Introduction
Actualmente colocando células isoladas individualmente num espaço de cultura é geralmente conseguido através de diluição limitante ou de células activadas por fluorescência (FACS). Para muitos laboratórios, diluição limitante é um método conveniente, uma vez que requer apenas uma pipeta e placas de cultura de tecidos, as quais estão prontamente disponíveis. Neste caso, uma suspensão de células é diluída em série até uma densidade celular apropriada, e, em seguida, colocados em poços de cultura, utilizando uma pipeta manual. Estas células individuais compartimentados são então utilizados para análise de células, tais como heterogeneidade genética e rastreio de uma colónia de formação 2. No entanto, este método é de baixo rendimento e de trabalho intensivo, sem a utilização de um braço robótico para assistência, devido à natureza distribuição de Poisson do método de diluição limitante restringe eventos de uma única célula a uma probabilidade máxima de 37% 3. máquinas de FACS com um braço robótico integrado pode superar a limitação da distribuição de Poisson pela precisão placção de uma única célula em um poço de cultura de cada vez 4. No entanto, a alta tensão de cisalhamento mecânico (assim, reduzido a viabilidade celular) 5 e compra da máquina e os custos operacionais têm limitado o seu uso em muitos laboratórios.
Para superar as limitações acima, em microescala dispositivos têm sido desenvolvidos para carregar altamente eficiente de células individuais em micropoços 6. No entanto, os micropoços não proporcionar um espaço adequado para as células carregadas com a proliferar, devido à necessidade de tornar o tamanho de cada micropoço próximo do de uma única célula de carga para maximizar a probabilidade de uma única célula. Como são necessários ensaios de cultura em muitas aplicações baseadas em células (por exemplo, ensaio clonogénico 7), micropoços maiores (90-650 um de diâmetro ou de comprimento lateral) também têm sido utilizados para permitir a culturas celulares prolongadas. No entanto, como o método da diluição limitante, eles também possuem baixas eficiências de carga de células individuais, que variam de 10 -. 30% 8, 9
Anteriormente, nós desenvolvemos uma plataforma de microfluidos de alto rendimento para isolar células individuais em micropoços individuais e demonstrar a sua aplicação no ensaio clonogénico das células isoladas. 10 O dispositivo foi feito com poli-dimetilsiloxano (PDMS), e compreende dois conjuntos de matrizes de micropoços com diferentes tamanhos de microcavidades, que podem melhorar em grande medida a eficiência no carregamento de uma única célula em um micropoço cujo tamanho é significativamente maior do que a célula. Notavelmente, este conceito "dupla bem" permite que o tamanho da área de cultura a ser ajustada de forma flexível, sem afectar a eficiência da captação de uma única célula, tornando-a simples de ajustar o desenho do dispositivo para se adequar a diferentes tipos de células e aplicações. Este método de elevada eficiência deveria ser útil para experiências de cultura de células de longo prazo para os estudos de heterogeneidade da célula e estabelecimento linha celular monoclonal.
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Protocol
Nota: Os desenhos fotomáscara para a fabricação de dispositivos microfluídicos foram desenhadas usando um software de desenho assistido por computador (CAD). Os desenhos foram então utilizados para fabricar máscaras de crómio usando um serviço comercial. Os dispositivos PDMS foram feitas usando técnicas de litografia suave 11.
1. Fabricação de Mestre Moldes por litografia
- Antes do processo de fotolitografia 12, utilizar as bolachas de silício de 4 polegadas como um substrato e desidratar as bolachas em um forno convencional a 120 ° C durante 10 min.
- Limpar as bolachas de silício desidratados usando oxigénio tratamento com plasma a 100 watts durante 30 segundos em um aspirador de plasma.
- Pré-aqueça duas placas a 65 ° C e 95 ° C, respectivamente, para o seguinte processo de cozimento.
- Brasão de 5 g de fotorresiste negativo (PR) sobre as pastilhas de silício limpo por um revestidor de rotação; de centrifugação a 1.200 rpm (SU-8 de 50) durante 30 segundos para produzir a camada de microcanais.
- Coloque o PRrevestidos bolacha numa placa de aquecimento pré-aquecido a 65 ° C durante 12 min e transferi-lo para uma outra placa de aquecimento pré-aquecido a 95 ° C durante 33 min (para os padrões de 100 um de espessura) para executar um processo de cozer macio.
- Após o cozimento, coloque a pastilha de silício PR revestido sobre o titular de um alinhador semi-automatizado máscara e alinhá-lo a um photomask transparência 25.400 dpi de resolução.
- Expor a bolacha de silício revestido de RP à luz UV (365 nm) a uma dose de 500 mJ / cm 2 para criar o padrão de PR na bolacha de silício.
- Remova o wafer do alinhador e colocá-lo numa placa de aquecimento para pós-cozimento a 95 ° C por 12 min.
- Mergulhe as bolachas em SU-8 desenvolvedor de soluções (acetato de éter propilenoglicol monometílico, PGMEA) para lavar PR não reticulada de 12 min e secar delicadamente com azoto para expor as marcas de alinhamento.
- Mais uma vez, revestimento 5 g de fotorresiste negativo sobre as bolachas por um revestidor de rotação; rotação de 700 rpm (SU-8 100) durante 30 segundos e 1.200 rpm (SU-8 10) por 30 s para 300 &# 181; m padrão de espessura e 27 mm padrão de espessura, respectivamente, para fazer a camada de micropoços.
- Coloque a bolacha PR revestido numa placa de aquecimento a 65 ° C durante 4 minutos e a 95 ° C durante 8 minutos (para 27 uM camada de captura de poços profundos); e a 65 ° C durante 40 min e a 95 ° C durante 110 minutos (para 300 uM camada cultura poços profundos).
- Após arrefecimento, colocar a pastilha de silício revestido PR no alinhador máscara equipado com luz UV.
- Expor a bolacha de silício revestido de PR para a luz UV (365 nm) a uma dose de 250 mJ / cm 2 (27 uM para padrão de espessura) e 700 mJ / cm 2 (por 300 um de espessura padrão).
- Coza as bolachas a 95 ° C durante 5 min (27 uM padrão de espessura) e 30 min (300 um de espessura padrão), respectivamente.
- Lavar o PR não reticulado pela PGMEA durante 6 minutos (27 uM padrão de espessura) e 25 min (300 um de espessura padrão), respectivamente, e em seguida secá-los com azoto gasoso.
- Medir a altura do padrão apresenta emo wafer com uma profilometer de varredura a laser, colocando a bolacha sobre o xy-estágio de um profilometer de varredura a laser.
- Ajuste o plano focal para mostrar claramente o padrão apresenta na bolacha usando o modo de observação "visão da câmera" sob uma lente objetiva de 20X.
- Mude o modo de observação de "visão da câmera" para "visão laser", e definir as posições superior e inferior dos recursos.
- Defina o modo de medição, área, qualidade, e z-pitch até transparente (em cima), 1 linha (1.024 x 1), de alta precisão e 0,5 mm, respectivamente, e, em seguida, pressione a parte inferior start para iniciar a medição.
2. Preparação de dispositivos PDMS para isolamento de células Individual
- Antes de fundição PDMS, silanizar os moldes mestres com trichlorosilane para criar uma superfície hidrofóbica, o que torna mais fácil descolar as réplicas PDMS dos moldes mestre.
- Coloque os moldes de mestre e um barco ponderação contendo200 ul de triclorossilano num secador, e aplicar vácuo (-85 kPa) durante 15 min.
- Pare o vácuo e, em seguida, deixar os moldes mestres no exsicador para silanizar os moldes mestres à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
- Retire os moldes mestres do exsicador e coloque cada molde mestre em um 10 centímetros placa de Petri.
- Misturar uma quantidade total de polímero de PDMS kit de 17,6 g contendo uma base e um agente de cura a uma razão de 10: 1, e em seguida, despejar o PDMS no molde mestre na placa de Petri.
- Colocar a placa de Petri num exsicador e aplicar vácuo (-85 kPa) durante 1 h para remover as bolhas de ar nas PDMS.
- Remova a placa de Petri do exsicador e colocá-lo num forno convencional a 65 ° C durante 3-6 horas para curar o PDMS.
- Retirar as réplicas PDMS curado a partir dos moldes mestres e dois furos como uma entrada e uma saída nas duas extremidades do microcanal no array PDMS réplica captura poços por um perfurador com diâmetro interior de 0.75 mm para o canal de fluidos (Figura 2A).
- Use fita para limpar a superfície das réplicas de PDMS, e, em seguida, colocar o PDMS réplicas em um produto de limpeza de plasma por tratamento com plasma de oxigénio breve (100 watts durante 14 seg).
- Remover o PDMS réplicas da máquina de plasma de oxigénio.
- Alinhar uma réplica superior (contendo os micropoços de captura) e um PDMS inferior (contendo os micropoços de cultura) com a mão sob um microscópio estereoscópico e trazê-los em contato.
- Coloque as réplicas PDMS alinhados num forno a 65 ° C durante 24 horas para conseguir a ligação permanente entre as réplicas PDMS para formar o dispositivo final.
- Embeber o dispositivo PDMS em uma desionizada (DI) -água recipiente cheio e colocar o recipiente em um exsicador sob vácuo (-85 kPa) durante 15 min para remover o ar a partir do microcanal do dispositivo de PDMS.
- Coloque o dispositivo PDMS cheio de água desionizada em um capuz de cultura de tecidos e utilizam a luz UV (comprimento de onda da luz: 254 nm) para esterilizar o dispositivo para 30 min.
- Substituir a água Dl no dispositivo de PDMS com uma albumina de soro bovino a 5% (BSA) em solução de PBS 1x e incubar a 37 ° C durante 30 min para evitar que as células se colem à superfície do PDMS.
Nota: O revestimento de BSA é crítica para melhorar a eficiência da transferência de células isoladas a partir de captura de poços para cultura poços. - Substituir a solução de BSA a 5% no dispositivo de PDMS com solução 1x PBS esterilizado.
3. Preparação da suspensão de uma única célula
- Cultura Neural stem KT98 célula, e A549 de células de carcinoma humano e MDA-MB-435 que, em uma placa de Petri em incubadora de cultura de célula convencional (37 ° C, 5% de CO 2, e 95% de humidade) para preparar as células para a experiência celular dispositivo PDMS .
- Remover e descartar o meio de cultura gasto (meio basal DMEM fornecido com antibióticos 10% de soro fetal bovino e 1%) a partir do prato de cultura com células crescidas a 70-80% de confluência.
- Lavar cuidadosamente as células com esterilizados PBS três vezes. </ Li>
- Retirar e descartar o PBS e adicionar 2 ml de uma mistura de enzima recombinante com proteolíticas, e atividades DNase colagenolíticas (por favor consulte a lista de materiais para informações detalhadas).
- Incubar a placa de cultura à temperatura ambiente durante 5 min, e depois toque no prato de cultura para facilitar a separação celular.
- Adicione 4 ml de PBS esterilizado para dispersar as células, e em seguida, transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml.
- Centrifuga-se o tubo a 300 xg durante 3 min e remover o sobrenadante.
- Suavemente ressuspender o sedimento celular em 1 ml de PBS esterilizado e contar o número de células vivas utilizando o método de exclusão com Trypan Blue padrão 13.
Nota: Esta etapa de ressuspensão é crítica para a preparação de suspensão de uma única célula bem dissociado para melhorar a eficiência de isolamento de uma única célula.
4. Isolamento de célula única e Cultura Clonal
- Carga de 50 ul de suspensão celular a uma concentração de 2,2-2,5 x 10
- Carregar mais 50 ul de suspensão de células através do orifício de entrada para preencher uniformemente-se todo o microcanal com células.
- Fecha-se o orifício de saída com uma ficha (A, 1 mm de diâmetro cortado em nylon linha de pesca 3 milímetros de comprimento) para evitar o escoamento induzido pela pressão hidrostática das gotas em orifícios de entrada e de saída.
Nota: Os tampões foram esterilizados UV dentro de um capuz de cultura de tecidos antes da utilização. - Encha uma seringa estéril 1 ml com meio de cultura, retire as bolhas de ar, e configurá-lo em uma bomba de seringa.
- Ligar a forma carregada seringa para o orifício de entrada do dispositivo de PDMS através de uma agulha G 23 sem corte e uma tubagem de poli-tetrafluoroethene (PTFE).
- Retire a ficha da furo de saída e todosow um intervalo de tempo de 2 min para permitir que as células a instalar-se nos unicelulares captura de poços por força gravitacional.
- Lavar as células não confinadas com 300 ul de meio de cultura a uma taxa de fluxo de 600 mL / min impulsionado pela bomba de seringa.
- Espera durante 2 min para estabilizar o aparelho, e vedar os orifícios de entrada e de saída com fichas de modo a formar um sistema de cultura fechada.
- Virar o dispositivo com a mão para transferir as células individuais capturados para os micropoços de cultura.
- Coloque o dispositivo PDMS em uma placa de cultura de tecido de 100-mm, e adicionar 10 ml de PBS esterilizado em torno do dispositivo de cultura para evitar a evaporação do meio do microcanal.
- Mover o prato de cultura para uma incubadora convencional de cultura de células (37 ° C, 5% de CO 2, e 95% de humidade) para a cultura clonal das células individuais.
5. Meio de Cultura Reposição
- Depois de 1 d de cultura, substituir o meio de cultura no dispositivo de PDMS com meio fresco para melhorar PR célulaoliferation.
- Colocar duas gotas de meio de cultura na parte superior do dispositivo de PDMS perto das áreas de entrada e saída de buracos para evitar a introdução de bolhas de ar para dentro do microcanal, enquanto executa o passo seguinte.
- Perfurar dois buracos da parte superior do dispositivo de PDMS perto das duas extremidades do microcanal como uma entrada e uma saída para o microcanal.
Nota: Não perfurar toda a duas camadas do dispositivo PDMS; em vez disso, apenas perfurar através da camada superior do PDMS. - Conecte uma seringa de plástico de 1 ml contendo meio fresco para a entrada através de um G agulha romba 23 e tubos de PTFE.
- Fluxo médio de 120 ul fresco para dentro do dispositivo durante 5 minutos para substituir o meio velho.
- Inserir dois tampões para selar a entrada e a saída de furos, e devolver o dispositivo para a incubadora de cultura de células.
- Refrescar o meio de cultura a cada 2 d durante o período de cultura, removendo os tampões de vedação, seguido pela repetição dos passos 5,4-5,5.
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Representative Results
A plataforma de microfluidos para o isolamento de uma única célula e de cultura compreende um micro-canal (200 um de altura) com dois conjuntos de matrizes de micropoços (Figura 2A). Os dois conjuntos de matrizes de micropoços são denominados como captura de poços (25 um de diâmetro e 27 uM em profundidade) e cultura poços (285 um de diâmetro e 300 mm de profundidade) para o isolamento de uma única célula e a cultura, respectivamente, e cada captura-se bem posicionada no centro de uma cultura de bem quando visto a partir do topo visualização (Figura 2B). Para o funcionamento do dispositivo (o fluxo de operação esquemático é ilustrado na Figura 1), o equipamento necessário (bomba de seringa, incubadora de cultura de tecidos, e microscópios) e fontes (seringa, pipeta, e tubagem) estão geralmente disponíveis em laboratórios biológicos. Além disso, a portabilidade e a transparência da plataforma permitiu que as células possam ser facilmente observadas e analisadas num dispositivo com uma convenmicroscópio cional durante a experiência de cultura de células.
A eficiência de captura de células nos poços de captura e após os intervalos de passo de lavagem a partir de 67,80 ± 11,38% para 85,16 ± 1,91% (dependendo do tipo de célula) (Figura 3A). Além disso, a maioria dos poços de captura-conter apenas uma única célula para todos os três tipos de células (89,89% - 92,98%), o qual foi confirmado pela análise do número de células carregadas nos poços de cultura (Figura 3B). O isolamento final, a eficiência de uma única célula em cultura os poços era mais do que 76% de KT98 e células MDA-MB-435, mas apenas 61% para as células A549, devido a diferenças do tamanho celular entre os tipos de células testadas.
Para investigação do cancro, ensaio clonogénico de células individuais podem ser utilizados para testar a resistência à droga e as taxas de proliferação de células de colónias individuais. A cultura de células e ensaio clonogénico das células individuais isoladas no nosso platform foram conduzidas por refrescar o meio de cultura a cada 2 d. Esta demonstração destaca a aplicabilidade do presente dispositivo para estudar a heterogeneidade celular no nível de uma única célula, medindo as diferenças em taxas de sobrevivência de células e proliferação de células individuais.
A taxa de heterogeneidade e proliferação celular das células isoladas foram analisados a partir de imagens diária-adquiridos. Os resultados mostraram que as células individuais isoladas podem ser cultivadas durante 7 d e apresentaram diferentes padrões de crescimento. Por exemplo, 13% das células isoladas não tinha a divisão celular e manteve-se como uma única célula (Figura 4B), enquanto que 17,5% das células dividido em mais do que 15 células e colónias de células formadas (Figura 4A) durante a cultura. heterogeneidade celular entre as células que proliferam, também foi evidenciado pelos diferentes padrões de crescimento de formação de duas células (4,3%), três células (2,5%), e 4 - 14 células(15%) no ensaio de cultura celular (Figura 4C).
Estes resultados indicaram que a plataforma pode ser utilizada para a cultura de longo prazo de células, ensaios clonogénicos, e estudos de heterogeneidade celular. Tendo um grande número de colónias de células individuais crescidas em uma pequena área de pegada também torna a análise microscópica das células mais fácil.
. Figura 1. Ilustração esquemática do fluxo de operação para o isolamento de uma única célula de alto rendimento e cultura na plataforma microfluídica O procedimento de operação para o isolamento de uma única célula e cultura clonal inclui 4 etapas: i) células de carga para o microcanais por uma ponta de plástico e pipeta manual; ii) lavar as células não confinadas com meio de cultura fresco conduzido por uma bomba de seringa; iii) após a selagem das aberturas de entrada e de saída com tampões, o écélulas olated foram transferidos de captura de poços para a cultura poços lançando o dispositivo; e iv) realizar cultura clonal (ensaio clonogênica) em cultura de poços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Fotografia e imagens de MEV da plataforma isolamento de uma única célula e cultura microfluídico. (A) plataforma microfluídica carregado com corante vermelho que mostra as estruturas de microcanais e micropoços para a cultura de uma única célula. (B) uma imagem representativa feita a partir de um dispositivo de corte, que mostra a vista lateral de três unidades de isolamento e cultura clonal de célula única na plataforma de microfluidos. Barra de escala: 100? m. MEV da cultura de uma única célula (C) e captura de (D Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. KT98, A549, e MDA-MB-435 a eficiência de isolamento de uma única célula na plataforma de microfluidos. (A) Eficiência de KT98, A549, e células MDA-MB 435-capturado em poços de captura e após lavagem para retirar as células não confinadas . A eficiência de captura de células era de 67,80% para 85,16% nos três tipos de células. (B) A proporção de uma única célula em cultura total de poços (barra de barra) foi mais do que 76% de KT98 e MDA-MB-435, mas 61,63% para A549. (C) uma imagem representativa de células individuais KT98 indivíduo(Vermelho, corado com rastreador celular) isolado em grandes cultura poços para a cultura clonal. Barra de escala: 300? m. (D) O número de células em células ocupada cultura poços do modelo de célula KT98. A proporção de Cultura-poços foi de 77,3% com uma única célula, 16,31%, sem células, com 5,96%, duas células e 0,43%, com mais do que três células. As barras de erro são representados como ± SD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A cultura celular, ensaio clonogênica e estudo heterogeneidade celular de células A549 isoladas na plataforma microfluídica para 7 d. (A) Uma única célula isolada cresceram e proliferaram a uma colônia de células em cultura de poços. (B) Um único isolado de células sobreviveram, mas não se dividem, após 7 dda cultura. Barra de escala: 100? m. (C) As células individuais isoladas exibiram padrões de crescimento heterogéneos depois de ter sido cultivadas durante 7 d. As barras de erro são representados como ± SD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Sistemas de dispositivo baseado em micropoços 6,14 têm sido utilizados para a manipulação de uma única célula e análise, tal como uma única célula em larga escala prendendo 6 e proliferação de células-tronco hematopoiéticas único 15. Embora o tamanho bem, número e forma podem ser ajustados a aplicações específicas, a eficiência de isolamento de uma única célula está sempre comprometida quando o tamanho do poço é aumentada. 9,15
Para superar esta limitação, Park et ai. Relataram um chip de microfluidos com micropoços triangulares que tenham um elevado unicelular prendendo taxa (58,34%), enquanto que o tamanho de micropoços é alargada para permitir a propagação de células e o crescimento. No entanto, os micropoços (com o comprimento de um lado ~ 50 pM) só poderia suportar a proliferação celular por até 2 d. 16 A nossa estratégia dupla bem permite o carregamento de uma única célula em grandes micropoços não deve ser limitada pela probabilidade da de Poisson distribuição encontrada em limitar Dilue métodos de sistemas de poços abertos 3, tal como demonstradas pelo fornecimento de alta eficiência de isolamento de uma única célula (mais do que 75%) em grandes micropoços cujo tamanho era suficiente para a proliferação de células durante pelo menos 7 d (Figura 4A). Devido à sua capacidade de realizar de forma altamente eficiente isolamento de uma única célula e cultura clonal com um dispositivo simples e procedimento de operação, prevemos que a nossa plataforma microfluídica poderia constituir uma ferramenta útil para uma ampla gama de aplicações, incluindo a selecção de células-tronco do câncer por ensaio clonogênica 17 e cardiotoxicidade rastreio de alto rendimento de fármacos 18,19.
Uma das principais limitações da nossa isolamento e cultura plataforma de uma única célula é que ele não forma cultura individualmente nos poços fechados para evitar a interferência entre as células cultivadas em cultura poços. Portanto, o comportamento das células pode ser afectada pela secreção parácrina de outras células individuais isoladas no dispositivo de microfluidos. o otela limitação da nossa plataforma é a necessidade de preparar relativamente suspensão de células de alta densidade para alta eficiência de isolamento de uma única célula. Este consumo celular de alta pode limitar as aplicações de isolamento de células raras e cultura, tais como células de humor aquoso.
Antes da operação do dispositivo, é importante para injectar água Dl a partir do orifício de entrada para encher o microcanal e cuidadosamente observar qualquer fuga de fluido a partir do dispositivo de PDMS ligado. vazamento de fluido afeta a condição de fluxo no microcanal, assim, podem afetar adversamente a captura celular e resultado da transferência. Além disso, embora os nossos resultados do estudo de uma única célula de eficiência de carregamento mostrar perda de células muito baixo após a transferência das células isoladas da captura de poços para a cultura poços, indicando que a maioria das células poderia ser efetivamente transferido por lançando o dispositivo, a eficiência de transferência é reduzida se o passo de bloqueio BSA (2,12) não é executada corretamente. Os usuários podem modificar o protocolo BSA bloqueio ou usar almétodos ternativa de modificação de superfície para as suas necessidades experimentais de células específicas (por exemplo, aumentando a BSA concentração ou revestimento momento em que um tipo de célula mais aderente é usado). As dimensões da captura de células-poços são os factores dominantes, as quais necessitam de ser optimizada para a melhor eficiência de carga de uma única célula em poços de captura e, dependendo do tamanho do tipo celular específico de interesse. Elevadas múltiplas células-em-um-de captura poços eventos são devido a ter o tamanho de captura bem demasiado grande para o tipo celular de interesse, enquanto a baixa eficiência de carregamento de células no poço de captura é uma indicação do tamanho da captura de bem-estar muito pequeno. É também importante minimizar a agrupamentos de células em suspensão de célula única preparados, como aglomerados de células pode diminuir a eficiência de carregamento de uma única célula na captura-poços.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
