Introduction
Attualmente posizionando le celle singole singolarmente in uno spazio culturale è comunemente raggiunto utilizzando la diluizione limitando o cella a fluorescenza-attivato (FACS). Per molti laboratori, diluizione limite è un metodo conveniente, in quanto richiede solo una pipetta e piastre di coltura di tessuto, che sono prontamente disponibili. In questo caso, una sospensione cellulare viene diluito serialmente ad una densità cellulare appropriata, e quindi posto in pozzetti di coltura utilizzando una pipetta manuale. Queste cellule singoli compartimenti sono poi utilizzati per l'analisi delle cellule, come ad esempio lo screening eterogeneità genetica 1 e colonia di formazione 2. Tuttavia, questo metodo è basso throughput e intensità di lavoro, senza utilizzare un braccio robotico per l'assistenza, perché la natura distribuzione di Poisson del metodo di diluizione limitante limita eventi monocellulari ad una probabilità massima del 37% 3. macchine FACS con un braccio robotico integrato in grado di superare la limitazione della distribuzione di Poisson con precisione placing una singola cella in una cultura ben alla volta 4. Tuttavia, l'elevato sforzo di taglio meccanico (quindi abbassato vitalità cellulare) 5 ed acquisto della macchina e dei costi operativi hanno limitato il suo utilizzo in molti laboratori.
Per superare le limitazioni di cui sopra, i dispositivi microscala sono stati sviluppati per caricare altamente efficiente singole cellule nei pozzetti 6. Tuttavia, i pozzetti non forniscono spazio sufficiente per le cellule caricate a proliferare, a causa della necessità di rendere le dimensioni di ciascun pozzetto vicino a quello di una singola cella di massimizzare il carico probabilità cella singola. Come test di cultura sono necessari in molte applicazioni basati su celle (ad esempio, test clonogenica 7), pozzetti più grandi (90-650 micron di diametro o in lunghezza del lato) sono stati utilizzati per consentire colture cellulari estesi. Tuttavia, come il metodo di diluizione limitante, possiedono anche bassi singole efficienze di carico delle cellule, che vanno da 10 -. 30% 8, 9
In precedenza, abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica high-throughput per isolare singole cellule nei singoli pozzetti e dimostrare la sua applicazione nel saggio clonogenica delle cellule isolate. 10 Il dispositivo è stato realizzato con poli-dimetilsiloxano (PDMS), e comprende due serie di array di pozzetti con differenti formati micropozzetti, che può sostanzialmente migliorare l'efficienza nel caricare una singola cella in un micropozzetto cui dimensione è significativamente più grande della cella. In particolare, questo concetto "dual-well" permette la dimensione dell'area culturale di regolare in modo flessibile senza compromettere l'efficienza di cattura cella singola, rendendo semplice per regolare la progettazione del dispositivo per soddisfare diversi tipi di cellule e applicazioni. Questo metodo ad alta efficienza dovrebbe essere utile per esperimenti di coltura cellulare a lungo termine per gli studi eterogeneità delle cellule e monoclonale stabilimento linea cellulare.
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Protocol
Nota: I disegni fotomaschere per la nostra fabbricazione di dispositivi microfluidica sono stati elaborati utilizzando un software di progettazione assistita da computer (CAD). I disegni sono stati poi utilizzati per fabbricare fotomaschere Chrome con un servizio commerciale. I dispositivi PDMS sono state effettuate utilizzando tecniche di litografia morbide. 11
1. Realizzazione di Maestro Stampi per litografia
- Prima che il processo di fotolitografia 12, utilizzare i wafer di silicio da 4 pollici come substrato e disidratare i wafer in un forno convenzionale a 120 ° C per 10 min.
- Pulire i wafer di silicio disidratati mediante trattamento al plasma di ossigeno a 100 watt per 30 secondi in un pulitore plasma.
- Preriscaldare due piastre a 65 ° C e 95 ° C, rispettivamente, per il seguente processo di cottura.
- Cappotto 5 g di photoresist negativo (PR) sui wafer di silicio pulite da un dispositivo a induzione di spin; centrifuga a 1200 rpm (SU-8 50) per 30 sec per produrre lo strato di microcanali.
- Posizionare il PRrivestito wafer su una piastra preriscaldato a 65 ° C per 12 min e trasferirlo in un'altra piastra preriscaldato a 95 ° C per 33 min (per 100 micron di spessore modelli) per eseguire un processo di cottura morbida.
- Dopo la cottura, posizionare il wafer di silicio rivestito PR sul supporto di una maschera allineatore semi-automatico e allinearlo a una trasparenza fotomaschera 25.400 dpi di risoluzione.
- Esporre il rivestito PR wafer di silicio a luce UV (365 nm) ad una dose di 500 mJ / cm 2 per creare il modello PR sul wafer di silicio.
- Rimuovere il wafer dal allineatore e posizionarlo su una piastra per la post-cottura a 95 ° C per 12 min.
- Mettere a bagno i wafer di SU-8 sviluppatore della soluzione (glicole propilenico monometiletere acetato, PGMEA) per lavare via PR non reticolato per 12 min e asciugare delicatamente con azoto per esporre i segni di allineamento.
- Ancora una volta, cappotto 5 g di fotoresist negativo sui wafer da un coater centrifuga; centrifuga a 700 rpm (SU-8 100) per 30 sec e 1.200 rpm (SU-8 10) per 30 sec per 300 &# 181; m modello di spessore e 27 micron modello di spessore, rispettivamente, per rendere lo strato micropozzetto.
- Posizionare il wafer PR rivestito su una piastra riscaldante a 65 ° C per 4 min ed a 95 ° C per 8 min (per 27 micron strato profondo cattura-well); ed a 65 ° C per 40 minuti ea 95 ° C per 110 min (per 300 micron strato profondo cultura-well).
- Dopo raffreddamento, posizionare il wafer di silicio rivestito PR sul allineatore maschera dotata di luce UV.
- Esporre il rivestito PR wafer di silicio alla luce UV (365 nm) ad una dose di 250 mJ / cm 2 (per 27 micron di spessore pattern) e 700 mJ / cm 2 (per 300 micron di spessore pattern).
- Cuocere i wafer a 95 ° C per 5 min (27 micron di spessore pattern) e 30 min (300 micron di spessore pattern), rispettivamente.
- Lavare il PR non reticolato dal PGMEA per 6 min (27 micron di spessore pattern) e 25 min (300 micron di spessore pattern), rispettivamente, e poi asciugare con azoto.
- Misurare l'altezza del modello dispone suil wafer con un profilometro scansione laser posizionando il wafer sul xy fase di un profilometro laser a scansione.
- Regolare il piano focale per mostrare chiaramente il modello presenta sul wafer utilizzando la modalità di osservazione "telecamera" sotto una lente obiettivo 20X.
- Cambiare la modalità di osservazione da "telecamera" a "vista laser", e impostare le posizioni superiori ed inferiori delle caratteristiche.
- Impostare la modalità di misurazione, zona, la qualità, e Z-passo fino a trasparente (in alto), 1 linea (1.024 x 1), ad alta precisione e 0,5 micron, rispettivamente, e quindi premere il fondo di partenza per iniziare la misurazione.
2. Preparazione di dispositivi PDMS per l'isolamento Single-cell
- Prima di PDMS casting, silanizzare gli stampi di perfezionamento con triclorosilano per creare una superficie idrofobica, che rende più facile per staccare il PDMS repliche dagli stampi maestri.
- Mettere gli stampi master e una barca ponderazione contenente200 ml di triclorosilano in essiccatore e applicare il vuoto (-85 kPa) per 15 min.
- Arrestare il vuoto e poi lasciare gli stampi di master in un essiccatore per silanizzare gli stampi maestri a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Rimuovere gli stampi maestri dal essiccatore e posizionare ogni stampo master in un 10 centimetri Petri.
- Mescolare un totale di 17,6 g di polimero kit PDMS contenente una base e un agente indurente in un rapporto di 10: 1, e quindi versare il PDMS sullo stampo master nel piatto Petri.
- Posizionare la piastra di Petri in un essiccatore e applicare il vuoto (-85 kPa) per 1 ora per rimuovere le bolle d'aria nei PDMS.
- Rimuovere la piastra di Petri dal essiccatore e metterla in un forno tradizionale a 65 ° C per 3-6 ore per curare il PDMS.
- Rimuovere le repliche PDMS indurito dagli stampi master e perforare due fori come un ingresso e una uscita alle due estremità del microcanale sull'array PDMS replica capture-bene da un perforatore con interno-diametro di 0.75 mm per il canale fluidica (Figura 2A).
- Utilizzare nastro per pulire la superficie delle repliche PDMS, e quindi posizionare le repliche PDMS un detersivo plasma per breve trattamento al plasma di ossigeno (100 watt per 14 sec).
- Rimuovere le repliche PDMS dalla macchina plasma di ossigeno.
- Allineare un top (contenente i pozzetti di cattura) e un PDMS fondo (che contengono i pozzetti di coltura) replica a mano allo stereomicroscopio e metterli in contatto.
- Posizionare i PDMS repliche allineate in un forno a 65 ° C per 24 ore per ottenere l'unione permanente tra le PDMS repliche per formare il dispositivo finale.
- Bagnare il dispositivo PDMS in un deionizzata (DI) -acqua contenitore riempito e posizionare il contenitore in un essiccatore sotto vuoto (-85 kPa) per 15 minuti per eliminare l'aria dalla microcanali del dispositivo PDMS.
- Posizionare il dispositivo PDMS piena d'acqua DI in una cappa coltura tissutale e utilizzando luce UV (lunghezza d'onda: 254 nm) per sterilizzare il dispositivo per 30 min.
- Sostituire l'acqua deionizzata nel dispositivo PDMS con un siero albumina bovina 5% (BSA) in soluzione PBS 1x e incubare a 37 ° C per 30 minuti per impedire alle cellule di attaccarsi alla superficie PDMS.
Nota: Il rivestimento BSA è essenziale per migliorare l'efficienza di trasferimento di cellule isolate dalla cattura pozzetti per coltura pozzetti. - Sostituire la soluzione BSA 5% nel dispositivo PDMS con una soluzione di PBS 1x sterilizzata.
3. Preparazione di cella singola sospensione
- Culture Neural staminali KT98 cella e A549 cellule di carcinoma umano MDA-MB-435 che in piastra di Petri in coltura cellulare convenzionale incubatore (37 ° C, 5% di CO 2, e 95% di umidità) per preparare le cellule per l'esperimento PDMS cella periferica .
- Rimuovere e scartare il terreno di coltura esaurito (DMEM medio basale in dotazione con il 10% di siero fetale bovino e 1% di antibiotici) dal piatto di coltura con cellule coltivate a 70 - 80% di confluenza.
- Lavare delicatamente le cellule con sterilizzati PBS per tre volte. </ Li>
- Rimuovere e scartare il PBS e aggiungere 2 ml di una miscela di enzimi proteolitici ricombinante con, collagenolitica, e le attività di DNasi (si veda l'elenco dei materiali per le informazioni dettagliate).
- Incubare il piatto cultura a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi toccare il piatto cultura per facilitare il distacco delle cellule.
- Aggiungere 4 ml di PBS sterile per disperdere le cellule, e poi trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml.
- Centrifugare la provetta a 300 xg per 3 min e rimuovere il surnatante.
- Risospendere delicatamente il pellet di cellule in 1 ml sterilizzati PBS e contare il numero di cellulare dal vivo con il metodo standard di esclusione Trypan Blue 13.
Nota: questo passaggio risospensione è fondamentale per la preparazione di ben dissociato-cella singola sospensione per migliorare l'efficienza di isolamento cella singola.
4. Isolamento Single-cell e cultura clonale
- Carico 50 ml di sospensione cellulare ad una concentrazione di 2,2 - 2.5 x10
- Caricare altri 50 ml di sospensione cellulare attraverso il foro di ingresso per riempire in modo uniforme l'intero microcanali con cellule.
- Sigillare il foro di uscita con un tappo (a lunghezza 3 mm, 1 mm di diametro nylon taglio lenza) per evitare il flusso indotto dalla pressione idrostatica dalle goccioline di fori di ingresso e di uscita.
Nota: le spine erano UV sterilizzato all'interno di una cappa coltura tissutale prima dell'uso. - Riempire una siringa da 1 ml sterile con terreno di coltura, espellere le bolle d'aria da esso, e impostarlo su una pompa a siringa.
- Collegare il supporto caricato siringa al foro di ingresso del dispositivo PDMS tramite un ago G smussata 23 ed una poli-tetrafluoroethene tubazione (PTFE).
- Togliere la spina dalla presa di corrente e tutto il foro diow un intervallo di tempo di 2 minuti per consentire alle cellule di stabilirsi nella cella singola cattura-pozzi di forza gravitazionale.
- Lavare via le cellule non catturate con 300 ml di terreno di coltura ad una portata di 600 ml / min spinto dalla pompa a siringa.
- Attendere 2 minuti per stabilizzare il dispositivo, e sigillare i fori di ingresso e di uscita con spine per formare un sistema di coltura chiuso.
- Capovolgere il dispositivo a mano per trasferire i catturati singole cellule ai pozzetti di coltura.
- Posizionare il dispositivo PDMS in un piatto di coltura di tessuti da 100 mm, e aggiungere 10 ml di PBS sterile intorno al dispositivo per evitare l'evaporazione cultura media dal microcanali.
- Spostare il piatto cultura di un incubatore tradizionale coltura cellulare (37 ° C, 5% di CO 2, e 95% di umidità) per la cultura clonale delle singole cellule.
5. terreno di coltura Replenishment
- Dopo 1 d della cultura, sostituire il terreno di coltura nel dispositivo PDMS con terreno fresco per migliorare pr celluleoliferation.
- Inserire due gocce di mezzo di coltura sulla parte superiore del dispositivo PDMS vicino alle aree fori di ingresso e di uscita per evitare l'introduzione di bolle d'aria nel microcanale durante l'esecuzione della fase successiva.
- Punch due fori dalla parte superiore del dispositivo PDMS prossimità delle due estremità del microcanale come un ingresso e un'uscita per il microcanali.
Nota: non perforare attraverso l'intero due strati del dispositivo PDMS; invece, proprio pugno attraverso lo strato superiore delle PDMS. - Collegare una siringa di plastica da 1 ml contenente mezzo fresco per l'ingresso attraverso un ago G smussata 23 e tubi in PTFE.
- Portata media 120 microlitri fresca nel dispositivo per 5 minuti per sostituire il vecchio mezzo.
- Inserire due tappi per sigillare entrata e uscita fori, e restituire il dispositivo per l'incubatore di coltura cellulare.
- Aggiornare il terreno di coltura ogni 2 d durante il periodo di coltura rimuovendo le spine di tenuta, seguito ripetendo i punti 5.4 al 5.5.
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Representative Results
La piattaforma microfluidica per l'isolamento e la coltura singola cella comprende un microcanale (200 micron di altezza) con due serie di matrici di micropozzetti (Figura 2A). Le due serie di array di pozzetti sono definiti come la cattura-bene (25 micron di diametro e 27 micron di profondità) e la cultura-bene (285 micron di diametro e 300 micron di profondità) per l'isolamento a cella singola e cultura, rispettivamente, e ogni cattura-well è posizionata al centro di una cultura del bene quando visto dalla vista dall'alto (figura 2B). Per il funzionamento del dispositivo (il flusso operativo schema è illustrato in Figura 1), l'apparecchiatura necessaria (pompa a siringa, coltura tissutale incubatore e microscopi) e accessori (siringa, pipetta, e tubature) sono comunemente disponibili in laboratori biologici. Inoltre, la portabilità e la trasparenza della piattaforma permesso alle cellule di essere facilmente osservati e analizzati in un dispositivo con una convenmicroscopio tional durante l'esperimento di coltura cellulare.
L'efficienza di cattura delle cellule nella cattura-pozzi dopo gli intervalli fase di lavaggio da 67.80 ± 11.38% al 85.16 ± 1,91% (a seconda del tipo di cellula) (Figura 3A). Inoltre, la maggior parte delle cattura-pozzetti contengono solo una singola cella per i tre tipi di cellule (89.89% - 92.98%), che è stato confermato analizzando il numero di cellule caricate nella cultura-pozzetti (Figura 3B). La finale efficienza isolamento cella singola nella cultura pozzi era più del 76% per KT98 e MDA-MB-435 cellule, ma solo il 61% per le cellule A549 a causa di differenze di dimensione delle cellule tra i tipi cellulari testate.
Per la ricerca sul cancro, test clonogenica di singole cellule può essere utilizzato per testare la resistenza ai farmaci e tassi di proliferazione di colonie di cellule individuali. La coltura cellulare e saggio clonogenica dei isolate singole cellule nel nostro platform sono stati condotti aggiornando il terreno di coltura ogni 2 d. Questa dimostrazione evidenzia l'applicabilità di questo dispositivo per studiare l'eterogeneità cellulare a livello di singola cellula, misurando le differenze nella sopravvivenza delle cellule e tassi di proliferazione di singole celle.
L'eterogeneità e la proliferazione tasso di cellulare delle cellule isolate sono stati analizzati da immagini daily-acquisite. I risultati hanno mostrato che le cellule isolate singoli possono essere coltivati per 7 d ed esposti diversi modelli di crescita. Ad esempio, il 13% delle cellule isolate aveva divisione cellulare e rimasto come una singola cellula (Figura 4B), mentre il 17,5% delle cellule diviso in più di 15 celle e colonie di cellule formate (Figura 4A) durante la coltura. eterogeneità cellulare tra le cellule proliferanti è stata evidenziata anche dai loro diversi modelli di crescita di formare due cellule (4,3%), tre celle (2,5%), e 4 - 14 celle(15%) nell'esperimento coltura cellulare (Figura 4C).
Questi risultati indicano che la piattaforma può essere utilizzato per la coltura a lungo termine di cellule, prove clonogeniche e studi eterogeneità cellulare. Avere un gran numero di singole colonie di cellule coltivate in una piccola area ingombro rende anche l'analisi microscopica delle cellule più facile.
. Figura 1. Schema di flusso operativo per l'isolamento cella singola high-throughput e della cultura nella piattaforma microfluidica La procedura operativa per l'isolamento a cella singola e cultura clonale comprende 4 fasi: i) le celle di carico nel microcanali con una punta di plastica e pipetta manuale; ii) lavare via le cellule non catturate con terreno fresco azionato da una pompa a siringa; iii) dopo la sigillatura delle aperture di ingresso e di uscita con le spine, il ècellule olated sono stati trasferiti dalla cattura-pozzi alla cultura-pozzi girando il dispositivo; e iv) eseguire cultura clonale (test clonogenica) Nella cultura-pozzi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. fotografia e immagini SEM della piattaforma isolamento e la coltura cella singola microfluidica. (A) piattaforma di Microfluidic caricato con colorante rosso che mostra le strutture microcanali e di pozzetti per la cultura cella singola. (B) Una immagine rappresentativa presa da un dispositivo di taglio, che mostra la vista laterale di tre isolamento e la coltura clonale unità unicellulari nella piattaforma microfluidica. barra della scala: 100 micron. Immagini SEM della cultura cella singola (C) e la cattura (D Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. KT98, A549, e MDA-MB-435 efficienza isolamento cella singola nella piattaforma microfluidica. (A) Efficienza del KT98, A549, e le cellule 435 MDA-MB-catturato in cattura-pozzi dopo aver lavato via le cellule non catturate . L'efficienza di cattura cellule era di 67.80% al 85.16% dei tre tipi di cellule. (B) Il rapporto monocellulari un totale di coltura-pozzi (bar barra) era oltre il 76% per KT98 e MDA-MB-435, ma 61.63% per A549. (C) Una immagine rappresentativa di singole cellule individuali KT98(Rosso, macchiato con l'inseguitore di cella) isolato in grandi cultura-pozzi per la cultura clonale. barra della scala: 300 micron. (D) il numero delle cellule in cellule occupata di cultura-pozzi del modello delle cellule KT98. Il rapporto tra cultura-pozzetti era 77,3% con una cella singola, 16,31% e privo di celle, 5,96% con due celle, e 0,43% con più di tre celle. Le barre di errore sono rappresentati come ± SD. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. coltura cellulare, clonogenica, e lo studio eterogeneità cellulare delle cellule A549 isolate nella piattaforma microfluidica per 7 d. (A) Un isolato a cella singola è cresciuto e proliferavano ad una colonia di cellule in coltura-bene. (B) Un isolato a cella singola è sopravvissuto, ma non si divide, dopo 7 ddella cultura. barra della scala: 100 micron. (C) Le isolate singole cellule esposte modelli di crescita eterogenei dopo essere coltivate per 7 d. Le barre di errore sono rappresentati come ± SD. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sistemi di dispositivi di pozzetti a base di 6,14 sono stati utilizzati per la manipolazione a cella singola e di analisi, come ad esempio su larga scala singola cellula intrappolando 6 e la proliferazione delle cellule staminali ematopoietiche singolo 15. Sebbene dimensioni ben, il numero e la forma può essere regolata per applicazioni specifiche, l'efficienza di isolamento singola cella è sempre compromessa quando si aumenta la dimensione del pozzo. 9,15
Per superare questa limitazione, Park ed altri. Riportato un chip microfluidico con micropozzetti triangolari che hanno un alto unicellulare trapping rate (58.34%), mentre la dimensione micropozzetto è ampliata per consentire la diffusione e la crescita cellulare. Tuttavia, i pozzetti (con la lunghezza di un lato ~ 50 micron) potrebbe supportare solo proliferazione cellulare fino a 2 d. 16 La strategia dual-well consente loading cella singola in grandi micropozzetti non sia limitata dalla probabilità di Poisson distribuzione incontrato nel limitare diluizionemetodi ei sistemi aperti e 3, come dimostrato, fornendo l'alta efficienza di isolamento singola cellula (oltre il 75%) in grandi micropozzetti cui dimensione era sufficiente per la proliferazione cellulare per almeno 7 d (Figura 4A). Grazie alla sua capacità di eseguire altamente efficiente isolamento cella singola e cultura clonale con un dispositivo semplice e procedura di funzionamento, prevediamo che la nostra piattaforma microfluidica potrebbe costituire un utile strumento per una vasta gamma di applicazioni, tra cui la selezione delle cellule staminali cancro clonogenic assay 17 e lo screening cardiotossicità high-throughput di farmaci 18,19.
Una limitazione importante della nostra piattaforma isolamento e la coltura cella singola è che non forma singolarmente chiusi cultura pozzi per evitare interferenze tra le cellule coltivate in cultura-pozzi. Pertanto, il comportamento delle cellule può essere influenzato dalla secrezione paracrina di altre isolate singole cellule nel dispositivo microfluidico. l'OTla limitazione della nostra piattaforma è la necessità di preparare relativamente sospensione cellulare ad alta densità per isolamento singola cellula alta efficienza. Questo elevato consumo di cella può limitare le applicazioni di isolamento delle cellule rare e della cultura, come le cellule acquose umorismo.
Prima del funzionamento del dispositivo, è importante iniettare acqua DI dal foro di ingresso per riempire il microcanale e osservare attentamente qualsiasi perdita di fluido dal dispositivo PDMS legato. Le perdite di fluido influisce sulla condizione di flusso in microcanali quindi potrebbe influenzare negativamente la cattura delle cellule e l'esito del trasferimento. Inoltre, anche se i nostri risultati dello studio di efficienza di carico cella singola mostrano la perdita di cellule molto basso dopo il trasferimento delle cellule isolate dalla cattura-pozzi alla cultura pozzi, che indica che la maggior parte delle cellule potrebbero essere efficacemente trasferiti girando il dispositivo, l'efficienza di trasferimento si riduce se la fase di blocco BSA (2.12) non è correttamente eseguita. Gli utenti possono modificare il protocollo BSA blocco o utilizzare almetodi ternativi la modifica della superficie per le loro specifiche esigenze di sperimentazione delle cellule (ad esempio, aumentando la concentrazione di BSA o rivestimento momento in cui si utilizza un tipo di cellula più aderente). Le dimensioni della cattura pozzi cellulari sono i fattori dominanti, che devono essere ottimizzati per la migliore efficienza di carico singola cella cattura-pozzi, a seconda delle dimensioni del tipo di cellula specifico di interesse. Alte multipli cellule-in-a-capture-well eventi sono causa di avere la dimensione di cattura ben troppo grande per il tipo cellulare di interesse, mentre bassa efficienza loading cellule nel pozzo cattura è un'indicazione della dimensione della cattura benessere troppo piccolo. E 'anche importante minimizzare gruppi di cellule in sospensione cellulare singolo preparato, come gruppi di cellule possono diminuire l'efficienza di carico cella singola nella cattura-pozzetti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
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