и применять вакуум (-85 кПа) в течение 1 ч для удаления пузырьков воздуха в PDMS.
- Удалите чашку Петри из эксикаторе и поместить его в обычной печи при температуре 65 ° С в течение 3 - 6 ч, чтобы вылечить PDMS.
- Удалите отвержденного PDMS реплики из основных форм и пробивать два отверстия как вход и выход на обоих концах микроканала на захвате ну массива PDMS реплики с помощью перфоратора с внутренним диаметром-0.75 мм для струйного канала (фиг.2А).
- Используйте ленту, чтобы очистить поверхность реплик PDMS, а затем поместить реплики PDMS в очистителя плазмы для кратковременного лечения кислородной плазмы (100 Вт в течение 14 секунд).
- Удаление реплик PDMS из кислородной плазмы машины.
- Совместите верхнюю часть (содержащую миропланшет захвата) и нижний слой PDMS (содержащие лунках культура) реплику вручную под стереомикроскопа и привести их в контакт.
- Поместите выровненные PDMS репликами в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 24 часов для достижения постоянного сцепления между PDMS репликами с образованием конечного устройства.
- Замочите устройство PDMS в деионизированной (DI) -Water заполненного контейнера и поместите контейнер в эксикаторе под вакуумом (-85 кПа) в течение 15 мин, чтобы удалить воздух из микроканала устройства PDMS.
- Поместите DI заполненный водой устройство PDMS в капот культуры ткани и использовать УФ-излучения (длина волны света: 254 нм), чтобы стерилизовать устройства для 30 мильп.
- Заменить DI воды в устройстве PDMS с 5% бычьего сывороточного альбумина в (BSA) в растворе 1X PBS и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин, чтобы предотвратить клетки от прилипания к поверхности PDMS.
Примечание: Покрытие БСА имеет решающее значение для повышения эффективности передачи изолированных клеток от захвата-хорошо к культуре-хорошо. - Заменить 5% раствор БСА в устройстве PDMS стерильным раствором 1x PBS.
3. Получение одноклеточные Подвеска
- Культура нейрональных стволовых клеток KT98 и А549 карциномы человека клеток и MDA-MB-435 у нас в чашке Петри в обычных клеточных культур инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 и 95% влажности) для подготовки клеток для эксперимента ПДМС клеточного устройства ,
- Удаляют использованную питательную среду (DMEM базальной среды, подаваемой с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотиков) из культуральной чашки с клетками, выращиваемых до 70 - 80% слияния.
- Осторожно промыть клетки с стерилизованных PBS три раза. </ Li>
- Удаляют PBS, и добавьте 2 мл рекомбинантного фермента смеси с протеолитическими, коллагенолитических и деятельности ДНКазы (смотрите в список материалов для получения подробной информации).
- Выдержите культуры блюдо при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем нажмите культуры блюдо для облегчения открепления клеток.
- Добавляют 4 мл стерилизованного PBS, чтобы разогнать клетки, а затем передачи клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку.
- Центрифуга трубки при 300 х г в течение 3 мин и удалить супернатант.
- Аккуратно ресуспендируют осадок клеток в 1 мл стерилизованной PBS и подсчитать количество живых клеток с использованием стандартного трипанового синего метод исключения 13.
Примечание: Этот шаг взмучивания имеет решающее значение для подготовки хорошо диссоциирует одной клеточной суспензии для повышения эффективности изоляции одноклеточных.
4. Изоляция Одноклеточный и Клональный Культура
- Нагрузка 50 мкл суспензии клеток в концентрации 2,2 - 2,5 х10
- Загрузить еще 50 мкл клеточной суспензии через входное отверстие, чтобы равномерно заполнить весь микроканал с клетками.
- Уплотнение выходное отверстие с пробкой (длинный 3 мм, 1 мм в диаметре вырезать нейлоновой леской), чтобы избежать потока, индуцированный гидростатическим давлением из капель на впускных и выпускных отверстий.
Примечание: Пробки были УФ стерилизовать внутри тканевой культуры капот перед использованием. - Залить 1 мл стерильного шприца с культуральной средой, извлечь пузырьки воздуха из него, и установить его на шприцевой насос.
- Подключение носителя загружен шприц к впускному отверстию устройства PDMS через 23 G тупой иглой и поли-tetrafluoroethene (PTFE) трубки.
- Выньте вилку из выпускного отверстия и всевл интервал времени 2-мин, чтобы позволить клеткам оседать в одноклеточных захвата скважин под действием силы тяжести.
- Смывают Неуловленные клетки с 300 мкл культуральной среды, при скорости потока 600 мкл / мин с приводом от шприцевой насос.
- Подождите в течение 2 мин, чтобы стабилизировать устройство, и уплотнение впускного и выпускного отверстия с заглушками, чтобы сформировать замкнутую систему культуры.
- Переверните устройство вручную, чтобы передать захваченные одиночные клетки в лунках культуры.
- Поместите устройство PDMS в 100-мм блюдо культуры ткани в, и добавляют 10 мл стерильного PBS вокруг устройства, чтобы избежать культуральной среде испарения с микроканала.
- Перемещение культуры блюдо с обычной клеточной культуры инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 и 95% влажности) для клональной культуры одноленточного клеток.
5. Культура Средняя Пополнение запасов
- После того, как 1 г культуры, заменить культуральную среду, в устройстве PDMS со свежей средой для улучшения клеточной PRoliferation.
- Место две капли культуральной среды на верхней части устройства PDMS вблизи впускного и выпускного отверстий областей, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в микроканале при выполнении следующего шага.
- Удар два отверстия из верхней части устройства PDMS вблизи двух концов микроканала в качестве впускного и выпускное отверстие для микроканала.
Примечание: Не пробивать целых два слоя PDMS устройства; вместо этого, просто удар через верхний слой из PDMS. - Подключите пластиковый шприц, содержащий 1 мл свежей среды на входе через 23 G тупой иглой и PTFE трубки.
- Поток 120 мкл свежей среды в устройство в течение 5 мин, чтобы заменить старый носитель.
- Вставьте две заглушки для герметизации впускных и выпускных отверстий, и вернуть устройство в культуре клеток инкубатора.
- Обновить культуральной среды каждые 2 D в течение периода культуры путем удаления заглушек, а затем, повторяя шаги 5.4 до 5.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микрожидкостных платформа для изоляции и культуры одноклеточной содержит микроканале (200 мкм в высоту) с двумя наборами микролуночные массивов (рис 2А). Два набора микролуночные массивов, называются захвата-луночные (25 мкм в диаметре и 27 мкм по глубине) и культуры-луночные (285 мкм в диаметре и в глубину 300 мкм) для выделения одной клетки и культуры, соответственно, и каждый захват-хорошо расположен в центре культуральную-хорошо , когда видно из виду сверху (Фигура 2В). Для работы устройства (схема последовательность операций показана на рисунке 1), необходимого оборудования (шприцевого насоса, тканевой культуры инкубатор, и микроскопов) и расходных материалов (шприц, пипетки и трубки), как правило , доступны в биологических лабораториях. Кроме того, портативность и прозрачность платформы позволило клеткам легко наблюдать и анализировать в устройстве с CONVENного микроскопа в ходе эксперимента клеточной культуры.
Эффективность захвата клеток в захвате скважин после стадии промывки находится в пределах от 67,80 ± 11,38% до 85,16 ± 1,91% ( в зависимости от типа клеток) (рис 3А). Кроме того, большая часть захвата скважин содержат только одну ячейку для всех трех типов клеток (89,89% - 92,98%), что было подтверждено путем анализа количества загруженных клеток в культуре скважин (рис 3B). Конечная эффективность изоляции отдельных клеток в культуре скважин составила более 76% для KT98 и клеток MDA-MB-435, но только 61% для А549 клеток из-за различия в размерах клеток среди протестированных клеточных типов.
Для исследования рака, клоногенности одиночных клеток могут быть использованы для тестирования устойчивости к лекарственным средствам и скорость пролиферации отдельных колоний клеток. Культуры клеток и клоногенному анализ выделенных одиночных клеток в нашем рlatform были проведены путем обновления культуральной среды через каждые 2 д. Эта демонстрация выдвигает на первый план вопрос о применимости этого устройства для изучения клеточного гетерогенность на уровне одной клетки путем измерения различий в выживаемости клеток и скорости пролиферации отдельных клеток.
Клеточная скорость гетерогенность и пролиферации выделенных клеток были проанализированы с расходными полученных изображений. Результаты показали, что выделенные отдельные клетки могут быть культивированы в течение 7 дней и выставлены различные модели роста. Например, 13% из выделенных клеток не было деление клеток и оставался в одной единственной клетки (фиг.4В), в то время как 17,5% клеток разделены на более чем 15 клеток и образованных колоний клеток (рис 4А) во время культивирования. Клеточная гетерогенность среди пролиферирующих клеток свидетельствует также их различных моделей роста формирования двух ячеек (4,3%), три ячейки (2,5%), а также 4 - 14 клеток(15%) в культуре клеток эксперимента (фиг.4С).
Эти результаты показали, что платформа может быть использована для длительной культуре клеток, клоногенные анализов и исследований клеточных гетерогенности. Наличие большого количества отдельных колоний клеток, выращенных на небольшой площади пятна контакта также делает микроскопический анализ клеток легче.
. Рисунок 1. Схематическое изображение операции потока для изоляции высокой пропускной способностью одноклеточных и культуры в микрожидкостных платформы Процедура операции для выделения одноклеточных и клональной культуры включает в себя 4 этапа: I) нагрузки клеток в микроканале с пластиковым наконечником и ручной пипеткой; II) смыть Неуловленные клетки свежей культуральной средой с приводом от шприцевой насос; III) после герметизации впускного и выпускного отверстия с заглушками, то естьolated клетки переносили из захвата скважин к культуре скважин, перевернув устройство; и IV) выполняют клонального культуру (клоногенности) в культуре скважин. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Фотография и СЭМ изображения микрожидкостных изоляции и культивирования одноклеточных платформы. (A) Микрожидкостных платформа загружается с красным красителем , который показывает Микроканал и микрострипы структуры для одноклеточного культуры. (B) представитель изображение , полученное из вырезанной устройства, показывающий вид сбоку трех изоляции и клональной культуры единиц одноклеточных в микрожидком платформе. Шкала бар: 100 мкм. СЭМ изображения культуры одноклеточных (С) и (D захвата Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. KT98, A549 и MDA-MB-435 Эффективность изоляции одноклеточных в микрожидком платформе. (А) Эффективность KT98, A549 и MDA-MB-435 клеток захватили в захвате скважин после того, как смывая Неуловленные клетки , Эффективность захвата клеток была от 67.80% до 85,16% в трех типах клеток. (B) Соотношение одноклеточных в общей культуре скважин (слэш бар) составил более 76% для KT98 и MDA-MB-435, но 61,63% для А549. (C) представитель изображение отдельных KT98 одиночных клеток(Красный, окрашивали клетки трекера) выделяют в больших культур скважин для клонального культуры. Шкала бар: 300 мкм. (D) Число клеток в клеточных культур занимают скважин модели KT98 клеток. Соотношение культуры скважин составил 77,3% с одной ячейкой, 16,31% без каких-либо клеток, 5,96% с двумя клетками, и 0,43%, причем более трех ячеек. Столбики ошибок представлены в виде ± SD. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Клеточные культуры, клоногенности, и клеточная исследование гетерогенность изолированных клеток А549 в микрожидком платформе в течение 7 дней. (А) Изолированная одноклеточного росла и пролиферируют в клеточной колонии в культуре, хорошо. (B) Выделенная одноклеточного выжил, но не делил, через 7 сутоккультуры. Шкала бар: 100 мкм. (C) Выделенные одноядерные клетки экспонируются гетерогенные модели роста после того , культивировали в течение 7 дней. Столбики ошибок представлены в виде ± SD. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Системы устройств Микропланшетные на основе 6,14 были использованы для манипулирования одноклеточных и анализа, такие как крупномасштабной одной клетки захвата 6 и пролиферации одного гемопоэтических стволовых клеток 15. Несмотря на то, также размер, количество и форма могут быть приспособлены для конкретных применений, эффективность изоляции одноклеточного всегда под угрозу , когда размер скважины увеличивается. 9,15
Чтобы преодолеть это ограничение, Парк и др. Сообщили микрожидком чип с треугольными лунках , которые имеют высокий одной ячейки пленения скорости (58,34%), в то время как размер Микропланшетная увеличивается , чтобы обеспечить ячейку распространения и роста. Тем не менее, Микролунки (с длиной стороны ~ 50 мкм) , может поддерживать только пролиферацию клеток в течение до 2 сут. 16 Наша стратегия двойного хорошо позволяет загружать одноклеточного в больших лунках , чтобы не быть ограничено вероятностью Пуассона распределение встречается в ограничении diluметоды Тион и открытые системы также 3, как показано, обеспечивая высокую эффективность изоляции одноклеточных (более 75%) в больших лунках, размер которых был достаточным для пролиферации клеток , по крайней мере , 7 г (рис. 4а) Благодаря своей способности с высокой эффективностью выполнять изоляцию одноклеточных и клонального культуру с помощью простого устройства и процедуры работы, мы предполагаем , что наша Микрожидкостных платформа может стать полезным инструментом для широкого спектра применений, включая выбор раковых стволовых клеток путем клоногенности 17 и с высокой пропускной способностью кардиотоксичности скрининг препаратов 18,19.
Основным ограничением нашей изоляции и культуры платформы одноклеточного является то, что она не образует отдельный запорный клапан культуры колодцев для предотвращения перекрестных помех между клетками, культивируемыми в культуре скважин. Таким образом, поведение клеток могут влиять паракринной секреции других изолированных одиночных клеток в микрожидкостных устройств. ВЗее ограничение нашей платформы является необходимость подготовки относительно клеточной суспензии высокой плотности для изоляции одноклеточного высокой эффективностью. Это высокое потребление клеток может ограничить применение редких выделения клеток и культуры, таких как водные юмор клеток.
До работы устройства, важно, чтобы впрыснуть ДИ воды из впускного отверстия для заполнения Микроканал и тщательно наблюдать любую утечку жидкости из связанного устройства PDMS. Утечка жидкости влияет на состояние потока в микроканале, таким образом, может негативно повлиять на захват клеток и передачи результата. Кроме того, хотя наши результаты эффективности нагрузка одноклеточного исследования показывают очень низкую потерю клеток после переноса изолированных клеток от захвата скважин к культуре скважин, указывая, что большинство клеток могут быть эффективно переданы, перевернув устройство, эффективность передачи уменьшается, если этап блокирования БСА (2.12) не выполняется должным образом. Пользователи могут изменять протокол блокировки БСА или использовать альтернативой методы модификации поверхности для их специфических потребностей клеточного эксперимента (например, увеличение концентрации БСА или покрытия время , когда используется более приверженцем тип клеток). Размеры клеток захвата скважин являются доминирующими факторами, которые должны быть оптимизированы для лучшей эффективности загрузки одноклеточного в захвате скважин, в зависимости от размера конкретного типа клеток, представляющих интерес. Высокие множественные-клетки-в снимаемого скважины события происходят из-за имеющих размер захвата также слишком большой для данного типа клеток, представляющих интерес, в то время как низкая эффективность нагрузки сотовой ячейки в скважине захвата является показателем размера захвата благополучия слишком маленький. Кроме того, важно, чтобы свести к минимуму клеточных кластеров в приготовленную суспензии отдельных клеток, а клеточные кластеры могут снизить эффективность одноклеточного нагрузки в захвате скважин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
